細(xì)胞培養(yǎng)與病毒培養(yǎng)實驗步驟

1、細(xì)胞培養(yǎng)與病毒培養(yǎng)實驗步驟實驗二傳代細(xì)胞培養(yǎng)與病毒在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)、實驗?zāi)康牧私獾怪蔑@微鏡的構(gòu)造與使用，了解不同傳代細(xì)胞的形態(tài)及接毒后的病變特 征,掌握細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 方法、病毒接種方法及收毒方法。二、常用細(xì)胞的種類BHK-21:倉鼠腎傳代細(xì)胞PK-15:豬腎傳代細(xì)胞IBRS-2:豬腎傳代細(xì)胞Hela:人的子宮瘤細(xì)胞Vero:非洲綠猴腎細(xì)胞Marc-145:來源于Vero細(xì)胞TK-143:人的胸苷激酶陰性細(xì)胞Sf9:昆蟲細(xì)胞三、材料1、2、100ml細(xì)胞瓶、吸管、吸球、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、加樣器、槍頭BHK-21(baby hamster kid ney)細(xì)胞3、0、25%夷酶4、生長液:含1

2、0%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM維持液：含2-5%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM5、偽狂犬病病毒液 （PRV）四、傳代細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求1) 細(xì)胞密度:2-3 X 105個/ml2) pH 范圍 最適 pH7 0-7、4,耐受 pH6 6-7、83）培養(yǎng)溫度哺乳動物細(xì)胞一般為37 r昆蟲細(xì)胞28-30 r五、常用細(xì)胞分散劑與作用原理1 、胰酶 使精氨酸或賴氨酸的羧基與其她氨基酸的氨基之間的多肽鏈發(fā)生水解 導(dǎo)致細(xì)胞間質(zhì)水解而使細(xì)胞或組織塊消化為分散的單個細(xì)胞。2、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）:與二價鈣、鎂離子結(jié)合，從而使細(xì)胞分散。3、灰色鏈絲菌酶 :由灰色鏈絲菌提取

3、的一種酶制劑 ,就是蛋白酶、氨肽酶與羧肽 酶的混合物。六、營養(yǎng)液1 、人工綜合營養(yǎng)液氨基酸、糖類、無機(jī)鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長因子。2、血清 1）血清的種類胎牛血清、 新生犢牛血清、 成年牛血清、 馬血清、 雞血清、 兔血清、 羊血清、 人血清 ,其中以新生犢牛血清使用最為廣泛。2）血清的處理無菌采集，過濾除菌。用前56C滅活30min。3）血清的作用A、能提供細(xì)胞生存、生長與增生所必須的生長調(diào)節(jié)因子。B、能補充基礎(chǔ)培養(yǎng)液中沒有或量不足的營養(yǎng)成分。C含有一些可供貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)器皿表面貼附與鋪展的生長基質(zhì)成分。D有中與毒性物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞不受傷害的作用。E給培養(yǎng)液提供良好的緩沖

4、系統(tǒng)。F、提供蛋白酶抑制劑，保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞釋放的蛋白酶的損害。4）應(yīng)用血清存在的問題A、血清中存在不少有害于細(xì)胞生長與繁殖的物質(zhì)：補體、免疫球蛋白、生長抑制 因子。B、血清的成分不明確，影響對結(jié)果的分析。C不同動物、不同批次的血清成分與活性差別較大 ，使得培養(yǎng)結(jié)果不穩(wěn)定。七、傳代細(xì)胞系培養(yǎng)1、優(yōu)點:1）可以無限的傳代。2）不少細(xì)胞系對病毒很敏感。3）某些傳代細(xì)胞系能在懸浮培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，適合病毒抗原的大量生產(chǎn)。4）生長旺盛,繁殖快速,對營養(yǎng)條件不苛刻。2、缺點：在傳代過程中遭到支原體與病毒的污染。3、培養(yǎng)方法1）取長滿單層的細(xì)胞一瓶，傾去培養(yǎng)液。2）加入2ml胰酶消化液,于37r培養(yǎng)箱放置幾

