不同鹽度條件下濕生植物大米草的生長(zhǎng)及生理生化指標(biāo)變

1、不同鹽度條件下濕生植物大米草的生長(zhǎng)及生理生化指標(biāo)變化的研究章競(jìng)子 ,陳城，吳明，田寅輝，常福辰(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京210097)摘要：研究了大米草在低NaCl鹽度（0-26.726%）的條件培養(yǎng)下，其根系活力，可溶性蛋白含量，谷胱甘肽（GSH）含量，超氧化物岐化酶（SOD）活性，丙二醛（MDA）含量及過氧化氫酶（CAT）活性的變化。研究結(jié)果表明，SOD、CAT活性和GSH含量以及可溶性蛋白含量在NaCl為10g/ L濃度下均具有一個(gè)峰，與正常海水（NaCl濃度為26.726g/L）培養(yǎng)條件下所得結(jié)果相近；而在NaCl為0g/ L濃度下，除丙二醛（MDA）含量達(dá)到最高值外，其余各

2、項(xiàng)指標(biāo)均較低。因此，大米草的最適鹽度在1%左右，鹽度為0g/ L時(shí)最不適合大米草的生長(zhǎng)。關(guān)鍵詞：大米草，鹽度脅迫，生理生化指標(biāo)0 引言大米草屬多年生植物大米草（Spartina anglica）于1963年由南京大學(xué)鐘崇信教授從英國引入我國1，2， 19791980年最先在福建、江蘇海濱試種，初衷是抵御風(fēng)浪、保灘護(hù)岸，成效明顯，同時(shí)用于生產(chǎn)飼料和用作造紙?jiān)?。在引種后的20年中大米草得到推廣發(fā)展，從遼寧錦西向南沿中國海岸到達(dá)廣西海灘，到1985年至少栽培有3萬公頃以上，使大米草的分布范圍從溫帶向南擴(kuò)大到了北緯21°27'3。大米草作為先鋒植物在灘涂定居并擴(kuò)展后，可使土壤鹽度降

3、低，更適合其他耐鹽性略低于先鋒植物的其他植物生長(zhǎng)。證明大米草具有明顯的生態(tài)效應(yīng)與經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。大米草的引進(jìn)使灘涂被有效利用，并為周圍居民帶來一定經(jīng)濟(jì)收益。然而，因大米草密集生長(zhǎng)、抗逆性與繁殖力極強(qiáng)，且大米草屬植物為外來物種，在引種地食物鏈中缺乏對(duì)應(yīng)的天敵等限制因素，據(jù)報(bào)道，在90年代后，大米草已遍布沿海80多個(gè)縣，在非引種區(qū)域?yàn)┩柯硬⑿纬蓛?yōu)勢(shì)種群，造成部分地區(qū)生態(tài)失衡，物種多樣性受影響，浮游生物減少，物種多樣性喪失，尤其對(duì)某些經(jīng)濟(jì)貝類影響極大，并威脅某些地區(qū)土著植被紅樹林的生存。這些負(fù)面效應(yīng)亦已引起廣泛關(guān)注和爭(zhēng)議。近年來，針對(duì)如何有效控制大米草及互花米草的生長(zhǎng),國內(nèi)外有相當(dāng)多的研究4-6。肖強(qiáng)等

4、研究了鹽度對(duì)互花米草生長(zhǎng)中一些生理指標(biāo)的影響7-8，初步研究了互花米草的抗鹽保護(hù)機(jī)制。張正仁等8觀察到互花米草的適鹽范圍是0% 3%,最適范圍在1%左右,致死閾值在5%左右。在鹽城地區(qū)沿海灘涂實(shí)地考察中，我們了解到，大米草在潮水不能進(jìn)入的地區(qū)，其生長(zhǎng)受到影響以致死亡。海水的平均鹽度為3.5%，近海的鹽度略低于這個(gè)數(shù)值，其中NaCl約占到海水中鹽類總量的80。根據(jù)Mocledon的人工海水配方(鹽度3.34)中，每千克海水中，NaCl為26.726g。本實(shí)驗(yàn)將NaCl濃度范圍選定在026.726%之間，對(duì)不同濃度的NaCl對(duì)大米草根系活力，可溶性蛋白含量，谷胱甘肽（GSH）含量，超氧化物岐化酶（

