熒光定量PCR產(chǎn)品研發(fā)規(guī)程

1、熒光定量P C R 產(chǎn) 品 研 發(fā) 規(guī) 程1研發(fā)產(chǎn)品立項(xiàng)依據(jù)(項(xiàng)目可行性報(bào)告)：(1) 需要檢測(cè)的病原體是病毒還是細(xì)菌、真菌等其它病原體，致病菌是一種病原體或者是幾種病原體。如果是針對(duì)病毒的檢測(cè)，需要了解病毒的亞型和基因分型的標(biāo)準(zhǔn)。如果是針對(duì)基因的檢測(cè)，需要檢測(cè)的基因有哪些。(2) 病原體的分類位置情況，病原體的感染和致病機(jī)制，病原體的生活史。(3) 現(xiàn)有病原體檢測(cè)的方法， 各自的優(yōu)劣， 什么方法是目前認(rèn)可的金標(biāo)準(zhǔn)， 熒光定量 PCR的優(yōu)勢(shì)。(4) 病原體檢測(cè)或診斷的臨床意義，什么類型的樣品最適合的樣品，有多少適合檢測(cè)的樣品類型。(5) 國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品情況：什么公司有同類的產(chǎn)品，有多少公司有該

2、產(chǎn)品，占市場(chǎng)主導(dǎo)地位的是哪家公司的產(chǎn)品？技術(shù)原理和技術(shù)優(yōu)勢(shì)、 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和適用的檢測(cè)樣品類型，包裝規(guī)格和說明書信息，其產(chǎn)品的市場(chǎng)反應(yīng)情況，是否有有批文的產(chǎn)品。(6) 市場(chǎng)需求情況(可由公司市場(chǎng)銷售人員進(jìn)行調(diào)研)(7) 臨床標(biāo)本獲得情況(是否可以得到陽(yáng)性標(biāo)本，從哪里得到臨床樣品，陽(yáng)性樣品量是否足夠)(8) SFDA報(bào)批的可能性(從生檢所了解)(9) 參比品(從生檢所了解)：參比品主要是特異性參比品、敏感性參比品和最低檢出量標(biāo)準(zhǔn)品。是否有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。(10) 技術(shù)方法的文獻(xiàn)資料:主要是有無特異性的引物和探針序列，基因組片段，基因組序列。確定引物和 探針序列以及在基因組上的具體位置。Q-PCR( RT

3、-QPCP復(fù)合Q-PCR擴(kuò)增體系，擴(kuò)增片斷大小，探針類型和熒光標(biāo)記類型。檢測(cè)靈敏性，進(jìn)行靈敏度檢測(cè)的質(zhì)控品及其制備，最低檢出率。檢測(cè)特異性，特異性檢測(cè)的參考品極其參考品的范圍。可以檢測(cè)的臨床樣品類型針對(duì)不同種類臨床樣品的處理方法。2. 產(chǎn)品研制技術(shù)路線(1)基因組序列和序列比較：查找病原體的基因組序列，對(duì)于病毒檢測(cè)，需要分析比對(duì)病毒亞型的基因組序列。對(duì)于基因檢測(cè)，需要查找相關(guān)基因組序列。(2)擴(kuò)增引物與探針的選擇：根據(jù)文獻(xiàn)資料和基因組序列，核實(shí)引物序列和探針序列，或者根據(jù)現(xiàn)有基因組序列，設(shè)計(jì)至少三種引物和探針組合，選擇熒光染料和淬滅分子類型。(2)合成引物和探針 需要了解不同引物廠家的引物合成

4、質(zhì)量， 包括價(jià)格，國(guó)內(nèi)從事DNA合成的廠家很多，一般的 PCR擴(kuò)增引物都可以滿足實(shí)驗(yàn)要求，但更應(yīng)該關(guān)注熒光標(biāo)記探針的質(zhì)量。 陽(yáng)性質(zhì)控品的制備利用陽(yáng)性標(biāo)本的PCF擴(kuò)增產(chǎn)物來制備強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控品(1x106拷貝/ul )和臨界陽(yáng)性質(zhì)控品(1x102拷貝/ul )。(4) 利用實(shí)驗(yàn)用水作陰性質(zhì)控品(5) 陽(yáng)性標(biāo)本和陰性標(biāo)本的選擇：確認(rèn)陰、陽(yáng)性樣品的金標(biāo)準(zhǔn)。(6) 主要原材料的選擇、制備： Taq DNA polymerase 制備或選擇 , 引物合成，探針的標(biāo)記制備。(7) 建立熒光定量PCF擴(kuò)增系統(tǒng)：確定擴(kuò)增反應(yīng)的體積，4xdNTP終濃度，引物濃度，探針濃度，MgC2 濃度，Taq DNA polym

