反義RNA技術原理及在疾病治療中的作用

1、反義RNA技術原理及在疾病治療中的作用 摘要：反義RNA技術是利用反義RNA能夠與特異靶RNA通過配對堿基間氫鍵作用而互補配對，從而在基因復制、轉錄和翻譯3個不同水平上參與基因表達的調(diào)控，來治療各種遺傳性或病毒感染性疾病的一項技術。本文在討論反義RNA技術的作用機制和與反義寡核苷酸技術的比較的基礎上，擬概述反義RNA的作用機制、技術方法與特點、技術運用和存在的問題。相信隨著對基因功能研究的廣泛開展及基因治療研究的深入，反義RNA技術必將成為一種有力的工具，在疾病治療中起到重要的作用。關鍵詞:反義RNA；基因表達調(diào)控；基因治療 反義核酸技術是繼基因克隆和重組技術后分子生物學領域興起的一種全新的技

2、術。該技術由于其核苷酸具有與DNA意義鏈相同的序列且可以選擇性地抑制特定基因的表達而得名。廣義的反義核酸技術包括：反義寡核苷酸技術(antisense oligonucleotides,ASOD)，即直接應用一段人工合成的寡聚核苷酸,通過堿基配對與細胞內(nèi)核酸結合,特異的調(diào)節(jié)基因表達。反義RNA技術(antisense RNA),是利用基因重組技術,構建表達載體，使其離體或在體內(nèi)表達出反義的RNA。核酶技術(ribozyme)核酶是一種可自我催化的特殊的反義RNA，能與靶序列結合并使之裂解，從而對特定基因的表達進行調(diào)控。反義RNA(antisense RNA)是一種本身缺乏編碼能力，但能與特異靶

3、RNA(主要是mRNA)互補的RNA分子，它可通過配對堿基間氫鍵作用與靶RNA的特定互補區(qū)域結合形成雙鏈復合物，抑制靶RNA的功能,從而調(diào)控基因的正常表達1。反義RNA技術的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反義RNA，通過基因重組技術反向插入到合適的表達載體形成重組DNA,然后轉染受體細胞，則這一反向插入的序列就會隨細胞周期產(chǎn)生大量反義RNA,對基因的表達進行調(diào)控,從而抑制、封閉或破壞靶基因的表達。選擇具有明顯的生物學效應的靶序列后,反義RNA即通過和相應的RNA互補而達到阻斷其功能的目的。近20多年來,反義RNA技術已在病毒病、癌癥、遺傳性疾病等疑難疾病的基因治療、動植物品種的改良以及生

4、物研究方法的改進方面取得了令人矚目的成就。本文在討論反義RNA技術的作用機制和與反義寡核苷酸技術的比較的基礎上,擬概述反義RNA的作用機制、技術方法與特點、技術運用和存在的問題。 1反義寡核苷酸技術與反義RNA技術1.1反義寡核苷酸技術 1978年,Zamecnik首先應用一種13個堿基的寡核苷酸抑制Rous肉瘤病毒,取得一定效果1,此后,隨著對其作用機制、特異性及藥理作用等研究的深入,其應用范圍不斷擴大。由于ASOD的易降解性,在實驗中通常要對其進行修飾,硫代反義寡核苷酸作為第一代反義寡核苷酸的代表,由于在細胞毒性、細胞吸收率等方面存在眾多問題,Agrawal等設計了第二代混合骨架的反義寡核

5、苷酸(mixed-backbone oligonucleotides ,MBO),MBO含有至少兩種不同的化學修飾,在結構上可以是任意兩種或多種修飾的不同排列組合。 MBO不僅保持了核酸酶抗性,而且具有很好的靶序列雜交特異性和相對較低的毒副作用2。近年來以2-氨基乙基甘氨酸為基本單元的多肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)由于可與互補的RNA或DNA形成穩(wěn)定的PNA/DNA(RNA)雜合鏈并且具有較強的蛋白酶、核酸酶抗性而預示了其作為反義抑制劑的用途,被稱為第三代反義核酸3,但細胞對PNA的吸收效率較低的問題一直沒有得到很好解決。并且,由于寡核苷酸的半衰期較短,有必要反復

