細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)號(hào) 姓名 學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 專(zhuān)業(yè)、班級(jí) 實(shí)驗(yàn)課程名稱(chēng) 細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 教師及職稱(chēng) 開(kāi)課學(xué)期 至 學(xué)年 學(xué)期 填報(bào)時(shí)間 年 月 日云南師范大學(xué)教務(wù)處編印實(shí)驗(yàn)序號(hào)五實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)人類(lèi)淋巴細(xì)胞株培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間10.28 11.25實(shí)驗(yàn)室生物綜合實(shí)驗(yàn)室2一實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)1實(shí)驗(yàn)?zāi)康?一) 細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗、消毒、滅菌）能獨(dú)立地進(jìn)行用于細(xì)胞培養(yǎng)的個(gè)中器皿的清洗與消毒，掌握干熱滅菌法、濕熱滅菌法和濾過(guò)除菌法的操作，了解化學(xué)消毒法的使用方法。(二) 培養(yǎng)基的配制熟練掌握RPMI 1640培養(yǎng)基的配制方法。(三) 細(xì)胞傳代培養(yǎng)1. 熟練掌握細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作方法。2. 觀察外培細(xì)胞在不同時(shí)期的

2、形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況。(四) 死活細(xì)胞的鑒別掌握死活細(xì)胞的鑒別原理及方法。2實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)流程或裝置示意圖(一) 細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗、消毒、滅菌）1. 清洗與消毒是組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的第一步，是組織培養(yǎng)中工作量最大，也是最基本的步驟。2. 體外培養(yǎng)細(xì)胞所使用的各種玻璃或塑料器皿對(duì)清潔和無(wú)菌操作的要求程度很高。細(xì)胞培養(yǎng)不好與清洗不徹底有很大關(guān)系。3. 滅菌手段的選擇也十分重要，對(duì)不同的物品需采用不同的滅菌方法。假如選用的方法不對(duì)，即使達(dá)到了無(wú)菌卻使被滅菌藥品喪失了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生物學(xué)特性或其他使用價(jià)值也不行。(二) 培養(yǎng)基的配制1. 細(xì)胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基一般是由合成培養(yǎng)基和小牛血清配制而成。合成培養(yǎng)基有

3、商品出售，它是根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的需要按一定配方制成的粉狀物質(zhì)。其主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子和其他輔助物質(zhì)。它的酸堿度和滲透壓與活體內(nèi)細(xì)胞外液相似。2. 小牛血清含有一定的營(yíng)養(yǎng)成分，更重要的是它含有細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的生長(zhǎng)因子；酶、微量元素和激素；保護(hù)作用；提供伸展和貼附因子等，是合成培養(yǎng)基所無(wú)法替代的。此外它還能中和有毒物質(zhì)（重金屬、抗菌素）的毒性。3. 氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類(lèi)的細(xì)胞對(duì)氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)基提供，這幾種氨基酸稱(chēng)為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。

4、因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。(三) 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要做在培養(yǎng)。一般將傳代培養(yǎng)的累計(jì)次數(shù)作為細(xì)胞代數(shù)。懸浮型細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)于淋巴細(xì)胞、白血病細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞和腹水型惡性細(xì)胞等的培養(yǎng)。由于這類(lèi)細(xì)胞或細(xì)胞集體可懸浮在液體培養(yǎng)基中，而不附著在固體表面上，因此無(wú)論原代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)的細(xì)胞增殖過(guò)程都沒(méi)有貼附性細(xì)胞那種明顯可辨的3個(gè)變化階段，其培養(yǎng)的可見(jiàn)效果是細(xì)胞數(shù)目的增多及溶液中細(xì)胞濃度和密度的加大。懸浮型細(xì)胞傳代培養(yǎng)的最大特點(diǎn)是原代細(xì)胞不必經(jīng)過(guò)機(jī)械分離或消化酶消化