5、erase 用量。(8) 引物探針組合的選擇和參數(shù)優(yōu)化： 利用低拷貝陽(yáng)性質(zhì)控品來驗(yàn)證引物特別是探針的質(zhì)量和效果。調(diào)整PCRT增參數(shù)，包括擴(kuò)增系統(tǒng)的檢測(cè)靈敏度，需要驗(yàn)證熒光信號(hào)的強(qiáng)度，熒光信號(hào)的曲線狀態(tài)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇一個(gè)最好的引物探針組合。(9) 最低檢出量的測(cè)定利用系列稀釋的陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品來確定熒光PCR的最低檢出量。最好用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或者接近病原體的陽(yáng)性自制定量標(biāo)準(zhǔn)品來確定最低檢出量。必要時(shí)可以利用利用現(xiàn)有的一些手段來調(diào)節(jié) PCR系統(tǒng)以便提高PCF檢測(cè)的靈敏度。(10) 陽(yáng)性、陰性參考品的選擇與研制：利用金標(biāo)準(zhǔn)(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品、或用有批文的同類產(chǎn)品或者其它被認(rèn)可的檢測(cè)手段)來選擇陽(yáng)性參考品和陰性

6、參考品，測(cè)定熒光定量PCR式劑盒的檢測(cè)特異性。(11) 檢測(cè)特異性測(cè)定：利用選擇的陰性參考品(陰性標(biāo)本)來檢測(cè)特異性。無該病受檢者檢出的陰性例數(shù)檢測(cè)特異性（100% =x 100%無該病受檢者的總例數(shù)(12)檢測(cè)敏感性測(cè)定：禾用選擇的陽(yáng)性參考品（陽(yáng)性標(biāo)本）來檢測(cè)敏感性。已知患該病檢出的陽(yáng)性例數(shù)檢測(cè)靈敏度（100% =x 100%已知患該病檢出的總例數(shù)(13)樣品處理方法的選擇和建立利用陽(yáng)性臨床樣品來驗(yàn)證樣品處理方法的簡(jiǎn)便性、穩(wěn)定性和核酸提取的質(zhì)量（純度和得率）。（14）測(cè)定精密性：針對(duì)同一陽(yáng)性質(zhì)控品和陽(yáng)性樣品連續(xù)檢測(cè)十次，CVfi 15%（15）試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn)，即把試劑盒放在37C破壞3天后

7、，與未破壞的試劑盒同時(shí)檢測(cè)，測(cè)試試劑盒穩(wěn)定性。3. 參考值（參考范圍）確定4. 制定產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量檢測(cè)的 SOP5. 生產(chǎn)SOP編寫4.按SOP生產(chǎn)工藝生產(chǎn)三批，編制生產(chǎn)紀(jì)錄。5.自我質(zhì)量檢驗(yàn)，編制質(zhì)量檢驗(yàn)紀(jì)錄6. 產(chǎn)品性能評(píng)估等相關(guān)工作分析性能：包括分析靈敏度、分析特異性、測(cè)定范圍、測(cè)定準(zhǔn)確性、批內(nèi)不精 密度、批間不精密度等。臨床性能：臨床性能主要包括臨床靈敏度、臨床特異性等。臨床性能評(píng)估應(yīng)通過臨床試驗(yàn)，臨床研究總樣本數(shù)至少為500例。一般上要做1000例。臨床試驗(yàn)由申請(qǐng)人在提出注冊(cè)申請(qǐng)前完成。7. 申請(qǐng)注冊(cè)檢驗(yàn)&產(chǎn)品研制情況核查9.現(xiàn)場(chǎng)抽樣和注冊(cè)檢測(cè)(第三類產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)進(jìn)行連續(xù) 3個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢測(cè)。注冊(cè)檢測(cè)用樣品由藥品監(jiān)督管理部門在對(duì)生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量管理體系考核合格后現(xiàn)場(chǎng)抽取。)境內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)的進(jìn)行注冊(cè)檢測(cè)，申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)向檢測(cè)機(jī)構(gòu)提出書面申請(qǐng)， 并提