6、應用ASOD。事實上,以上三代寡核苷酸較高的制備成本也是妨礙其廣泛應用的因素之一。同時,在反義寡核苷酸的設計上還較盲目,要設計出高效的反義寡核苷酸并非易事。相對而言,包含反義RNA的重組質(zhì)粒則相當于具有生物兼容性和生物降解性的長期釋放裝置。2 反義RNA作用機制 與ASOD方法相比,設計反義RNA時一般不需要目的基因的詳細的調(diào)控知識,人們普遍應用由翻譯起始位點延伸0.5kb 3.0 kb的片段作為重組質(zhì)粒的(逆向)插入序列。而全長的cDNA序列一般認為沒有必要,尤其當目的基因較長時。另外,互補于3端非翻譯的序列也往往具有很好效果4。在真核生物中,一般認為對應5非編碼區(qū)的反義RNA優(yōu)于針對編碼區(qū)

7、的反義RNA。包含反義核酸的重組質(zhì)粒在細胞內(nèi)轉錄出反義mRNA,發(fā)揮抑制基因表達的作用。目前,具體的作用機制尚不甚清楚,人們推測可能有: 反義RNA的作用機制主要表現(xiàn)在DNA復制、轉錄和翻譯3個水平上。2.1DNA復制中的作用 反義RNA作為DNA復制的抑制因子,與引物RNA結合或作用于引物前體而抑制DNA復制,從而降低DNA的復制效率。E.coli的colE1質(zhì)粒復制的前提是合成適當?shù)腞NA(RNA),它自動折疊后與DNA模板結合形成DNA復制的引物,從復制起始點上游 445bp處開始,以另一DNA為模板反向轉錄的RNA正好與RNA的結合,阻止了正常引物的產(chǎn)生,從而干擾復制的進行。2.2轉錄

8、及轉錄后水平的作用 反義RNA與mRNA 5末端互補結合,阻斷帽子結構形成;作用于外顯子和內(nèi)含子的連接區(qū),阻礙前mRNA剪接;作用于polyA形成位點,阻礙mR-NA的成熟及其向胞漿轉運。在crp基因的ticRNA(transcription inhibitory complementary RNA)負向自我調(diào)控中,ticRNA與crp mRNA的5端結合,形成類似于RNA聚合酶識別的轉錄終止信號的二級結構,以反式作用對轉錄過程本身進行調(diào)控5。2.3翻譯水平的作用 反義RNA可直接與mRNA的SD序列(含RBS)或編碼區(qū)(主要是AUG)結合,從空間上直接阻止核糖體的正常結合或可直接降解靶mRN

9、A。反義RNA與mRNA在SD序列配對形成吻觸復合體或在互補區(qū)段結合形成RNA- RNA雙鏈結構,從而調(diào)控翻譯的進行。在真核生物細胞中有許多RNA在翻譯水平上表現(xiàn)反義RNA的功能。如雞胚胎肌漿中存在的富含U的小分子RNA稱為tcR-NA,它們可以與肌球蛋白重鏈的RNA的polyA尾雜交而抑制正常的翻譯過程。Audrey等6的研究表明FGF- AS RNA在翻譯過程能有效地抑制FGF- 2在哺乳動物細胞中的表達。 反義RNA的重組DNA中只有啟動子及終止子,當轉染細胞后,重組DNA能自動表達反義RNA,并且重組DNA自身可以整合到宿主的基因組DNA中,或作為“附加體”長期存在。在原核細胞中,反義

10、RNA以針對SD序列效果最好,而在真核細胞中以5端非編碼區(qū)為標靶最有效。3 反義RNA技術方法3.1反義表達載體的構建 一般應用RT-PCR技術克隆出部分目的cDNA,并在兩端加上限制性酶切位點倒向插入真核表達載體中,載體一般要含有下游的polyA尾以保證轉錄產(chǎn)物的穩(wěn)定。為確定插入方向可應用限制性內(nèi)切酶酶切或直接測序,曹國棟等人曾介紹一種PCR鑒定重組體DNA插入方向及轉染的方法7,可有效解決酶切困難或無適當位點可供選擇的問題。下面是一些常用的真核表達載體:應用較廣的是含SV40(simian virus 40)、RSV(Rous sarcoma virus)或CMV (cytomegalov