5、分鐘,至細(xì)胞間出現(xiàn)空隙或細(xì)胞變 圓后，倒去消化液。3）加入生長液，反復(fù)吹打幾次，使細(xì)胞分散成單個細(xì)胞，然后分裝于3個小瓶中。 再在每個小瓶中補充生長液至10ml,然后置37r培養(yǎng)箱培養(yǎng),培養(yǎng)1-2天即可長 成單層。八、病毒（PRV）在傳代細(xì)胞中的培養(yǎng)1、選長滿單層的細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液。2、加入適量的病毒懸液3、置溫箱中感作（吸附）45min-1h。4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培養(yǎng)液，補足維持液，置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直至80%族 上的細(xì)胞病變。5、收毒：將病變的細(xì)胞置于-20 r冰箱中，凍結(jié)后取出自然解凍，在解凍過程中振 搖幾次，以使細(xì)胞完全從瓶壁上脫落。然后將病毒液收集于鹽水瓶或其它容器中。 低溫貯

6、藏備用。實驗三、原代細(xì)胞培養(yǎng)（以雞胚成纖維細(xì)胞為例）一、實驗?zāi)康牧私獠煌?xì)胞的形態(tài)，掌握雞胚成纖維細(xì)胞的制備與培養(yǎng)方法。二、材料1、9-11日齡雞胚 2、照蛋燈與蛋座 3、碘酊棉球與酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小鑷子5、平皿、細(xì)菌瓶、吸管、吸球、細(xì)胞瓶、6、胰酶、生長液、維持液三、細(xì)胞培養(yǎng)的條件要求1) 細(xì)胞密度 原代細(xì)胞：4-6 X 105個/ml傳代細(xì)胞:2-3 X 105個/ml 2)pH 范圍 最適 pH7 0-7、4,耐受 pH6 6-7、8 3) 培養(yǎng)溫度哺乳動物細(xì)胞一般為37 r昆蟲細(xì)胞28-30 r四、操作步驟1、取 9-12 日齡孵育良好的雞胚 , 依次用碘酊與酒精消毒氣

7、室部。2、無菌操作下用剪子去除氣室部卵殼 ,去除殼膜,穿破絨毛尿囊膜 ,夾住雞胚頸部 , 取出雞胚放于滅菌平皿中。3、用眼科剪、鑷去除雞胚頭、四肢及內(nèi)臟,用DMEM沖冼2次。4、將沖洗后的雞胚用剪子充分剪碎 , 使其近于乳糜狀。5、將剪碎的組織塊倒入錐形瓶或燒杯或大青霉素瓶中,用DME充分沖洗,并靜置 幾分鐘,待組織塊下沉,吸棄上層液體,再加DMEM如此反復(fù)沖洗2-3遍。6于沉淀組織塊內(nèi)加入約4倍量的0、25%夷酶，并調(diào)pH至7、6-7、8,振蕩混勻 后置37r水浴中感作30分鐘,每10分鐘輕輕搖動一次,使細(xì)胞消化完全（組 織塊變散松，沉降漸變緩慢時即表示消化足夠）。7、取出,靜置幾分鐘,小心

8、吸棄上層胰酶溶液,用DME輕洗2次后，加入生長液5ml,用大口徑吸管反復(fù)吹打，使細(xì)胞游離。8、靜置幾分鐘，使未消化好的組織塊下沉。9、細(xì)胞計數(shù)取細(xì)胞懸液0、5ml+2ml 0、1%吉晶紫一枸椽酸（0、1mol/L）溶液，室溫或37C 溫箱中5-10min,充分振蕩后進(jìn)行計數(shù)。按白細(xì)胞計數(shù)法計算4角4個大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)（N）。每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)（n）=N/4 x 10000x K（稀釋倍數(shù)）。活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在90%上。10、將計數(shù)好的細(xì)胞稀釋到合適的濃度，使細(xì)胞量約為4-6 x 106個/ml,分層于細(xì) 胞培養(yǎng)瓶中，每瓶1ml,再補加DME生長液至10ml,蓋上蓋子,置于37°C恒溫

