WesternBlot常見(jiàn)問(wèn)題及處理總結(jié)

1、免 疫 細(xì) 胞 研 究 w est e r n b l o tWesternBlot 常見(jiàn)問(wèn)題及處理總結(jié)阿木1、 westernblot 的優(yōu)點(diǎn)答：2、答：靈敏，可達(dá)ng級(jí)，用Ecl顯色法理論 上可達(dá) pg 級(jí)。方便，特異性高。 為什么我的細(xì)胞提取液中沒(méi)有目標(biāo)蛋 白？原因有很多 :a） 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；b）你的細(xì)胞中的蛋 白質(zhì)被降解掉了，你必需加入 PMSF ，抑 制蛋白酶活性；C）你的抗體不能識(shí)別目標(biāo) 蛋白，多看看說(shuō)明，看是否有問(wèn)題。3、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清 亮，為什么呢？答：a）有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻](méi)有變性完全，可以適當(dāng)提高 SDS 濃度，同時(shí)將樣品

2、煮沸時(shí)間延長(zhǎng)，b）也不排除你的抗原濃度過(guò)高，這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可。4、我做的蛋白質(zhì)分子量很小 （10KD ），請(qǐng) 問(wèn)怎么做 WB ？ 答：可以選擇卩ml的膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí) 間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。 其他按步驟即可。5、我的目的帶很弱，怎么加強(qiáng)？ 答：可以加大抗原上樣量。這是最主要 的。同時(shí)也可以將一抗稀釋比例降低。量，降低一抗?jié)舛?，?、膠片背景很臟，有什么解決方法？ 答：減少抗原變一抗孵育時(shí)間，提高牛奶濃度。7、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？HRP 催化答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗 活力太強(qiáng)，同時(shí)你的顯色底物處于一個(gè)臨 界點(diǎn)，反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)，將周圍底物催化 完，形成了

3、空白即 “反亮現(xiàn)象 ”。將一抗和 二抗?jié)舛冉档?，或更換新底物。8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？ 答：如果能夠排除下面的幾個(gè)問(wèn)題那么問(wèn) 題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備a）二抗的HRP活性太強(qiáng)，將底物消耗光；b）ECM 底物中 H 2O2 ，不穩(wěn)定，失活；c）ECL底物沒(méi)覆蓋到相應(yīng)位置；d）二抗失活。9、我在顯影液中顯影 1 分鐘和 5 分鐘后 ,底片漆黑一片 ,是什么原因呢 ?答：a）可能是紅燈造成的，膠片本來(lái)就被曝 光了，可以在完全黑暗的情況下操作 .看是 否有改善 .； b ）顯影時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。10、DAB 好還是 ECM 好？答： DAB 有毒，但是比較靈敏，是 HRP 最敏感的底物； ECM

4、 結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè) pg 級(jí)抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。11、抗原檢測(cè)出的分子量比資料上的大， 是怎么回事？答：a）抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時(shí)間延長(zhǎng)，可以打開(kāi)體。b）蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時(shí) Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么？ 答：可能是：a）樣品濃度過(guò)低；b）轉(zhuǎn)移時(shí) 不夠，。niH!i!i!13、磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加 NaF 等？答： NaF 是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。14、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無(wú)該蛋白的存在

5、，需要做免疫組化和 westernblot 試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？答：免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性，不 易與背景區(qū)分； Westernblot 可以特異性檢 測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是不能 定位。兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí) 驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或 者冰凍切片。!1!15、做 WesternBlot 時(shí)，提取蛋白后凍存 （未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一 抗，開(kāi)始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來(lái)越差，上量已加到120pg換了個(gè)santacloz的一niR!i!1!i!抗仍不行。是什么原

6、因？蛋白酶抑制劑單 加 PMSF 行嗎？ 答：懷疑是樣品問(wèn)題，可能是： 1 ，樣品不 能反復(fù)凍融； 2，樣品未加蛋白酶抑制劑。 同時(shí)，建議檢查 WesternBlot 過(guò)程，提高 一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來(lái)說(shuō)，一 般加 PMSF 就可以了，最好能多加幾中種 蛋白酶抑制劑。17、16、能，沒(méi)有問(wèn)題細(xì)胞水平要做 westernblot ，多少細(xì)胞 提的蛋白夠做 westernblot ？ 答：一般5X106就足夠了 同一樣品能同時(shí)提 RNA 又提蛋白么？ 這樣對(duì) westernblot 有無(wú)影響？ 答：答：同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的WesternBlot 檢測(cè)嗎？當(dāng)然可以，有的甚至可以同

