人源化抗體發(fā)展及應(yīng)用概略

1、人源化抗體發(fā)展及應(yīng)用概略【摘要】伴隨著一系列重大生物技術(shù)（如PCR技術(shù)、抗體庫技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)等）的發(fā)展，抗體技術(shù)從最初的嵌合抗體、改型抗體逐漸發(fā)展為今天的人源化抗體。人源化抗體在治療腫瘤、自身免疫性疾病、器官移植等方面已經(jīng)顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢和良好的應(yīng)用前景。 本文介紹了人源化抗體的構(gòu)建及其表達(dá)系統(tǒng)，并對其臨床應(yīng)用進(jìn)行了展望?！娟P(guān)鍵詞】 嵌合抗體；人源化抗體；噬菌體展示技術(shù)；轉(zhuǎn)基因技術(shù)【Abstract】With the development of a series of substantial biotechnologies, such as PCR, phage display and

2、 transgenic animal, antibody techniques have developed from chimeric antibody and reshaped antibody to humanized antibody. As therapeutic antibodies, the humanized antibodies have been showed specific advantage and application prospect for cancer therapy,autoimmudisease,transplant rejection.The huma

3、nized antibody construction and expressing system, also foresaw tendency of humanized antibodies in clinical application have summarized in this paper.【key word】chimeric antibodies; humanized antibodies; phage display; trangenic technology引文：從20世紀(jì)70年代英國學(xué)者M(jìn)ilstein和德國學(xué)者Kohler利用細(xì)胞融合技術(shù)首次成功地制備出單克隆抗體以來，單克

4、隆抗體在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、免疫學(xué)等諸多學(xué)科中發(fā)揮了巨大的作用。單克隆抗體可用于分析抗原的細(xì)微結(jié)構(gòu)及檢驗(yàn)抗原抗體未知的結(jié)構(gòu)關(guān)系，還可用于分離、純化特定分子抗原，甚至用于臨床疾病的診斷和治療等。然而，單克隆抗體技術(shù)在臨床治療應(yīng)用中的進(jìn)展卻很慢，主要原因是目前單克隆抗體大多是鼠源性的，而鼠源性單克隆抗體應(yīng)用于人體治療時存在諸多問題：一是不能有效地激活人體中補(bǔ)體和Fc受體相關(guān)的效應(yīng)系統(tǒng)；二是被人體免疫系統(tǒng)所識別，產(chǎn)生人抗鼠抗體(human antigen mouse antibody,HAMA)；三是在人體循環(huán)系統(tǒng)中被很快清除掉。因此，在保持對特異性抗原表位高親和力的基礎(chǔ)上進(jìn)行人源化改造，減少異源抗體的免

5、疫原性，成為單克隆抗體研究的重點(diǎn)。正文：1.人源化抗體的建構(gòu)策略鼠抗體人源化就是通過基因改造，使其和人體內(nèi)的抗體分子具有極其相似的輪廓，從而逃避人免疫系統(tǒng)的識別，避免誘導(dǎo)HAMA反應(yīng)。對鼠源抗體進(jìn)行人源化改造時要遵守兩個原則，首先要保持抗體的親和力和特異性，其次要降低或消除抗體的免疫原性。1.1 嵌合抗體(Chimeric antibody)20世紀(jì)80年代中期開始研制的第一代人源化抗體，即簡單的嵌合抗體，是用人源基因代替鼠源單抗的恒定區(qū)。這樣構(gòu)建的嵌合抗體不僅保留了抗原抗體結(jié)合的特異性，又大大降低了鼠源單抗的免疫原性。美羅華(Rituximab)作為第一個用于腫瘤治療的基因工程抗體，就是由鼠