9、箱中培養(yǎng)。五、結(jié)果的觀察于培養(yǎng)后每天觀察結(jié)果，至長層單層。細(xì)胞量較大時，一天即可長成單層，細(xì) O表示可計數(shù) 胞呈纖維狀。表示不計數(shù)實驗四病毒感染力的滴定（TCID50的測定）、實驗?zāi)康牧私獠《靖腥玖y定的幾種常用方法,掌握半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量TCID50的 操作步驟、計算方法及含義。二、測定病毒感染力的方法半數(shù)致死量LD50( 50% lethal dose):用動物或雞胚來檢測半數(shù)雞胚感染量 EID5o(egg 50% infective dose):用雞胚來檢測用細(xì)胞來半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量 TCID5o(50% tissue culture infective dose):檢測蝕斑形成單位

10、(plaque forming unit,PFU):用細(xì)胞來檢測三、材料1、長滿單層的細(xì)胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液(PRV)四、TCID50的操作步驟1、在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋,從10 -10 。2、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養(yǎng)板中 每孔接種100 d。,每一稀釋度接種一縱排共8孔,3、在每孔加入細(xì)胞懸液100 d,使細(xì)胞量達(dá)到23X 105個/ml。4、設(shè)正常細(xì)胞對照，正常細(xì)胞對照作兩縱排。(100 d生長液+100d細(xì)胞懸液)5、逐日觀察并記錄結(jié)果，一般需要觀察5-7天。6、結(jié)果的計算，按Reed-Muen

11、ch兩氏法或Karber法五、TCID50的計算方法CPE:細(xì)胞病變效應(yīng)1、Reed-Muench兩氏法病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)累計出現(xiàn)CPE孔所 占的%CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)10"8 .0270100(27/27)10-28L0190100(19/19)10-37111191、6 (11/12)10-4354640(4/10)10-517 JF1130、7(1/14)10-6080210(0/21)CP E:Cyto pathic effect距離比例=（高于50%變率的百分?jǐn)?shù)-50%）/（高于50%變率的百分?jǐn)?shù)-低于50% 病變率的百分?jǐn)?shù)）=(91、6-50)/(9

12、1 、6-40)lgTCID50=距離比例X稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%變率的稀釋度的對數(shù)=0、8X (-1)+(-3)=-3TCID50=10-3、8/0、1ml含義:將該病毒稀釋103、8接種100d可使50%勺細(xì)胞發(fā)生病變。2、Karber 法病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE的孔數(shù)出現(xiàn)CPE孔的比率10-188/8=110-288/8=110-377/8=0、87510-433/8=0、37510-511/8=0、12510-600/8=0IgTCID 5o=L-d（s-O、5）L:最高稀釋度的對數(shù)D:稀釋度對數(shù)之間的差S:陽性孔比率總與IgTCID50=-1-1 X （3、375-0、5）=-

13、3、875TCIC50=10-3、875/0、1ml含義：將該病毒稀釋103、875接種100 d可使50%勺細(xì)胞發(fā)生病變。實驗五血清中與試驗、實驗?zāi)康牧私庵信c試驗的基本原理與幾種不同的 測定方法，掌握固定病毒一稀釋血清 法的操作步驟與計算 方法及含義。、原理抗體與相應(yīng)的病毒粒子特異性地結(jié)合，使病毒的感染力喪失。三、用途1、疾病診斷2、病毒分離株的鑒定3、不同病毒株的抗原關(guān)系研究4、疫苗免疫原性的評價5、免疫血清的質(zhì)量評價 6測定實驗動物血清中就是否存在抗體四、分類（一）蝕斑（痘斑）減數(shù)試驗將病毒一正常血清混合物以及病毒一待檢血清混合物分別接種到單層細(xì)胞 上，隨后覆蓋營養(yǎng)瓊脂或甲基纖維素，進(jìn)行

