全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選鑒定

1、生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展研究報(bào)告，（）：全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選鑒定肖艷李官成李躍輝黃建童永清張志杰（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，長(zhǎng)沙）摘要體外致敏并用轉(zhuǎn)化肝癌患者的用分別擴(kuò)增和基因并組成基因?qū)⒒蚺c載體連接后，電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建噬菌體呈現(xiàn)型庫(kù)用人肝癌細(xì)胞及人肝細(xì)胞對(duì)初級(jí)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行親和富集及篩選篩選獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行及免疫組化鑒定并測(cè)序結(jié)果表明，經(jīng)轉(zhuǎn)化的例肝癌患者，檢測(cè)均有抗肝癌抗體產(chǎn)生，經(jīng)多次，擴(kuò)增出種（、）和種（、）基因，經(jīng)連接組成種基因?qū)⒒蚺c載體連接后，導(dǎo)入大腸桿菌，得到庫(kù)容為×的初級(jí)噬菌體抗體庫(kù)，全長(zhǎng)基因的插入率為用人肝癌細(xì)胞系和人肝細(xì)胞系對(duì)抗體庫(kù)

2、進(jìn)行三輪正負(fù)淘選和富集后，從中隨機(jī)挑取個(gè)克隆進(jìn)行篩選，得到個(gè)陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性率為將個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)一步進(jìn)行其他細(xì)胞系的鑒定，發(fā)現(xiàn)克隆對(duì)肝癌細(xì)胞系、人胚腎上皮細(xì)胞系呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示與人肝細(xì)胞癌組織有特異性反應(yīng)，而不與正常肝組織反應(yīng)且的相對(duì)親和力為，解離常數(shù)為×，顯示其親和力較高對(duì)克隆進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明：全長(zhǎng)，含序列，重鏈可變區(qū)基因與人胚系有的同源性，輕鏈可變區(qū)基因與人胚系有的同源性，分別屬于由上述結(jié)果可見，應(yīng)用體外抗原致敏方法和轉(zhuǎn)化技術(shù)聯(lián)合噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，構(gòu)建了庫(kù)容量達(dá)×的全人源抗肝癌單鏈抗體庫(kù)，通過(guò)細(xì)胞和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，獲得的噬菌體抗體克隆具有較強(qiáng)的特異

3、性，為肝癌的臨床診斷及導(dǎo)向治療奠定了基礎(chǔ)關(guān)鍵詞病毒轉(zhuǎn)化，噬菌體抗體庫(kù)，肝癌，單鏈抗體學(xué)科分類號(hào)肝癌是一種惡性程度極高的腫瘤，其治療仍以手術(shù)切除為首選，但復(fù)發(fā)率極高，加上肝癌早期多無(wú)臨床癥狀，絕大部分發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬于中晚期，喪失了手術(shù)時(shí)機(jī)，化療藥物應(yīng)用于人體又會(huì)導(dǎo)致很大的副作用單克隆抗體以其特異靶向性在臨床放射免疫診斷和導(dǎo)向治療方面有較大的應(yīng)用價(jià)值，但也存在諸多缺陷，制約了其在臨床的應(yīng)用彌補(bǔ)了傳統(tǒng)單克隆抗體（）制備繁瑣、抗原性強(qiáng)、穿透力弱等不足，可望成為肝癌放射免疫診斷和導(dǎo)向治療的有力工具本研究擬解決鼠源性單抗用于導(dǎo)向治療穿透力低及易產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)等難題，采用體外致敏法和轉(zhuǎn)化技術(shù)聯(lián)合噬菌體展示技

4、術(shù)構(gòu)建全人源的抗肝癌庫(kù)，并進(jìn)一步篩選獲得高親和力的抗肝癌，為肝癌的臨床診斷及導(dǎo)向治療奠定基礎(chǔ)材料和方法材料絲狀噬菌體，、大腸肝菌菌株均由本室保存絨猴淋巴母細(xì)胞系，肝癌細(xì)胞株，鼻咽癌細(xì)胞系，大腸癌細(xì)胞系，宮頸癌細(xì)胞系，肺癌細(xì)胞系，及人類正常細(xì)胞肝細(xì)胞系，人胚腎上皮細(xì)胞系，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，原代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等湖南省衛(wèi)生廳科研基金重點(diǎn)項(xiàng)目（）通訊聯(lián)系人：，：收稿日期：，接受日期：生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展；（）均由本室保存胎牛血清（）及小牛血清（）為杭州四季青公司產(chǎn)品、谷氨酰胺、丙酮酸鈉及環(huán)孢菌素均為公司產(chǎn)品、瓊脂糖和細(xì)菌培養(yǎng)基，均購(gòu)自公司為公司產(chǎn)品合成試劑盒為公司產(chǎn)品產(chǎn)物純化試劑盒，小量質(zhì)粒抽提