11、irus)的啟動子/增強子的質(zhì)粒載體。尤其CMV的早期啟動子/增強子元件可有效的應用于各種人及鼠源的腫瘤細胞系。含EBV(Epstein-Barrvirus)復制起點的載體,可編碼核抗原(EBV nuclear antigen),可以以“附加體”形式在細胞中復制,避免了整合入染色體基因組所帶來的位置效應。在應用反義RNA技術研究原癌基因在細胞生長、分化及凋亡的調(diào)控機制時,人們發(fā)現(xiàn)反義RNA對一些原癌基因表達抑制的同時抑制了細胞的生長,從而不利于轉化子的篩選8。一種解決辦法是選擇可誘導型的表達載體,使得篩選后在誘導物的誘導作用下表達出反義RNA并發(fā)揮反義作用。1982年,Karin等構建含金屬硫

12、蛋白-型(MT- )啟動子的可誘導型載體,在適當誘導條件下(如Zn2+、Cd2+等)才能啟動下游基因的轉錄9。應用此類載體進行轉染已取得良好效果。構建此類載體時要注意的是誘導物對生物體可能產(chǎn)生的生物學效應,尤其是毒副作用。近年來出現(xiàn)了一類高效且誘導劑生物效應較小的雙載體系統(tǒng),如pVgRXR/pIND(Invitrogen),pTet/pTRE (Clontech),其原理是第一種質(zhì)粒能夠表達能與誘導劑結合的蛋白,細胞在穩(wěn)定轉染了第一種質(zhì)粒后,再轉染第二種含目的基因片段或反義片段的質(zhì)粒,而第二種質(zhì)粒的表達受控于能被第一種質(zhì)粒所表達的蛋白所激活的轉錄啟動子。 pTet/pTRE載體系統(tǒng)已成功地應用

13、于細胞培養(yǎng)及轉基因小鼠10。但對于某些細胞系,四環(huán)素結合蛋白的高表達對其有一定的毒副作用。3.2基因的導入(轉染)磷酸鈣法、電轉法、基因槍是體外實驗中DNA轉染真核細胞的常用方法。脂質(zhì)體不僅常用于體外實驗中載體DNA對細胞系的轉染,也用于體內(nèi)實驗中的轉染過程。脂質(zhì)體能提高分裂細胞和非分裂細胞對核酸的攝取,并保護其不被降解。優(yōu)點是操作簡單,細胞吸收較好。缺點是包埋的DNA量不確定,體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)在特定組織如肝臟吸收的傾向性,及對某些組織如腦有一定毒性。在此基礎上人們逐漸開發(fā)出具有一定良好特性的轉染試劑如pH-敏-脂質(zhì)體。各類受體介導的轉染試劑往往使轉染更接近自然的生理過程(如基于轉鐵蛋白受體介導

14、的核酸轉染試劑),不僅可能降低毒副作用還可因受體的特異分布而具有轉染的組織或細胞特異性。另一種轉化策略是以病毒作為載體,同時利用了病毒的轉染特性。 rAAV-AS(AAV, adeno-associated virus,腺病毒輔助性病毒)以其安全、高效而廣泛應用于反義RNA技術及基因治療。它幾乎可以轉染所有哺乳動物,但對其他動物,如家禽,目前尚未建立起其AAV系;并且,由于它的轉染是細胞膜上受體介導的,哺乳動物的AAV不能用于家禽的轉染11。逆轉錄病毒在快速分裂的細胞中轉染效率也相當高,這使它常被作為載體應用于腫瘤的治療中,它可應用于哺乳動物及禽類。其不足是它只在快速分裂的細胞中起作用,這使它

