植物組織培養(yǎng)技術的發(fā)展與應用

1、植物組織培養(yǎng)技術的發(fā)展與應用摘要植物組織培養(yǎng)技術是一種新興的科研手段，近些年來發(fā)展迅速。本文從植物組織培養(yǎng) 的原理、組織培養(yǎng)的方法入手，簡單介紹植物組織培養(yǎng)技術的發(fā)展與應用。關鍵詞植物組織培養(yǎng)愈傷組織原生質(zhì)體1. 植物組織培養(yǎng)的概念、原理、方法及特點 1.1植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)技術（簡稱組培）是20世紀中葉開始發(fā)展，如今已經(jīng)非常成熟的一種現(xiàn)代科研手段，其概念是：在無菌條件下，將離體的植物器官（根尖、莖尖等）、組織（形成層、花藥組織等）、細胞（體細胞、生殖細胞等）、胚胎（成熟或未成熟的胚卜原生質(zhì)體等在人工配制 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，給予適宜的培養(yǎng)條件， 誘發(fā)其產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽或長成完整的

2、植株的 技術。1.2植物組織培養(yǎng)的原理植物組織細胞培養(yǎng)的依據(jù)是植物細胞“全能性”及植物的“再生作用”。1902年，德國著名植物學家G Haberlanelt根據(jù)細胞學理論， 大膽地提出了高等植物的器官和組織可以不斷分 割，直到單個細胞，即植物體細胞，在適當?shù)臈l件下，具有不斷分裂和繁殖，發(fā)育成完整植 株的潛力的觀點。19世紀30年代，德國植物學家施萊登和德國動物學家施旺創(chuàng)立了細胞學 說，根據(jù)這一學說，如果給細胞提供和生物體內(nèi)一樣的條件，每個細胞都應該能夠獨立生活。證實了 G Haberlanelt在五十多年前關于細胞全能的預1958年，美國植物學家斯蒂瓦特等人，用胡蘿卜韌皮部的細胞進行培養(yǎng)，終于

3、得到了完整 植株，并且這一植株能夠開花結果， 言。近幾十年來發(fā)展起來的一項無性繁殖的新技術一一植物根據(jù)植物細胞具有全能性這個理論， 的組織培養(yǎng)技術。1.3植物組織培養(yǎng)的方法 1.3.1非試管微組織快繁非試管微組織快繁技術是將外植體（一般要求帶一葉一芽） 放置在室內(nèi)外普通沙子培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，利用植物腋芽自然倍增達到快速繁殖的目的。一般植物715天可以生長出根系。此技術投資低，操作環(huán)節(jié)少。1.3.2試管組織培養(yǎng) 試管組織培養(yǎng)是將外植體（即離體組織、器官或細胞）放置在試管等器皿中在無菌的條件下 進行組織培養(yǎng)獲得試管苗。1.4植物組織培養(yǎng)的分類1.4.1胚胎培養(yǎng)指以從胚珠中分離出來的成熟或未成熟胚為

4、外植體的離體無菌培養(yǎng)。1.4.2器官培養(yǎng)指以植物的根、莖、葉、花、果等器官為外植體的離體無菌培養(yǎng)，如根的根尖和切段， 莖的莖尖、莖節(jié)和切段，葉的葉原基、葉片、葉柄、葉鞘和子葉，花器的花瓣、雄蕊 （花藥、花絲）、胚珠、子房、果實等的離體無菌培養(yǎng)。1.4.3組織培養(yǎng)指以分離出植物各部位的組織（如分生組織、形成層、木質(zhì)部、韌皮部、表皮、皮層、 胚乳組織、薄壁組織、髓部等），或已誘導的愈傷組織為外植體的離體無菌培養(yǎng)。這是狹義 的植物組織培養(yǎng)。1.4.4細胞培養(yǎng)為接種體指以單個游離細胞（如用果酸酶從組織中分離的體細胞，或花粉細胞，卵細胞） 的離體無菌培養(yǎng)。145原生質(zhì)體培養(yǎng)。指以除去細胞壁的原生質(zhì)體為外