5、試劑盒購(gòu)自長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司限制性內(nèi)切酶為公司產(chǎn)品，酶和連接酶為華美生物公司產(chǎn)品標(biāo)記的羊抗人購(gòu)自公司份肝癌患者（經(jīng)病理檢查確診）的外周血標(biāo)本分別采自湖南省腫瘤醫(yī)院和湘雅二醫(yī)院，術(shù)前一天采血方法和基因的擴(kuò)增與連接按文獻(xiàn)設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增人抗體基因的引物以第一鏈為模板，在酶作用下，進(jìn)行擴(kuò)增和基因并通過(guò)編碼連接肽（）使和基因連成基因回收產(chǎn)物并測(cè)定其濃度噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建從含的細(xì)菌中，用質(zhì)粒小抽提純化試劑盒提取和純化用酶分別酶切和總，進(jìn)行電泳鑒定，并用多功能純化試劑盒進(jìn)行回收純化取酶切純化后的和及的連接酶（），于作用連接產(chǎn)物用多功能純化試劑盒純化回收，溶于亞沸水中將此連接產(chǎn)物用電穿孔法轉(zhuǎn)化新鮮制備的感

6、受態(tài)細(xì)菌，電感條件為，每次轉(zhuǎn)化后用洗下細(xì)菌將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌于以搖動(dòng)，涂于含四環(huán)素的×平皿上，過(guò)夜根據(jù)長(zhǎng)出的克隆數(shù)計(jì)算庫(kù)容量并向平皿中加入含四環(huán)素的培基，刮下平皿上所有菌落，于以搖動(dòng)，再以離心取上清，用的濾膜過(guò)濾后，濾液即為噬菌體單鏈抗體庫(kù)（初級(jí)抗體庫(kù)）將初級(jí)抗體庫(kù)經(jīng)，沉淀次后，溶解于中，保存于噬菌體抗體庫(kù)的富集淘選待細(xì)胞和細(xì)胞分別在的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至基本融合時(shí)，戊二醛固定，液洗，（含）封閉棄封閉液，取噬菌體抗體庫(kù)（×）加入到一瓶細(xì)胞中，輕輕搖晃，吸出上清，重新和另一瓶細(xì)胞室溫下?lián)u晃孵育，得到遞減的噬菌體上清將此上清加入到培養(yǎng)的細(xì)胞，室溫下輕輕搖晃去掉上清，立即用沖洗細(xì)胞次，加緩

7、沖液（甘氨酸，），室溫下作用，用緩沖液（，）中和將洗脫的噬菌體抗體與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌于靜止感染將細(xì)菌鋪到含四環(huán)素的瓊脂糖平皿上，培養(yǎng)，以擴(kuò)增噬菌體抗體將長(zhǎng)出的菌落用含四環(huán)素的培基刮下，搖菌離心、取上清，經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌后，用沉肝癌細(xì)胞抗原的制備將培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞用胰酶消化并計(jì)數(shù)，按細(xì)胞加絲裂霉素（），于處理，每搖動(dòng)一次用!液洗次后，加入含的培養(yǎng)基，分裝，保存于肝癌病人的體外致敏無(wú)菌抽取例肝癌患者外周血各，肝素鈉抗凝并采用密度梯度離心法分離其，按細(xì)胞密度個(gè)于孔板中培養(yǎng)將肝癌病人用肝癌細(xì)胞抗原致敏，按肝癌細(xì)胞加入培養(yǎng)的中，于培養(yǎng)天培基為含的完全培基（含×及環(huán)孢菌素）轉(zhuǎn)化培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)