7、時(shí)測(cè)幾十種樣品。18、性。MIR!i!NaF 去抑19、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋 白，操作需要注意什么？ 答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去 垢劑要溫和得多，這時(shí)最好加 制磷酸化酶的活20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不 到 1 微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有 一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染 膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是 顏色變淡了，有什么辦法可以解決？ 答：你可以加大上樣量，沒(méi)有問(wèn)題，還有 轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，加 20甲醇21、想分離的蛋白是分子量 200kd 的，SDS-PAGE 電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易

8、作 WesternBlot 嗎？答： 200kd 的蛋白不好做，分離膠用 7，積層膠。22、如果上樣量超載，要用什么方法來(lái)增 量？答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白地，超載 30是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試的。23、蛋白變性后可以存放多久？80 C,兩年沒(méi)有冋題。最關(guān)鍵兩 不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消 化掉 （也是被酶水解了 ）。我所測(cè)定的蛋白分子量是 105KD ,按 理說(shuō)分離膠應(yīng)當(dāng)采用 % ,但資料卻要求分 離膠和濃縮膠均采用 11的配方,不知為 何？ 述提到的兩種凝膠均可以使用,因。一般答： 條：

9、24、!1!答：為 105KD 的蛋白在上述兩種膠的線性分辨 范圍內(nèi),但需注意條帶位置。 抗是生物素化的抗體,三抗是親和 素生物素體系,不知采用這樣的方案后,25、封閉液是否要作調(diào)整,能否再用 5的脫 脂奶粉呢？好像有資料說(shuō)脫脂奶粉會(huì)影響 親和素生物素的生成,是嗎？始摸條件時(shí)，為了拿到解答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭?中含生物素，用BSA代替應(yīng)該好一點(diǎn). 26、問(wèn)一般一次上樣的蛋白總量是多少， 跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？ 答： WesternBlot 一般上樣 30100 微克不 等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一 二抗的量和孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色 時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開(kāi)陽(yáng)性結(jié)果，各個(gè)步

10、驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間 長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來(lái)了。要拿到好 的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體 不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不 適合 WesternBlot 的怎樣做也不行。!1!27、做組織樣品的 western 的時(shí)候，怎樣處 理樣品？ 答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋 白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白 需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可 能還要分步抽提 （超速離心 ）。還有一點(diǎn)就 是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑 制蛋白酶的活性（加入P MSF）問(wèn)大分子量蛋白 200KD ，在做 western要注意什么呢？做 200kd 蛋白的 WesternBlot 時(shí)要注分離

11、膠最好選擇 >7% 的；剝膠時(shí)要小28、緩沖液來(lái)稀釋31、答： 意， 心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng)；要做分子量 參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。29、有什么方法可以提高上樣量？ 答：a）可以濃縮樣品；增大上樣體積來(lái)增 大上樣量；b）用5倍的 變性 30、蛋白的上樣量有沒(méi)有什么具體的要 求？ 答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定，如果 要求是定量和半定量的 WesternBlot 則上 量要均等，如果只是要定性，則沒(méi)有太 大的關(guān)系，盡量多上就行了，但是不要超 載. 抗，二抗的比例是否重要？ 答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比 例，可以去掉部分非特異的本底。MIR!i!32、要做磷酸化某因子 We

12、sternBlot ，其抗有何要求？答：對(duì)二抗無(wú)要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來(lái)選擇，一般推薦用 HRP 標(biāo)記的二抗33、免疫組化和 WesternBlot 可以用同一種抗體嗎？答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處 理的抗原決定簇 （又稱表位） ，有些表位是 線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不 受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋 白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié) 構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的 抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸， 也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用 于免疫組化和 Western ，而如果抗體識(shí)別 構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。34、WesternBlot 中抗體的可以