14、蝕斑測定,比較病毒一正常血清組與病 毒一待檢血清組產(chǎn)生的蝕斑數(shù)，兩者的差數(shù)表示待檢血清的中與能力。以試驗組的蝕斑數(shù)比對照組減少 50%乍為判定依據(jù),血清稀釋度就就是其蝕 斑減數(shù)試驗效價。（二）交叉保護(hù)試驗先將實驗動物進(jìn)行主動免疫或被動免疫，然后以待檢病毒進(jìn)行攻擊，根據(jù)實驗 動物被保護(hù)的情況，判定待檢V的種類或型別。這一方法的缺點就是試驗周期太 長,并且需要大量的實驗動物?？捎糜谝韵聨追矫妫簯?yīng)用已知V鑒定未知V ;應(yīng)用已 知免疫血清鑒定未知V;應(yīng)用已知V鑒定未知血清。（三）終點法中與試驗 1、固定病毒一稀釋血清法將不同稀釋度的血清與固定量的病毒液（一般為100或200個TCID50、EID50

15、或LD5o）混合，置適當(dāng)?shù)臈l件下感作一定時間，再將血清-病毒混合物接種于敏感細(xì) 胞、雞胚或?qū)嶒瀯游?，測定被檢血清阻止組織培養(yǎng)細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒瀯游锇l(fā)生病 毒感染的能力及其效價。以能保護(hù)50%a織培養(yǎng)細(xì)胞、雞胚或?qū)嶒瀯游锊话l(fā)生病變、感染或死亡的血 清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的50%中與效價（PD。）。2、固定血清一一稀釋病毒法在固定量的血清中，加入等量不同稀釋度的病毒，用對照非免疫血清（對照組） 與待檢血清同時進(jìn)行 測定,計算每一組的TCID50、EID50或LD50,然后計算中與指數(shù)。五、材料1、長滿單層的細(xì)胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生長液3、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板4、加樣器、槍頭5、病毒液（PRV

16、6、待檢血清、PRV陽性對照血清、PRV陰性對照血清八、操作步驟1、固定病毒一稀釋血清法 1）測定病毒液的TCID50 2）將測好TCID50的病毒液稀釋成200個TCID50的病毒懸液。3）在 96孔微量培養(yǎng)板中將血清（預(yù)先56C滅活30min）作連續(xù)倍比稀釋（具體方法 就是在96孔板中先加入50卩1生長液，再加50卩待檢血清，混勻后，吸50卩至 下一孔，如此下去。一直到1 : 256）,每個稀釋度作4孔。4）在上述各孔內(nèi)加入50卩稀釋好的病毒液，混勻后放入37 C 5%CO培養(yǎng)箱中作用45min-60min 。5）同時設(shè)待檢血清毒性對照，陰、陽性血清對照，病毒對照與正常細(xì)胞對照，其中病 毒

17、對照要作200個TCID。、20個TCID。、2個TCID。、0、2個TCID。4 個不 同濃度的對照。6）感作完成后每孔加入100卩1細(xì)胞懸液 放37 C 5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng),逐日觀察并記 錄結(jié)果，一般要觀察5-7天。累計7）結(jié)果計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法進(jìn)行。血清稀釋度CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)保護(hù)率%1 : 2(10"°、3)04015100(15/15)1 : 4(10"°、6)04011100(11/11)1 : 8(10"0、9)131787、5(7/8)1 : 16(10"1、

18、2)132466、7(4/6)1 : 32(10"1、5)315116、7(1/6)1 : 64(10"1、8)40900(0/9)-2、11 : 128(10 )401300(0/13)1 : 256(10-2、4)401700(0/17)IgPD50=高于50%的保護(hù)率的血清稀釋度的對數(shù)+距離比例X稀釋度對數(shù)的差=-1、2+0、33 X （-0、3）=-1、299距離比例= 高于35o%的保護(hù)率-50% ）/（高于50%的保護(hù)率一低于50%的保護(hù)率）PD50=-1、299 的反對數(shù)=0、05=1/20即1 : 20稀釋的待檢血清可葆護(hù)7）50%勺組織培養(yǎng)細(xì)胞免于出現(xiàn)CPE2、固定血清稀釋病毒法1）將病毒作連續(xù)10倍稀釋2）將稀釋好的病毒接種96孔板，每個稀釋度接種一縱排