8、期，取上清，經(jīng)濾膜過(guò)濾后收集濾液體外致敏后，按×加入培養(yǎng)上清，于孵育，吸棄上清，加入含的完全培基，培養(yǎng)周后，換用含的完全培基轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)上清的篩選采用間接法用肝癌細(xì)胞株作為腫瘤細(xì)胞抗原固相板，收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗，標(biāo)記的羊抗人（）為二抗將陽(yáng)性孔的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至個(gè)細(xì)胞提取總及合成第一條鏈用試劑分別提取擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞中的總用分光光度計(jì)測(cè)和波長(zhǎng)的吸光度值，計(jì)算，鑒定濃度，以瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)其完整性將各例混合后，用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為（第一鏈合成）；（）肖艷等：全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選鑒定淀噬菌體抗體，將沉淀溶解于中如此進(jìn)行輪淘選和富集抗肝癌噬菌體單鏈抗體的篩選從第輪淘選后

9、涂布的平皿上挑取單克隆至含四環(huán)素的培基中，搖菌過(guò)夜離心，取上清，分別加入到固定有細(xì)胞抗原并經(jīng)封閉的酶標(biāo)板中，孔，于作用洗板次后，按孔加入標(biāo)記的抗單克隆抗體（），作用用充分洗滌后，以顯色，于長(zhǎng)波處測(cè)定吸光度值（）以空白噬菌體作為陰性對(duì)照陽(yáng)性閾值為陰性對(duì)照孔（）值的均值（）與其倍標(biāo)準(zhǔn)差（）之和將陽(yáng)性克隆擴(kuò)增，用于下一步其他細(xì)胞系的鑒定免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞接種于滅菌的載玻片上，于孵箱培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用冷丙酮固定封閉去掉封閉液，加經(jīng)純化濃縮的噬菌體抗體克隆至載玻片上，孵育過(guò)夜洗，滴加標(biāo)記的羊抗單克隆抗體（），洗，顯色，自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水洗玻片置于的乙醇溶液各，逐級(jí)脫水，二甲

10、苯透明，中性樹膠封片免疫組織化學(xué)鑒定將肝癌和正常肝組織石蠟切片脫蠟，抗原修復(fù)，甲醇室溫孵育以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性再用封閉其余步驟同免疫細(xì)胞化學(xué)序列測(cè)定將初步篩選出的陽(yáng)性噬菌體抗體克隆，用質(zhì)粒小抽提試劑盒抽提并純化噬菌體，將純化后的噬菌體交由上海博亞進(jìn)行測(cè)序引；物為：轉(zhuǎn)化的例肝癌患者的培養(yǎng)天后，檢測(cè)其上清，經(jīng)抗原體外刺激的兩例細(xì)胞上清均呈陽(yáng)性反應(yīng)（×）擴(kuò)增免疫球蛋白基因用試劑盒分別逆轉(zhuǎn)錄例總，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（第一鏈）混合，以此為模板，擴(kuò)增出種（），種（），種，種基因，其分子質(zhì)量均為（圖）以上述產(chǎn)物為模板，再次進(jìn)行，擴(kuò)增出種（），種（），種""和種基因，其分子質(zhì)量

11、大小均為（圖）種基因和種基因經(jīng)連接組成種基因，其分子質(zhì)量均為（圖）：；：；：；：；：結(jié)果；：；：；：；：成功轉(zhuǎn)化成功轉(zhuǎn)化例肝癌病人的細(xì)胞，其中有兩例經(jīng)抗原體外致敏用肝癌細(xì)胞抗原體外致敏的培養(yǎng)至天時(shí)，可見集落樣淋巴母細(xì)胞化兩組在加入上清后，細(xì)胞的形態(tài)表現(xiàn)相似，開始可見大量淋巴細(xì)胞死亡周左右時(shí)，可見肝癌細(xì)胞抗原致敏組的細(xì)胞有少量克隆生成，主要分布于孔周圍，并逐漸長(zhǎng)成團(tuán)（圖）經(jīng)：；：生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展；（）噬菌體抗獨(dú)特型抗體庫(kù)的建立的噬菌體感染細(xì)菌，鋪到含四環(huán)素平皿上，隨機(jī)挑取單克隆菌落搖菌擴(kuò)增，取其上清在細(xì)胞抗原板上經(jīng)初步篩選實(shí)驗(yàn)所使用的單克隆重組噬菌體的滴度統(tǒng)一稀釋為×陽(yáng)性孔閾值為