5、處理，傳代時(shí)只須把培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞做適度稀釋或把培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)簡(jiǎn)單的離心處理后再加入適量的培養(yǎng)液即可培養(yǎng)。因此，細(xì)胞在從原代到傳代的轉(zhuǎn)變過(guò)程中遭受的機(jī)械損傷和化學(xué)損傷的可能性較少，損傷程度也較輕，相對(duì)而言，傳代的成功率較高。(四) 死活細(xì)胞的鑒別細(xì)胞的存活率是反映細(xì)胞群體生活狀態(tài)的重要指標(biāo)。多種方法可以鑒別細(xì)胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。原理：許多酸性物質(zhì)不容易穿過(guò)活細(xì)胞的質(zhì)膜進(jìn)入胞內(nèi)，卻能滲入死亡的細(xì)胞內(nèi)，使其著色，以次來(lái)區(qū)別死活細(xì)胞。3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料(一) 細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗、消毒、滅菌）（1）儀器超凈工作臺(tái)、干燥箱、高壓鍋、過(guò)濾器（2）材料微孔濾膜（直徑25mm）：孔徑為0.22

6、um(3）試劑75%酒精、重鉻酸鉀、濃硫酸、NaOH、 HCl等(二) 培養(yǎng)基的配制（1）儀器超凈工作臺(tái) 高壓滅菌鍋 多重蒸餾水器 磁力攪拌器 天平微量加樣器（2）材料細(xì)胞培養(yǎng)瓶 量筒、研缽、燒杯、漏斗、濾紙 pH試紙微孔過(guò)濾器（0.22m）及注射器 各種規(guī)格的Tip 、離心管(3）試劑NaOH、 酚紅 RPMI 1640干粉 小牛血清、青霉素、鏈霉素NaHCO3 、L-谷氨酰胺 三蒸水(三) 細(xì)胞傳代培養(yǎng)（1）儀器超凈工作臺(tái) 微量加樣器（移液槍?zhuān)?倒置顯微鏡 光學(xué)顯微鏡高壓滅菌鍋 蒸餾水器 超低溫冰箱 二氧化碳培養(yǎng)箱（2）材料細(xì)胞培養(yǎng)瓶 血球計(jì)數(shù)板 滴管 培養(yǎng)細(xì)胞(3）試劑臺(tái)盼藍(lán)（染料）乙醇

7、(四) 死活細(xì)胞的鑒別（1）儀器人類(lèi)淋巴細(xì)胞株（2）材料0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液(3）試劑顯微鏡 血球計(jì)數(shù)板4實(shí)驗(yàn)方法步驟及注意事項(xiàng)一 細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備工作（清洗、消毒、滅菌）（一）清洗1.新玻璃器皿的清洗 先用自來(lái)水刷洗，再浸泡5%稀鹽酸中和玻璃表面的堿性物質(zhì)和有害物質(zhì)。2.使用過(guò)的玻璃器皿的清洗（1）立即進(jìn)入清水，避免干涸難洗；（2）用洗滌劑清洗玻璃器皿，自來(lái)水清洗數(shù)遍，倒置自然干燥；（3）浸酸性洗液過(guò)夜；（4）從洗液撈出自來(lái)水沖洗1015次去除酸性洗液，蒸餾水刷洗10次，倒置烘干；（5）包裝（牛皮紙或不透水紙）；（6）高壓（15磅20min)或干熱（160度2h)滅菌；（7）備用。（二）膠塞處理（

8、1）新膠塞應(yīng)先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸1020min。（2）自來(lái)水清洗10次（3）用1%稀鹽酸浸泡30min。（4）自來(lái)水清洗10次，蒸餾水刷洗10次。晾干（5）舊膠塞不必用酸堿處理可直接用洗滌劑煮沸清洗數(shù)次，過(guò)蒸餾水，晾干，包裝高壓滅菌，可使用。（三）塑料制品的清洗（1）用洗滌劑清洗，自來(lái)水沖洗數(shù)遍（2）強(qiáng)（次強(qiáng)）酸洗液浸泡26h.（3）自來(lái)水沖洗10次以上，蒸餾水刷洗10次（4）浸泡在70%乙醇0.51h,備用。（5）用前從乙醇中取出，在超級(jí)工作臺(tái)內(nèi)紫外線(xiàn)照射1h。（四）洗液的配制（1）將重鉻酸鉀6.3g放入大燒杯中，加入蒸餾水20ml放在石棉網(wǎng)上加熱至沸騰并攪拌，使重鉻酸鉀