15、的應用范圍受到一定限制11。一般認為體內(nèi)的轉染需要借助基因的導入系統(tǒng)(gene deliver system),Wolff和Malone等人于1990年用表達-gal及熒光酶基因的質(zhì)粒分別對小鼠肌肉進行直接體內(nèi)注射,在注射區(qū)域的肌細胞檢測到該基因的表達12。直接注射法僅對骨骼肌細胞有效,人們推測可能與骨骼肌的多細胞核、存在胞環(huán)流等結構特性有關。為檢驗轉染效率,人們往往選用-gal或pEGFP等報道基因。3.3檢驗、結果分析 在以反義RNA表達載體進行細胞系的轉染或體內(nèi)實驗時,應設置空載體轉染的對照實驗,以排除外源載體DNA的導入帶來的生物學或免疫學效應。體外實驗中基因產(chǎn)物的活性、細胞的增殖、分

16、化等生物學參數(shù),體內(nèi)實驗中動物本身的一些生物學表型的改變均是不可忽略的重要指標。在此基礎上分子生物學水平的分析主要有以下幾個方面:除了以正義探針檢驗反義RNA的表達情況外,我們更關心的是靶基因的表達情況。應用進行中的核轉錄分析(nuclear run on transcription assay)能夠較可靠的測定基因轉錄活性。對mRNA水平的檢驗方法除了Northern印跡,RNA保護試驗(RNase protection assay)靈敏度更高,并且可以進行較準確的定量分析。由于目前反義RNA抑制靶基因表達的原理尚在研究之中,而反義RNA抑制靶基因表達的過程中并不一定伴隨著mRNA水平的降低

17、13,所以檢測反義抑制效果的較為客觀的標準是相應蛋白水平的變化。 Western印跡,ELISA,流式細胞分析法(flow cytometry)均是常用的分析技術。免疫組化技術、免疫熒光技術由于不能很好的定量而一般避免使用。4 反義RNA技術的特點4.1特異性強 反義RNA在宿主細胞內(nèi)可以特異性地識別、關閉某一基因,阻斷靶基因的表達,甚至可以選擇性地抑制單一啟動子控制的多基因區(qū)內(nèi)某一基因的表達,而不影響其它基因的表達14。4.2操作簡便,靶mRNA范圍廣 可以大量地設計合成反義RNA(或反義RNA片段),僅需要知道病毒、基因或病變細胞的序列信息及其編碼蛋白的功能。多個反義RNA可同時封閉多個基

18、因,在核內(nèi)和胞漿中都能發(fā)揮作用,用于治療多種疾病。4.3安全性好 反義RNA只與特定的mRNA結合,不會因改變基因結構而引起突變,在劑量多的情況下可以被RNase水解。與合成藥物相比,副作用較小。而且將含有反義RNA基因的載體引入原代細胞,可形成持續(xù)穩(wěn)定的感染細胞系,使后代具有遺傳的抗病毒或抗病特性。5反義RNA技術的應用 反義RNA技術已可用來治療由基因突變或過度表達導致的疾病和嚴重感染性疾病。5.1抗癌作用 從癌組織中分離出mRNA,合成相應的反義RNA。將反義RNA引入癌細胞阻止癌基因的表達,抑制癌蛋白的產(chǎn)生,從而可控制細胞的惡性增殖。桑建利等15利用構建了的細胞周期蛋白E反義RNA真核

19、載體轉入人乳腺癌細胞時,也發(fā)現(xiàn)癌細胞成集落能力顯著下降。Steiner等16在反轉錄病毒載體上構建了包括起始位點在內(nèi)的750bp的反義RNA,經(jīng)PA317包裝成反轉錄病毒皮下注入,發(fā)現(xiàn)能抑制裸鼠DN145移植瘤生長94.5%,其中2只小鼠腫瘤消失。Keiichiro等17采用反義RNA阻斷齲齒類動物和人類腫瘤細胞的表型結構形成中,把載有反義RNA的質(zhì)粒轉染入人的乳頭狀瘤病毒(HPV)陰性C33細胞、HPV- 16陽性SiHa細胞和HPV- 18陽性HeLa細胞S3中進行反轉克隆。發(fā)現(xiàn)反義的克隆形成的集落數(shù)明顯少于野生型克隆的集落數(shù)。此結果表明用反義RNA能夠很強地阻斷裸鼠中致癌性細胞。Volk