12、陰性對(duì)照孔（）值（）與其倍標(biāo)準(zhǔn)差（）之和，值隨機(jī)挑取的個(gè)單菌落中獲得個(gè)陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性率為鑒定將個(gè)陽(yáng)性克隆同時(shí)用、細(xì)胞固相板做，發(fā)現(xiàn)大部分與陽(yáng)性反應(yīng)的克隆也與反應(yīng)陽(yáng)性經(jīng)過(guò)多次篩選鑒定，最后選出與強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，而與弱反應(yīng)的個(gè)克隆、，將這個(gè)克隆再分別與人類腫瘤細(xì)胞系（鼻咽癌細(xì)胞系、大腸癌細(xì)胞系、宮頸癌細(xì)胞系、肺癌細(xì)胞系）及人類正常細(xì)胞（人胚腎上皮細(xì)胞系、骨髓間質(zhì)干細(xì)胞、原代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞）進(jìn)行鑒定，每種細(xì)胞系的鑒定均設(shè)個(gè)平行孔，以空白噬菌體作為陰性對(duì)照結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆對(duì)肝癌細(xì)胞系、人胚腎上皮細(xì)胞系呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，而與正常肝細(xì)胞系、原代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞反應(yīng)呈弱陽(yáng)性，與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞及其他人腫瘤細(xì)胞系

13、不反應(yīng)結(jié)果見表將經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)菌經(jīng)四環(huán)素抗性篩選后，根據(jù)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在平皿上長(zhǎng)出的克隆數(shù)，計(jì)算所構(gòu)建的重組噬菌體抗獨(dú)特型抗體的庫(kù)容量為×個(gè)克隆從中隨機(jī)挑取個(gè)菌落，經(jīng)擴(kuò)增基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其中個(gè)克隆有全長(zhǎng)基因的插入，插入率為初級(jí)抗體庫(kù)的淘選以正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞對(duì)初級(jí)抗體庫(kù)進(jìn)行三輪正負(fù)淘選，每輪淘選均投入約×的噬菌體，洗脫的噬菌體產(chǎn)率顯示第二輪和第三輪的回收率逐級(jí)增加，說(shuō)明經(jīng)過(guò)淘選后陽(yáng)性克隆已得到富集，富集倍數(shù)為（表）×××××××××篩選初級(jí)抗體庫(kù)經(jīng)過(guò)三輪富集淘選

14、后，將回收得到±±±±±±±±±±±±±±±±±±±±±±±±±±±空白載體±±±±±±±±±；（）肖艷等：全人源抗肝癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選鑒定洗脫法相對(duì)親和力測(cè)定用洗脫法測(cè)定三個(gè)陽(yáng)性克隆、的相對(duì)親和力（圖）、的相對(duì)親和力指數(shù)分別為

15、、應(yīng)，顯色部位主要見于胞膜、胞漿，與其他細(xì)胞反應(yīng)不明顯（圖）這進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)果的正確性將克隆上清與例肝癌組織石蠟切片及例正常肝組織石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，觀察發(fā)現(xiàn)與例肝癌組織切片反應(yīng)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為而與例正常肝組織中均無(wú)反應(yīng)以上結(jié)果顯示與人肝細(xì)胞癌組織有特異性反應(yīng)，反應(yīng)部位主要見于胞膜、胞漿（圖）解離常數(shù)測(cè)定將經(jīng)過(guò)沉淀濃縮的噬菌體抗體梯度稀釋以后用抗原板進(jìn)行間接法，方法同前當(dāng)吸光度降低為最大值時(shí)的噬菌體抗體的濃度即為解離常數(shù)（），用表示噬菌體抗體濃縮后利用梯度稀釋法測(cè)定其滴度為×間接法結(jié)果顯示，吸光度降低為最大值時(shí)的稀釋度為（圖），因此解離常數(shù)×（）×（）