9、充分溶解。（2）將重鉻酸鉀倒入酸缸中，然后緩慢加入濃硫酸100ml并用一長(zhǎng)玻璃棒不斷攪拌，充分溶解。注意事項(xiàng)：操作時(shí)注意安全，穿戴好耐酸手套和圍裙，防止洗液飛濺到衣物皮膚上，不慎飛濺到皮膚應(yīng)立即用大量清水沖洗。二培養(yǎng)基的配制（1）合成培養(yǎng)基的配制1. 1%酚紅：配制 0.1 mol/L NaOH 100ml。稱(chēng)量 1g 酚紅于研缽中，取 30 ml 0.1 mol/L NaOH逐漸加入研缽中，盡量研細(xì)，然后過(guò)濾。過(guò)濾后的酚紅液加三蒸水至 100 ml。4保存。2. 飽和NaHCO3的配制：稱(chēng)取 10g 的 NaHCO3 溶于 200 ml 三蒸水中，滅菌后分裝于50 ml 試劑瓶。4保存。3R

10、PMI 1640 培養(yǎng)液配制：配制50ml RPMI 1640培養(yǎng)液：每組稱(chēng)取 RPMI 1640干粉 0.52g，溶于50 ml 的三蒸水。置于攪拌器上攪拌 20 min，直到液體變?yōu)槌吻鍨橹埂?. RPMI 1640 合成培養(yǎng)基配制：加入 0.1ml 1%的酚紅，通入CO2，使液體變?yōu)榻瘘S色，說(shuō)明培養(yǎng)基完全溶好。配制好的培養(yǎng)基，用時(shí)用飽和 NaHCO3液調(diào)節(jié) pH 至 6.8-7.0。溶好以后的培養(yǎng)液在超凈臺(tái)中進(jìn)行0.22m濾過(guò)除菌，分裝至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。瓶口封好，-20或4 貯存。（2）小牛血清的處理新買(mǎi)的新生小牛血清一定要滅活。將買(mǎi)來(lái)的新生小牛血清不開(kāi)封置于水浴鍋中56，30min，期間

11、要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。處理后的血清貯存于4。（3）生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制1雙抗： （100000U/ml）160萬(wàn)單位青霉素/瓶+8ml 3DW = 20萬(wàn)單位/ml1g鏈霉素+5ml 3DW = 200000 g /ml各取以上的液體5ml混合，使其濃度為10萬(wàn)單位/ml，0.22m 過(guò)濾至1.5ml離心管，-20貯存。2谷氨酰胺儲(chǔ)備液（200mmol/L）： 1.5g的谷氨酰胺溶于50ml三蒸水中（30 mg/ml= 200 mmol/L),0.22m過(guò)濾至1.5ml離心管中。-20貯存。3. RPMI 1640生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制50毫升儲(chǔ)備液濃度終濃度RPMI 1640培養(yǎng)液

12、 44.5谷氨酰胺0.530mg/ml0.3mg/ml雙抗0.05100000u/ml100u/ml小牛血清510%三 細(xì)胞傳代培養(yǎng)選取擬作傳代培養(yǎng)的樣本，取0.5mL細(xì)胞懸浮液加入等量臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞的成活率。如果樣本成活率高，無(wú)污染即可用于傳代。用彎頭吸管將原代培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞吹打均勻，注意將那些半貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞吹打脫離以免在移換容器時(shí)丟失。把細(xì)胞懸液吸入無(wú)菌離心管中，塞緊反口橡皮塞以防止空氣污染，用1000r/min離心5min。吸去上清夜，加入適量的培養(yǎng)液，用吸管打勻制成細(xì)胞懸液。重復(fù)步驟1，計(jì)算細(xì)胞數(shù)，加入適量培養(yǎng)液把最終細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)至1×1053

13、5;105個(gè)/mL。把細(xì)胞懸浮分裝至新備的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。操作：每小組先用一個(gè)培養(yǎng)瓶配制50ml的生長(zhǎng)培養(yǎng)基每人取10ml培養(yǎng)基到自己的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)然后向細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種400ul的人淋巴細(xì)胞株原液放入二氧化碳培養(yǎng)箱，旋松瓶蓋根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量看細(xì)胞瓶是否平放或直立放置觀察倒置顯微鏡的使用方法利用課余時(shí)間和下次實(shí)驗(yàn)課時(shí)間用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。四死活細(xì)胞的鑒別取20ul細(xì)胞懸液放入干凈的離心管中，加入等體積的0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液混合，放置1min。取一干凈的血球計(jì)數(shù)板，蓋上蓋片，從蓋片兩邊滴入細(xì)胞懸液使之充滿(mǎn)計(jì)數(shù)板和蓋片之間。注意滴液勿有氣泡，也不能太多，否則會(huì)使蓋片