6、可變區(qū)和人恒定區(qū)組成的嵌合抗體。但由于嵌合抗體可變區(qū)(V)約占整個抗體的30，鼠源性抗體V區(qū)中的框架區(qū)(FR)仍殘留一定的免疫原性，可誘發(fā)HAMA反應(yīng)。靈長目源抗體也是一類嵌合抗體，通過免疫短尾猿猴產(chǎn)生。由于短尾猿猴抗體的可變區(qū)幾乎與人可變區(qū)無差異，這類嵌合抗體不需要作任何改變，而不致發(fā)生抗體反應(yīng)。Fab和F(ab)，嵌合抗體的制備原理是將功能性抗體輕、重鏈可變區(qū)基因分別與人抗體的K鏈和重鏈CHl恒定區(qū)基因進(jìn)行重組，克隆到表達(dá)載體中，構(gòu)建成鼠一人嵌合的Fab基因表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞表達(dá)。天然抗體分子重鏈CHl和CH2之間的一段鉸鏈區(qū)結(jié)構(gòu)，其中的2個Cys殘基可以生成二硫鍵，將2條重鏈緊密地

7、共價結(jié)合在一起。在Fab的C-端額外連接一個Cys殘基組成Fab，其表達(dá)產(chǎn)物中有痕量蛋白，是以二聚體F(ab)2的形式出現(xiàn)的。1.2 CDR移植抗體(CDR grafted antibody) 為了減少鼠源成分，出現(xiàn)了CDR移植抗體或改型抗體(Reshaped Ab)。這是更為完全的人源化抗體，即真正意義上的抗體人源化?？贵w中除了3個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)是鼠源的外，其余全部是人源結(jié)構(gòu)。如國家I類癌癥治療新藥“泰欣生”，即“泰欣生重組人源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體”，采用了先進(jìn)的“CDR移植”技術(shù)，人源化程度達(dá)到95以上，具有更高的安全性和更低的毒性。1.3 SDR移植抗體(SDR gra

8、fted antibody)CDR移植抗體同嵌合抗體比較，雖然大大減少了鼠源成分，但有時異基因的CDR人源化抗體可能引起抗個體基因型反應(yīng)。特定決定區(qū)(SDR)轉(zhuǎn)移抗體是將異源抗體中與抗原結(jié)合密切相關(guān)的SDR等少數(shù)殘基移植到人抗體相應(yīng)位置上，進(jìn)一步降低了的異源性。通過這種方法，使人源化的抗體潛在的免疫原性降至最低。1.4 全人單克隆抗體(Fully humaneantibody)1.4.1.抗體庫篩選技術(shù)1.4.1.1噬菌體表面展示技術(shù)(Phage display technology) 隨著抗體工程的發(fā)展，噬菌體展示技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，即用PCR技術(shù)從生物體內(nèi)擴(kuò)增出整套編碼人抗體的基因序列，克隆到噬

9、菌體載體上，并以融合蛋白的形式表達(dá)到噬菌體表面，從而可以方便地利用抗原一抗體特異性結(jié)合進(jìn)行篩選、擴(kuò)增。此項(xiàng)技術(shù)不僅可以獲得具有人體性質(zhì)的單抗，而且利用抗原直接從庫中篩選出所需基因，不需要細(xì)胞融合，甚至不經(jīng)過免疫動物，實(shí)驗(yàn)周期短，過程較簡單，這是人源抗體制備技術(shù)的重大突破。1.4.1.2核糖體展示技術(shù)(Ribosome display teclmology)該技術(shù)將基因型和表型聯(lián)系在一起，編碼蛋白的DNA在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄與翻譯，由于對DNA進(jìn)行了特殊的加工與修飾，如去掉3'末端終止密碼子。核糖體翻譯到mRNA末端時，由于缺乏終止密碼子，停留在mRNA的3'末端不脫離，從而形成蛋白質(zhì)

10、-核糖-2mRNA三聚體，將目標(biāo)蛋白特異性的配基固相化，然后進(jìn)行篩選，對篩選分離得到的復(fù)合物進(jìn)行分解，釋放出的mRNA進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物進(jìn)入下一輪循環(huán)，多次循環(huán)后可使目標(biāo)蛋白及其編碼的基因序列得到富集和分離。利用此技術(shù)可以獲得特異性的、高親和力的抗體.142 轉(zhuǎn)基因小鼠(Transgenetic mouse) 在轉(zhuǎn)基因動物方面，有幾種不同的途徑生產(chǎn)人抗體，其中一種方法是將已產(chǎn)生一定免疫反應(yīng)的供者或癌癥患者的淋巴細(xì)胞導(dǎo)入嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(SCID)或Trimem小鼠，取鼠脾細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞雜交就可能獲得分泌人抗體的雜交瘤。另一條生產(chǎn)人抗體的途徑是通過基因敲除技術(shù)，使小鼠自身的基因