13、重復(fù)應(yīng)用 嗎？ 答：抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使 用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用 2 3 次。稀釋后應(yīng)在 2 3天內(nèi)使用， 4 度保 存，避免反復(fù)凍融。HIR35、在做 WesternBlot 時(shí)， PVDF 膜用甲醇浸泡的目的？答： PVDF 膜用甲醇泡的目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟 帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn) 移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的MIRMIK!i!i!36、檢測(cè)同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？答：可以。37、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么 大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢

14、，你延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端 就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變 淡。38、做 WesternBlot 時(shí)，同樣的抗體免疫 組化能做出，而 WesternBlot 卻不能？ 答：這多半是抗體的問(wèn)題，要看抗體的說(shuō) 明，是否能做 WesternBlot 和免疫組化。39、如果是6X8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？答：一抗的稀釋度是有說(shuō)明的，根據(jù)你的 一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育 體積一般最少為 35ml 。40、槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果。答：無(wú)特殊要求。但我們一般是上槽放新鮮的緩沖液，下槽可以是重復(fù)使用過(guò)一兩次的緩沖液NIR!1!i!41、跑電泳的時(shí)候配的膠總是 “縮”是什么

15、 原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？ 答：沒(méi)什么問(wèn)題，就是你膠里的水分被蒸 發(fā)了。過(guò)夜時(shí)拿保鮮膜包起來(lái)，在里面加 點(diǎn)水保持濕度就可以了；也可能母液 （ 30% 聚丙酰胺）有問(wèn)題，你可以重新配制一份觀 察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用 好的試劑。42、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離 小 21KD ，中至 66KD ，大至 170KD ，可以 一次做好嗎？ 答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議： 21kd 和 66kd 可以一起轉(zhuǎn)， 12 SDS-PAGE ，濕轉(zhuǎn) 120mA，45-60min 就可 以了，可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)； 170kd 用 7%SDSPAGE ， 200mA90-120mi

16、n 。甲醇對(duì)43、不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜 上，轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？ 答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20% 甲 醇（是指終濃度） ，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì) 洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和 NC 膜的結(jié) 合能力，甲醇可以防止凝膠變形， 高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩 沖液加入終濃度 %SDS ，也是為了增加轉(zhuǎn) 移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑 的 NC 膜（微米） .o量 Marker 跑走44、我用的是可視 marker ，但是電泳總跑 不全 8 條帶，請(qǐng)問(wèn)什么原因？怎樣改善？ 膠用過(guò) 8， 10， 12，都是這樣。 marker 是新買的 答：一般來(lái)說(shuō)，是小分子 了，增加膠濃

17、度或減少電泳時(shí)間試試看。 當(dāng)然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。45、是否 WesternBlot 實(shí)驗(yàn)半定量一定要加 ACTIN 內(nèi)參？答：對(duì)于發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)最好加內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)。46、核內(nèi)抗原 WesternBlot 內(nèi)參選擇什么 合適？ 答：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中 的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi) 參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。47、做半定量 WesternBlot，內(nèi)參陽(yáng)ctin ,GAPDH 哪個(gè)好？答：選用 beta-actin 就可以。!i!48、想問(wèn)一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制 劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來(lái)源的影 響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？ 答：一般來(lái)說(shuō)提取時(shí)加入廣譜的

18、蛋白酶抑 制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有 文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來(lái)說(shuō)都 沒(méi)有區(qū)別。!1!49、轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是 5% 的TBST 脫脂奶粉 ”，其中 TBST 最后那個(gè) T是 Tween 嗎，濃度多大？答：是Tween，配方如下:Tris-BufferedSal in eTwee n-20 (T BST),N aCl: 8g, Trisbase :加水 800ml 溶解，力口500-1000UI 的 Tween-20,用 HCI 調(diào)節(jié) pH 至,加水定容至 1L.50、封閉，一抗，抗時(shí)的溫度有沒(méi)有什 么規(guī)定呢，比如在室溫里做，或者要在 4 度下? 答：均可在室溫進(jìn)行，如果時(shí)間不夠，一 抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí)，然后4 度過(guò)夜。51、請(qǐng)問(wèn)一下 PVDF 膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來(lái)，結(jié)果較差。PVDF 膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白 接合，同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。 這樣的話， PVDF 膜和蛋白接合較牢，不 易