20、er等18的研究結果同樣也證明了反義RNA能夠有效阻斷HeLa細胞中的基因表達。另有研究表明反義RNA可以通過阻止組織蛋白酶- L的表達進而降低惡性的腫瘤發(fā)生能力19。綜上可見,反義RNA可以特異性地抑制癌基因的異常表達或抑制腫瘤癌細胞特異蛋白質(zhì)的表達,誘導腫瘤癌細胞調(diào)亡,因而可應用于癌癥的發(fā)病機制和治療研究。5.2抗病毒的研究 在治療病毒性感染疾病上,由于病毒核酸的序列比較明確,易于人工合成相應的反義寡聚核苷酸,來抑制病毒基因的表達。反義RNA技術已用于抑制乙肝病毒(HBV)、皰疹病毒(HIV)、AIDS病毒等病毒的研究。Morgan等(1996)的研究表明HIV的反式激活蛋白反應順序(TA

21、R)與TAT蛋白結合可促進HIV轉錄,當用反義TAR封閉TAR時,即可終止HIV的轉錄。姚志強等20針對不同靶位設計了10段互補反義核酸(DNA片段),經(jīng)模型篩選發(fā)現(xiàn)針對S基因起始區(qū)、SP2增強子帽區(qū)和polyA信號編碼區(qū)的asONs作用最強,揭示反調(diào)節(jié)基因轉錄/翻譯起始區(qū)的反義核酸具有明顯的抗病毒作用。Gabor等(1998)使用內(nèi)源性表達抗HIV- 1的pol.vif和enr基因,以及3- LTR序列的反義RNA方案,構建了MuLVLTR啟動子逆轉錄病毒重組質(zhì)粒,轉錄CD4+淋巴細胞系,結果表明反義RNA能高效地穩(wěn)定表達,反義envRNA能夠最有效地抑制HIV- 1的復制,并且反義polR

22、NA使P24抗原減少了100- 1000倍。Carol等21的研究表明,反義RNA能有效地阻斷La Crosse病毒(LCV),并且來自dengne Viruses區(qū)的反義RNA更能有效阻止同源病毒的復制,且阻斷時間和最小片段的反義RNA都能確定,它可以彌補接種等傳統(tǒng)方法存在的不易達到阻止效果和效率較低的缺點。反義RNA還用于研究甲型流感病毒(AIV)及乳頭瘤病毒(HPV)17復制及基因表達的抑制。另外,國內(nèi)外在應用反義RNA技術培育抗病(如豬瘟、抗雞馬立克氏病等)動物品系方面也取得比較明顯的進展。5.3在其它方面的研究 反義RNA技術還可用于腸道疾病(Rotbart etal.,1988)、

23、心血管疾病22、-地中海貧血23、調(diào)節(jié)衰弱心臟中肌細胞的Ca2+泵體內(nèi)平衡24、G蛋白防止高血壓、肝纖維化等多種疾病的研究25。Don-ald等26的研究發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲的clag9基因?qū)D36細胞的粘鏈是必不可少的,而將clag9的反義RNA結構導入3D7克隆中進行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)粘鏈的C32黑素瘤細胞比原始型少15折疊,由此反義RNA也可用于瘧疾的轉染治療。Agnes等27在對高加索人中的一種常染色體隱性疾病(遺傳性血色素沉著)研究中發(fā)現(xiàn),它是由HFE基因編碼MHC分子而造成的,HFE基因的5'端調(diào)節(jié)其表達,采用無開放閱讀框的HFE的反義RNA導入細胞內(nèi),發(fā)現(xiàn)反義RNA在所有試驗的組織和