16、5;（）×（）×（）×序列測(cè)定和分析經(jīng)過(guò)對(duì)抗體克隆進(jìn)行測(cè)序后，其測(cè)序結(jié)果與其產(chǎn)物大小一致經(jīng)（）程序分析：處于上游，處于下游，全長(zhǎng)，含序列，重鏈可變區(qū)基因與人胚系有的同源性，輕鏈可變區(qū)基因與人胚系有的同源性，分別屬于討論免疫化學(xué)分析檢測(cè)克隆對(duì)肝癌細(xì)胞系，正常肝細(xì)胞系，人胚腎上皮細(xì)胞系，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，原代培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，宮頸癌細(xì)胞系，肺癌細(xì)胞系的反應(yīng)性，結(jié)果顯示克隆與肝癌細(xì)胞系、人胚腎上皮細(xì)胞系呈強(qiáng)陽(yáng)性反目前，國(guó)內(nèi)外制備的單鏈抗體（）既有從鼠源性雜交瘤細(xì)胞，也有從正常人或患者細(xì)胞中獲得從鼠源性雜交瘤得到的，雖極大地減少了用于人體內(nèi)所產(chǎn)生的反應(yīng)，但終歸是鼠源性的

17、，臨床應(yīng)用必將受到很大限制近年來(lái)，由于噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)的建立和逐漸成熟，從正常人或患者細(xì)胞獲得全人源化的小分子抗體已成為可能用轉(zhuǎn)化腫瘤患者細(xì)胞，雖已制備生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展；（）了一些人源化抗腫瘤抗體，但轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分泌抗體的量少且極不穩(wěn)定，而且從抗體中去除的過(guò)程繁瑣，故用于制備臨床應(yīng)用的抗體受到極大限制同時(shí)在構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)時(shí)，高度多樣化的與是隨機(jī)配對(duì)的，據(jù)估計(jì)，如果要包括將所有可能的與配對(duì)，其文庫(kù)的大小應(yīng)在以上，但目前構(gòu)建的抗體庫(kù)能力一般在之間，這樣基本上是不可能得到一個(gè)抗體基因原始的與結(jié)構(gòu)亞單位的配對(duì)基于以上情況，我們采用了體外致敏法和轉(zhuǎn)化技術(shù)聯(lián)合噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建全人源的抗肝癌庫(kù)，本實(shí)

18、驗(yàn)室已通過(guò)此種聯(lián)合技術(shù)成功制備了鼻咽癌人源抗獨(dú)特型單鏈抗體及抗大腸癌單鏈抗體通過(guò)前者使細(xì)胞內(nèi)抗體可變區(qū)基因發(fā)生高突變，從而產(chǎn)生具有不同親和力的抗體，通過(guò)轉(zhuǎn)化技術(shù)使細(xì)胞永生化分泌特異性抗體，通過(guò)噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)使抗體基因克隆化，從而可用基因工程技術(shù)大量獲得所需抗體對(duì)人細(xì)胞的感染是通過(guò)病毒表面蛋白質(zhì)與細(xì)胞表面的補(bǔ)體受體（）結(jié)合而進(jìn)入被感染的細(xì)胞，使細(xì)胞能夠在體外連續(xù)傳代，可使數(shù)量較少的抗原特異性細(xì)胞得到增殖，富集分泌特異性抗體的免疫球蛋白基因，同時(shí)減少下游步驟基因操作中特異性抗體基因片段的丟失，增加原始配對(duì)的機(jī)率通過(guò)聯(lián)合以上方法，我們構(gòu)建了一個(gè)庫(kù)容量為×全人源抗肝癌單鏈抗體庫(kù)，檢測(cè)其目的基因插入率為，為進(jìn)一步用肝癌細(xì)胞篩選特異性抗肝癌單鏈抗體奠定了重要基礎(chǔ)為了提高從文庫(kù)中篩選出特異性抗肝癌細(xì)胞的能力，但與抗原的結(jié)合力常常較完整抗體低，可能涉及“價(jià)”的問(wèn)題另外，在噬菌體呈現(xiàn)系統(tǒng)中，外源蛋白的表達(dá)量通常較低，這是因?yàn)榈鞍诪榈涂截愅鈿さ鞍?，其大量表達(dá)對(duì)宿主菌具有毒性效應(yīng)而其表達(dá)產(chǎn)物分泌于培養(yǎng)上清中，易被菌體蛋白酶所降解因此，本實(shí)驗(yàn)在檢測(cè)陽(yáng)性克隆及用免疫組化鑒定時(shí)，均將培養(yǎng)上清經(jīng)過(guò)倍以上的濃縮，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性檢出率與未濃縮的相比，大大提高噬菌體單鏈抗體與多種人腫瘤細(xì)胞系及人正常細(xì)胞系的結(jié)果、細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果，顯示克隆