11、失活，并導(dǎo)入新基因，創(chuàng)造出攜帶人抗體重輕鏈基因簇的轉(zhuǎn)基因小鼠。這種轉(zhuǎn)人抗體基因小鼠所攜帶的人DNA片段具有完備的功能，可以有效地進(jìn)行同種型轉(zhuǎn)換和親和力成熟。任何靶抗原均可被用來免疫該小鼠，使其產(chǎn)生高親和力的人抗體。Tomizuka等首先以染色體為載體，成功培育了轉(zhuǎn)染色體小鼠，并制備了高親和力的人抗體。日本麒麟公司用基因工程技術(shù)，使小鼠攜帶完整的人14號染色體，該染色體包含全部人抗體產(chǎn)生基因。但迄今尚無該技術(shù)生產(chǎn)的制品問世。2 人源化抗體的表達(dá)目前常用的人源化抗體表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌體系、酵母體系、昆蟲體系和哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。21 大腸桿菌表達(dá)體系：由于完整的抗體分子是由重鏈和輕鏈通過二硫

12、鍵組裝成的有生物功能的免疫球蛋白，而大腸桿菌體系缺少轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工機(jī)制，表達(dá)的蛋白質(zhì)不能形成適當(dāng)?shù)恼郫B、進(jìn)行糖基化修飾或正確形成二硫鍵等，所以不適于完整抗體分子的表達(dá)。因而更多的是用來高效表達(dá)Fv、Fab及ScFv等功能片段。22 酵母表達(dá)體系：主要包括釀酒酵母、裂殖酵母、克魯維酸酵母、甲醇酵母等表達(dá)系統(tǒng)。甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種最近迅速發(fā)展的外源基因表達(dá)系統(tǒng)，也是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達(dá)系統(tǒng)。巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)作為甲醇酵母系統(tǒng)之一，使用得最多、最廣泛，該表達(dá)系統(tǒng)具有強(qiáng)有力的基因啟動子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)；同時可對表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的加工與修飾，從而使表達(dá)的蛋白具有生物活性，此外該系統(tǒng)

13、具有快速、簡單、成本低、表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)。23 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)：昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種優(yōu)良的真核基因細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。由于昆蟲細(xì)胞來源廣，比較經(jīng)濟(jì)，而且具有正確完成蛋白質(zhì)翻譯后加工和糖基化修飾等諸多優(yōu)越性，已被廣泛應(yīng)于外源基因的表達(dá)。但該系統(tǒng)也存在不足之處，即病毒感染會引起細(xì)胞的死亡，因此大批量生產(chǎn)有一定的困難。24 哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)：該表達(dá)系統(tǒng)可以正確地進(jìn)行翻譯后修飾，遺傳穩(wěn)定，成為嵌合抗體最合適的宿主。其中常用的宿主細(xì)胞有3種：瞬時表達(dá)大多采用非洲綠猴腎(COS)細(xì)胞；穩(wěn)定表達(dá)中，骨髓瘤細(xì)胞如Sp2O主要用于單抗的高水平表達(dá)；中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞廣泛用于以臨床治療為目的的抗體表

14、達(dá)。目前應(yīng)用這些細(xì)胞已成功表達(dá)了多種人源化單抗。通過實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，利用轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺細(xì)胞也能表達(dá)完整抗體，并將抗體分泌到乳汁中。25 植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)：近年來，人們發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞中也能表達(dá)多種形式的抗體，其中包括表達(dá)重組人-鼠嵌合抗體。植物細(xì)胞中有著與動物細(xì)胞相似的蛋白質(zhì)合成、分泌、折疊及翻譯后修飾途徑，只是在蛋白質(zhì)糖基化上與動物細(xì)胞略有差異?？贵w能在植物的葉子和果實(shí)中表達(dá)，而不丟失其結(jié)合的特異性與親和力。1999年，Vaquero等報(bào)道了采用兩個獨(dú)立的植物表達(dá)載體在煙葉中瞬時表達(dá)人一鼠嵌合抗體。26 轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)系統(tǒng)：用于抗體規(guī)?；a(chǎn)時，細(xì)胞培養(yǎng)的高成本制約了其應(yīng)用。利用轉(zhuǎn)基因動物作為生物