24、細胞中都得到表達,顯著地抑制了HFE基因的表達。6反義RNA技術應用中的問題 反義RNA技術的研究尚處于初級階段,但迄今的研究結果表明,該技術作為具有高度專一性的基因表達的反義抑制劑是很有希望的。在基礎研究方面,反義RNA技術不僅用于基因分析,還可用來制備C-縮短的多肽,以研究蛋白質(zhì)結構活性關系而無須使基因變異;研究細胞信號傳導、細胞分化及癌變的發(fā)生、發(fā)展過程等等。在應用研究方面,反義RNA藥物可以特異性的抑制癌基因的異常表達或抑制腫瘤細胞特異蛋白質(zhì)的表達,誘導腫瘤細胞凋亡;在抗病原微生物感染方面,針對其特異基因的反義核酸可較好的阻止其對人體的侵害,反義核酸技術用于抗癌、抗病毒的基因療法方面已

25、有大量報道,包括對HIV、HSV等的防治。其他方面,如防治高血壓、肝纖維化等多種疾病。人們正在發(fā)掘更廣泛的應用領域。但反義RNA技術也存在一些問題，下面就是主要的問題。6.1反義RNA片段的特異性問題 多少長度的反義RNA片段才能最有效地結合靶mRNA;對于不同種屬、不同的組織和器官的病變細胞,分別需要設計多少長度的高效反義RNA片段;對應的是5'端還是3'端;是編碼區(qū)還是非編碼區(qū)等問題都需進一步研究,以達到特異性的抑制效果。動物體某一器官、組織或系統(tǒng)中細胞發(fā)生病變往往是個體特定基因的失控或有害基因表達造成的,在基因治療時,必須針對病變的特殊細胞,而對其它細胞影響較小為佳,甚至

26、無影響。因此反義RNA的基因治療必需特異性、專一性地轉移到病變細胞抑制其表達,只有這樣才能最有效地發(fā)揮作用。6.2制備反義RNA的費用和使用效率的問題 應用Q復制酶、體外轉錄等技術合成反義RNA,耗資較大。隨著科技的發(fā)展,準確地合成所需反義RNA的技術一定能得到完善和提高。目前,已經(jīng)在體外合成反義RNA,直接作用于培養(yǎng)細胞,反義RNA在細胞中轉錄而發(fā)揮作用。還有就是構建一些轉錄特異反義RNA的重組DNA,將這些重組DNA轉化細胞,讓其在細胞中轉錄反義RNA而發(fā)揮作用。但反義RNA的堿基序列、反義RNA中無效的長度、含量、靶序列結合部位和反義RNA的濃度等也都影響到使用效率。而且反義RNA和靶m

27、RNA的發(fā)卡、內(nèi)部環(huán)等二級或三級結構以及復雜的環(huán)環(huán)結構都影響反義抑制效率28 30。 7結語 經(jīng)過近20年的研究,反義RNA技術已得到逐步完善并開始應用到醫(yī)療實踐中。目前對反義RNA的轉染效率、特異性及治療時反義RNA的用量、持續(xù)時間和進入機體的有效途徑等都進行了量的研究。采用反義RNA表達載體和受體介導能進一步提高反義RNA的特異性;脂質(zhì)體和含有核酶的嵌合性運送反義RNA;核內(nèi)反義RNA作為治療因子避免了在細胞漿需抑制極其巨大數(shù)量的靶RNA則提高了抑制率,減少了反義RNA用量,擴寬了抑制治療范圍;在體內(nèi)可誘導性調(diào)控序列的嵌入則更加提高了反義RNA技術的應用。在人類基因組計劃完成,后基因組計劃

28、已漸進開展的基礎上,反義RNA技術將不斷改進和發(fā)展,并將在基因的鑒定克隆和各種疾病的治療上發(fā)揮重大的作用。參考文獻:1 Simons R W. Naturally occurring antisense control- A brief reviewJ. Gene, 1988,(72): 35- 44.2 Agrawal S.Proc Natl Acid Sci USA, 1997, 94(6): 2620-2625.3 Hanvey JCet al . Science, 1992,258: 1481-1485.4 Dean Net al . Cancer Res,1996, 56: 3499

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