5、植體的離體無菌培養(yǎng)。1.5植物組織培養(yǎng)的特點1、培養(yǎng)條件可以人為控制組織培養(yǎng)采用的植物材料完全是在人為提供的培養(yǎng)基和小氣候環(huán)境條件下進行生長，擺脫了大自然中四季、晝夜的變化以及災害性氣候的不利影響，且條件均一，對植物生長極為有利，便于穩(wěn)定地進行周年培養(yǎng)生產(chǎn)。2、生長周期短，繁殖率高植物組織培養(yǎng)是由于人為控制培養(yǎng)條件，根據(jù)不同植物不同部位的不同要求而提供不同的培養(yǎng)條件，因此生長較快。另外，植株也比較小，往往20-30天為一個周期。所以，雖然植物組織培養(yǎng)需要一定設備及能源消耗，但由于植物材料能按幾何級數(shù)繁殖生產(chǎn)，故總體來說成本低廉，且能及時提供規(guī)格一致的優(yōu)質(zhì)種苗或脫病毒種苗。3、管理方便，利于工廠

6、化生產(chǎn)和自動化控制植物組織培養(yǎng)是在一定的場所和環(huán)境下，人為提供一定的溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等 條件，極利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，也利于自動化控制生產(chǎn)。它是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的發(fā)展方向。它與盆栽、田間栽培等相比省去了中耕除草、澆水施肥、防治病蟲等一系列繁雜勞動，可以大大節(jié)省人力、物力及田間種植所需要的土地。2植物組織培養(yǎng)的實驗過程2.1植物組織培養(yǎng)的條件2.1.1培養(yǎng)基植物組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基有：MT、MS、SH、N6、White等。不同植物所需要的生長條件不同，所用的培養(yǎng)基也有所不同。在組織培養(yǎng)中，2.1.2外源激素愈傷組織和胚狀體能否形成是培育出新植株的關鍵。通過在基礎培養(yǎng)基

7、里添加一定濃度的外植物植物源激素，可以誘導出愈傷組織、胚狀體、不定芽、根等器官，最終獲得再生植株或次生物質(zhì)。 用于植物組織培養(yǎng)的材料稱為外植體，其主要形式有器官、胚胎、單細胞、原生質(zhì)體等。根 據(jù)外植體的不同，所需要的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)條件、外源激素的種類及比例等均不同。組織培養(yǎng)中，影響培養(yǎng)力的因素是多方面的，誘導愈傷組織成敗的關鍵在于培養(yǎng)條件，激素是誘導愈傷組織和綠苗分化的關鍵因素。最常用的誘導愈傷組織的生長素是IAA、NAA和2,4-D，所需濃度為0.0110 mg/L。最常用的細胞分裂素是 KT和ABA，使用濃度為0.110mg/L。KT的主要作用是促進細胞 分裂和愈傷組織分化。ABA對植物

8、體細胞胚的發(fā)生與發(fā)育具有重要作用。各類植物激素的 生理作用雖有相對專一性，但是植物的各種生理效應是不同種類激素之間相互作用的綜合表 現(xiàn)。2.2植物組織培養(yǎng)的步驟2.2.1選擇和配制培養(yǎng)基培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中的“血液”，血液的成分及其供應狀況直接關系到培養(yǎng)物的生長與分化，因此了解培養(yǎng)基的成分、特點及其配制至關重要。2.2.2滅茵或不耐熱的物滅菌是組織培養(yǎng)中的重要工作之一，通常采用物理的或化學的滅菌方法。培養(yǎng)基用常壓 高壓蒸煮等濕熱滅菌、器械采用灼燒滅菌、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌、質(zhì)采用過濾滅菌、植物材料表面用消毒劑滅菌、物體表面用藥劑噴霧滅菌、接種室等空間采用紫外線或熏蒸滅菌。2.2.3

9、接種將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊放入培養(yǎng)基，整個接種過 程要在無菌條件下進行。224培養(yǎng)把培養(yǎng)材料放在有一定光照和溫度等條件的培養(yǎng)室里，使之生長、分裂和分化，形成愈 組織或進一步分化成再生植株。2.2.5試管苗馴化移栽 試管苗是在特殊環(huán)境條件下生長的幼苗，與自然生長的幼苗有很大差異，只有通過馴化，使之適應自然環(huán)境后才能移栽。3.植物組織培養(yǎng)的應用3.1植物快速繁殖和無病毒種苗生產(chǎn) 植物快速繁殖技術始于 20世紀60年代，法國的Morel用莖尖培養(yǎng)的方法大量繁殖蘭花獲得 成功，從此揭開了植物快速繁殖技術研究和應用的序幕。目前，通過離體培養(yǎng)獲得小植株并且具有快速繁殖潛