15、反應(yīng)器來生產(chǎn)重組抗體，可以解決這一問題。利用轉(zhuǎn)基因動物制藥具有生產(chǎn)成本低、投資周期短、表達(dá)量高、與天然產(chǎn)物完全一致、分離純化容易的優(yōu)勢，尤其適合于一些使用量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜的血液因子，如人血紅蛋白、人血清白蛋白、蛋白C、纖維蛋白原和抗體等。3 人源化抗體的臨床應(yīng)用近年來，人源化抗體和人抗體的出現(xiàn)為臨床應(yīng)用帶來了新的希望，當(dāng)前正處于臨床研究的多種抗體中，嵌合抗體和人源化抗體所占比例大于70。目前的人源化抗體，主要用于腫瘤、自身免疫性疾病和心血管疾病的治療以及抗移植排斥反應(yīng)和抗病毒感染等方面。31在腫瘤治療方面的應(yīng)用單抗藥物抗腫瘤能有效地降低傳統(tǒng)腫瘤藥物治療的不良反應(yīng)。這些人源化單克隆抗體的研制主要是

16、針對那些與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的靶分子，如治療非霍奇金淋巴瘤的抗CD20的嵌合抗體Ritu)和抗CD22的人源化抗體Epratuzumab，以及針對腫瘤靶位VEGF、EGFRL、CD33等開發(fā)研制的人源化抗體。這些靶分子在正常組織或細(xì)胞中就存在一定的表達(dá)，但在許多腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，因此可作為腫瘤特異的標(biāo)志物。 還有一些人源化單抗是通過攜帶抗癌藥物如毒素、細(xì)胞毒藥物、放射性核素、酶、化療藥物等分子而發(fā)揮作用。這樣偶聯(lián)而成“生物導(dǎo)彈”，從而達(dá)到特異性殺傷癌細(xì)胞的作用。32在器官移植中的應(yīng)用：如何避免和盡可能減輕移植后發(fā)生的排斥反應(yīng)，以保護(hù)移植器官的功能，是器官移植成敗的關(guān)鍵。近年來，利用抗體藥物作

17、為實(shí)體器官移植的誘導(dǎo)治療逐漸增加。如最早批準(zhǔn)(1986年)進(jìn)入美國市場的治療性抗體類藥物抗CD3單抗即被用于腎、心臟、肝臟移植排斥的逆轉(zhuǎn)。33在自身免疫性疾病方面的應(yīng)用：在對自身免疫疾病的治療中，單抗藥物通過清除激活的細(xì)胞，阻滯其功能，或?qū)⑸叩拇傺准?xì)胞因子水平降至正常水平而抑制過度的免疫病理學(xué)反應(yīng)?，F(xiàn)有的研究表明，抗體對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、牛皮癬、多發(fā)性硬化、硬皮病、潰瘍性結(jié)腸炎等療效較好。Infliximab是由美國Johnson和Centoeor聯(lián)合開發(fā)的嵌合型抗rINFa單抗，對局限性回腸炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有很好的療效，患者對其有很好的耐受性。2007年2月，全人序列單抗藥

18、物Humira獲美國FDA批準(zhǔn)用于治療Crohn病，這是該藥的第4個免疫性疾病適應(yīng)證。Humira也是目前臨床治療Crohn病的唯一生物制劑。Humira于2002年獲準(zhǔn)上市，其適應(yīng)證是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，作用靶標(biāo)是TNFa。Crohn病是一種嚴(yán)重的慢性消化道過敏性疾病，癥狀包括腹瀉、腹痛以及發(fā)燒等，發(fā)病時全無征兆，病人十分痛苦，對于該病尚無成熟的治療方法和藥品。Humira的出現(xiàn)，為Crohn病的治療帶來了新的希望，并可由患者自己使用。討論和展望近年來，無論是學(xué)術(shù)界還是商業(yè)團(tuán)體，都對治療性抗體的研究表現(xiàn)出越來越大的興趣。人源化抗體和全人源化抗體的出現(xiàn)，為治療性抗體的廣泛應(yīng)用帶來了新的希望。但人源化抗體是否可以解決鼠抗體臨床應(yīng)用