14、浮起而是細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)。低倍鏡下觀察，活細(xì)胞不著色，臺(tái)盼藍(lán)著色的細(xì)胞呈深藍(lán)色，是不健康或已死亡的細(xì)胞，不能計(jì)數(shù)。找出計(jì)數(shù)板上的方格，計(jì)算四角大格內(nèi)總的細(xì)胞數(shù)，壓著大格線(xiàn)者只計(jì)左側(cè)或上方，不計(jì)右側(cè)或下方。注意事項(xiàng)1接種的血樣愈新鮮愈好，最好是在采血后24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，如果不能立刻培養(yǎng)，應(yīng)置于4存放，避免保存時(shí)間過(guò)久，會(huì)影響細(xì)胞的活力。2在培養(yǎng)中成敗的關(guān)鍵，除了至為重要的PHA的效價(jià)外，培養(yǎng)的溫度和培養(yǎng)液的酸堿度也十分重要。人的外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)最適溫度為37±0.5。培養(yǎng)液的最適pH7.27.4。3培養(yǎng)過(guò)程中，如發(fā)現(xiàn)血樣凝集，可將培養(yǎng)瓶輕輕振蕩，使凝塊散開(kāi)，繼續(xù)放回37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。4

15、 制片過(guò)程中，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膨脹得不大，細(xì)胞膜沒(méi)有破裂，染色體聚集一團(tuán)伸展不開(kāi)，可將固定時(shí)間延長(zhǎng)數(shù)小時(shí)或過(guò)夜5.參考文獻(xiàn)1吳昆, 拜合提亞·阿扎提, 王文光, 安尼瓦爾·牙生, 王玉杰. 小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞培養(yǎng)鑒定和誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖J. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2011, (08)2 李靜, 郭文文, 羅彬, 陳芳, 王煒煒, 肖紹文, 謝小薰. OY-TES-1誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖活化作用J. 免疫學(xué)雜志, 2011, (07) 3 史嘉林,楊棟. 細(xì)胞培養(yǎng)及避免細(xì)胞污染的方法J. 養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn), 2010, (07) .4 朱慶虎,陳弘,秦紅麗

16、,劉蘭剛,康二勇. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的主要操作模式J. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2010, (10) .5 姚飛. 常用的細(xì)胞培養(yǎng)方法、污染及污染處理J. 科技信息, 2009, (07) .6 周麗薇. 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與防止細(xì)胞污染的方法J. 醫(yī)學(xué)信息(上旬刊), 2010, (11) .7 王洪躍,戴曉云. 現(xiàn)代動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器概述J. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, (02) .二實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果第一大格第二大格第三大格第四大格活細(xì)胞A4324B28610平均35.547死細(xì)胞A0113B1133平均0.5123計(jì)算：每毫升原液細(xì)胞數(shù) = 4大格細(xì)胞總數(shù)/4 × 10000 × 稀釋倍數(shù)細(xì)胞存活率（%）=（細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞數(shù)）/ 細(xì)胞總數(shù)每毫升原液細(xì)胞數(shù)=4大格細(xì)胞總數(shù)（A、B平均）/4 × 10000 × 稀釋倍數(shù)=（3+5.5+4+7+0.5+1+2+3）/4×10000=65000細(xì)胞存活率（%）=（3+5.5+4+7）/（3+5.5+4+7+0.5+1+2+3） =75% 2對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析及其結(jié)論許多酸性物質(zhì)不容易穿過(guò)活細(xì)胞的質(zhì)膜進(jìn)入胞內(nèi)，卻能滲入死亡的細(xì)胞內(nèi)，使其著色，以次來(lái)區(qū)別死活細(xì)胞。死細(xì)胞被染成藍(lán)黑色，而活細(xì)胞是透明的，不容易觀察到。給細(xì)胞著色在細(xì)胞計(jì)數(shù)中，便于區(qū)分死活細(xì)胞。停滯期