10、力的植物已有100多科1000種以上，有的已經(jīng)發(fā)展成為工業(yè)化生產(chǎn)的商品。世界上80%85%的蘭花是通過組織培養(yǎng)進行脫毒和快速繁殖的。培養(yǎng)的植物種類也由觀賞植物逐漸發(fā)展到園藝植物、大田作物、經(jīng)濟植物和藥用植物等。在我國，同類的研究始于20世紀70年代。馬鈴薯無毒種薯和甘蔗種苗已在生產(chǎn)上大面積種植，30余種植物已進行規(guī)?；a(chǎn)或中間試驗利用組織培養(yǎng)進行植物快速繁殖及無病毒種苗生產(chǎn)，不僅能夠挽救珍惜瀕危物種，而且能夠解決植物野生資源缺乏的問題。3.2植物花藥培養(yǎng)和單倍體育種 將植物花藥培養(yǎng)成單倍體植株，再經(jīng)過染色體加倍，能很快得到純合的二倍體，這樣將大大縮短育種年限。到目前為止，世界上通過花粉和花藥

11、培養(yǎng)已獲得了幾百種植物的單倍體植株。韓國先后育成了 5個優(yōu)質(zhì)、抗病、抗倒伏的水稻品種。 我國自20世紀70年代開始該領域的 研究已經(jīng)培育了 40余種由花粉或花藥發(fā)育成的單倍體植株，其中有10余種為我國首創(chuàng)。玉米獲得了 100多個純合的自交系；橡膠獲得了二倍體和三倍體植株。僅“九五”期間就育成高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆、抗病的農(nóng)作物新品種44個，種植面積超過 660萬。3.3植物胚胎培養(yǎng)雜交育種中，雜種胚常常敗育，因此將早期生長的胚取出，應用組織培養(yǎng)方法，就有可能培育出雜交植物。已經(jīng)有100篇以上幼胚培養(yǎng)成為植株的報道。國內(nèi)外科學家應用植物胚胎培養(yǎng)技術獲得了多種遠緣雜交的重組體、栽培種和雜交品種。3.4植

12、物愈傷組織或細胞懸浮培養(yǎng) 利用植物愈傷組織或細胞懸浮培養(yǎng)可以生產(chǎn)用于預防和治療疾病的植物次生代謝產(chǎn)物。近年來，這一領域的發(fā)展極為迅速，已經(jīng)研究了 400多種植物，從培養(yǎng)細胞中分離到 600多種次級代謝產(chǎn)物，其中60多種在含量上超過或等于原植物，20種以上重超過原植物的 1 %。例如，從薯芋愈傷組織和懸浮細胞生產(chǎn)的diosgenin用于合成甾體藥物。最近抗癌藥物紫杉醇一紅豆杉細胞培養(yǎng)物，可用75t發(fā)酵罐培養(yǎng)，已達到商業(yè)化生產(chǎn)水平。另外，達到商品化水平的還有紫草、人參、黃連、老鸛草等；長春花、毛地黃、煙草等已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；牙 簽草、紅花等20多種植物正在向商品化過渡。3.5細胞融合與原生質(zhì)體培養(yǎng)

13、自1960年英國學者Cocking首次利用纖維素酶從番茄幼苗的根分離原生質(zhì)體獲得成功以來， 到1990年已有100種以上植物的原生質(zhì)體能再生植株。我國獲得了 30余個品種的原生質(zhì)體再生植株，其中包括難度較大的重要糧食作物和經(jīng)濟作物，如大豆、水稻、玉米、小麥、谷 子、高粱、棉花等。在木本植物、藥用植物、蔬菜和真菌原生質(zhì)體培養(yǎng)方面的進展也十分迅 速。國外已先后獲得了種內(nèi)及種間的體細胞雜種植株。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)還可應用于外源基因轉(zhuǎn)移、無性系變異及突變體篩選等研究，因而越來越受到人們的重視。3.6植物細胞突變體篩選植物細胞突變體的篩選最早始于1959年，G. Melchers在金魚草懸浮細胞培養(yǎng)中獲得

14、了溫度突變體。1970年，P. S. Carlson, H . Binding和Y . M . Heimer等分別分離出煙草營養(yǎng) 缺陷型細胞、矮牽牛抗鏈霉素細胞系及煙草抗蘇氨酸細胞系。迄今為止，已經(jīng)在不少于15100個以上的植物細胞突變體或變異體。其中包括抗 抗氨基酸及其類似 如水稻耐鹽突 如玉米抗除草劑變個科45個種的植物細胞培養(yǎng)中篩選出病細胞突變體，如玉米抗小斑病突變體和小麥抗赤霉病、根腐病突變體；物細胞突變體，如甘藍型湖菜抗HYP突變體8釘；抗逆境脅迫細胞突變體，變體和小麥抗鹽突變體；抗除草劑細胞突變體及營養(yǎng)缺陷型細胞突變體，異體；株高突變體的篩選，如水稻矮稈變異體。3.7植物體細胞胚胎

15、和人工種子1958年，Reinert在胡蘿卜的組織培養(yǎng)中最先發(fā)現(xiàn)了體細胞胚胎（胚狀體）。據(jù)不完全統(tǒng)計，能大量產(chǎn)生胚狀體的植物有43科92屬100多種一些重要作物如水稻、小麥、玉米、珍珠谷等，也能通過離體培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體。這些胚狀體用褐藻酸鈉等包埋，再加上人工種皮，就形成了人工種子。人工種子的優(yōu)點是：繁殖快速，成苗率極高；不受氣候影響，四季皆可工 廠化生產(chǎn)。上世紀80年代初，美、日、法等國家相繼開展了人工種子的研究，我國也于“七五”期間開展了此項研究，并于1987年列入了國家“ 863”高技術研究發(fā)展計劃。采用液氮超 如建立 而且可以3.8植物組織細胞培養(yǎng)物的超低溫保存與種質(zhì)庫建立植物細胞全能性的

16、發(fā)現(xiàn)和證實，為植物種質(zhì)資源的長期保存開辟了一條新途徑。低溫保存技術，能保持很高的存活率， 并且能再生出新植株和保持原來的遺傳特性。 莖尖分生組織培養(yǎng)物的超低溫保存種質(zhì)庫，不僅可以防止種質(zhì)的遺傳變異和退化，長期保存無病毒的原種。3.9植物組織培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因技術的應用 我國第一個T-DNA插入突變體庫的構建和研究為我國水稻功能基因組學研究奠定了良好的 技術和材料基礎，為確保我國擁有一批有自主知識產(chǎn)權的基因資源做出了積極貢獻。由中國水稻研究所農(nóng)業(yè)部水稻生物學重點開放實驗室和中科院上海植物生理研究所合作，通過建立大規(guī)模、高效的農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因技術體系，將玉米轉(zhuǎn)座子Ac-Ds等外源基因?qū)胨疚闯墒炫吆?/p>

17、種子誘導的愈傷組織，獲得了1.2萬個獨立的T-DNA插入株系，并構建了水稻突變體的數(shù)據(jù)庫。4. 植物組織培養(yǎng)的前景展望植物組織培養(yǎng)研究與應用是20世紀科技進步的重大成果之一，為研究植物生長發(fā)育、抗性生理、激素及器官發(fā)生與胚胎發(fā)生等提供了許多良好的實驗材料和有效途徑。植物組織培養(yǎng)方法不斷提高的同時，也相應拓寬了其應用范圍，現(xiàn)已為人們廣泛的應用在各個領域。由于組織培養(yǎng)在人工控制的條件下進行，容易掌握花芽分化和開花成因；通過胚胎培養(yǎng)，能夠得到雜種或自交種；通過分離單倍體細胞，能培育純合的二倍體優(yōu)良品系；提高育種多樣性的同時縮短了育種時間；通過突變體篩選，提高植物的品質(zhì)，增強抗逆境脅迫能力，擴大植物的生長范圍；將體細胞冷藏在低溫下，建立基因庫，達到保存物種的目的；獲得藥用價值高和工業(yè)生產(chǎn)所需要的次生產(chǎn)物，加快藥物生產(chǎn)的時間并且減少了單純依靠天然植物的被動 性。植物組織培養(yǎng)技術已經(jīng)滲透到科研、生產(chǎn)和生活各個領域，必將日臻完善。但是長期來，組織培養(yǎng)多數(shù)還停留在試驗研究上，在應用生產(chǎn)方面還有一定不足因此今后需要有一套可行的措施，將研究成果轉(zhuǎn)化為有經(jīng)濟價值的大規(guī)模生產(chǎn)實踐。參考文獻袁道強，高松