5、SOD）活性，丙二醛（MDA）含量及過氧化氫酶（CAT）活性等生理指標(biāo)進(jìn)行比較測(cè)定和研究。從而探討大米草對(duì)鹽分的調(diào)節(jié)機(jī)制，以期有效控制大米草的進(jìn)一步擴(kuò)散，維護(hù)沿海地區(qū)物種多樣性。1實(shí)驗(yàn)材料：大米草（Spartina anglica）材料來源：黃海沿海鹽城段灘涂材料特點(diǎn)：A、 生物學(xué)特征：禾本科大米草屬，多年生草本宿根植物，株高一般為3070厘米，最高可達(dá)1米多。根系發(fā)達(dá)，莖稈直立、堅(jiān)韌、不易倒伏。基部腋芽可萌發(fā)新蘗和生出地下莖，在土層中橫向生長(zhǎng)，然后彎曲向上生長(zhǎng)，形成新株。葉互生，表皮細(xì)胞具有大量乳狀突起，使水分不易透入；葉背面有鹽腺，根吸收的鹽分大部分由這里排出體外。屬泌鹽鹽生植物，具典型的

6、雙細(xì)胞鹽腺。圓錐花序，長(zhǎng)1035厘米，由415枚直立的總狀花序組成；小穗含1小花，長(zhǎng)1418毫米。511月陸續(xù)開花，1012月結(jié)實(shí)，結(jié)實(shí)率低。成熟種子易脫落，無休眠期，可被潮水漂流擴(kuò)散至遠(yuǎn)近各處。種子失水即死、故主要用分株進(jìn)行無性繁殖。B、 生理特征：大米草具有很強(qiáng)的耐鹽、耐淹特性，能在其他植物不能生長(zhǎng)的潮水經(jīng)常淹到的海灘中的潮帶栽植成活，為挺水鹽生植物。因它是濕生植物，故耐旱能力差。在海水淹沒時(shí)間太長(zhǎng)、缺少光照的低灘不能生存。大米草密集成草叢，即可抵擋較大風(fēng)浪。它既能生于海水鹽土，也適應(yīng)在淡水中性土、軟硬泥灘、沙灘上生長(zhǎng)。分蘗力特別強(qiáng)，在潮間第1年可增加幾十倍到100多倍,幾年便可連片成草場(chǎng)

7、。耐高溫，草叢在氣溫4042時(shí)，若水分充足仍能分蘗生長(zhǎng)。不耐倒春寒，當(dāng)夜溫驟降到-10多度時(shí)，將被凍死。耐石油、朵酚油的污染，能吸收汞及放射性元素銫、鍶、鎘等。大米草適生于海灘潮間帶的中潮帶，在風(fēng)浪太大的侵蝕灘面則不能扎根。2、實(shí)驗(yàn)方法：21材料采集、處理及鹽度脅迫培養(yǎng)2.1.1材料采集：采集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大小相近的大米草成熟植株，連根和地下莖挖出，帶土，減少根系損傷。2.1.2栽植：采用分株無土栽培法。將大米草每510株為一叢,分別小心清洗根系泥土后栽植于小型塑料容器中，共計(jì)18份，栽植深度610厘米。栽后模擬自然環(huán)境復(fù)壯1周，保證扎根成活。2.1.3鹽度脅迫培養(yǎng)：以Hogland溶液為溶劑

8、，按（表一）配制人工海水，再分別加入0g，5g，10g，15g，20g，26.726g的NaCl，配制成系列NaCl六組梯度濃度的人工海水營養(yǎng)液。每組分別三盆重復(fù)。使用無土栽培的方式對(duì)大米草進(jìn)行營養(yǎng)液培養(yǎng)，以滅菌后的砂石固定其根部8，9。置光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設(shè)置恒溫24，光照時(shí)段為8：00-20：00（每日晝夜各12h），光照強(qiáng)度4000lux。培養(yǎng)過程中，及時(shí)更換培養(yǎng)液以使各組鹽度達(dá)到所設(shè)定的水平。處理期9天，期間觀測(cè)各組生長(zhǎng)狀況。9天處理結(jié)束后，采集對(duì)應(yīng)位置成熟葉及根系測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。表一（鹽度3.34%）單位g/L （H2O）7 名稱MgCl2MgSO4CaCl2NaHCO3KClNaBr

9、H3BO3g/L2.263.2481.1530.1980.7210.0580.058名稱Na3SiO3Na2Si4O9H3PO4Al2Cl6LiNO3NH3g/L0.00240.00150.0020.0130.00130.00222生理生化指標(biāo)測(cè)定221根系活力的測(cè)定：參照張志良的-萘胺氧化法測(cè)定 14。以對(duì)-萘胺的生物氧化強(qiáng)度（mg -萘胺/gFW·h）表示根系活力的大小。222酶液的提?。?稱取各鹽度培養(yǎng)的植株生長(zhǎng)良好的綠色新鮮葉片各0.5g。2材料加入預(yù)冷研缽中，加入1ml 50mmol/L PH=7.8的磷酸緩沖液，在冰裕下研磨成漿，移入離心管，加入緩沖液至終體積5ml。3將

10、研磨液10000rpm低溫離心10min，收集上清夜，分別分裝入5只Dorf管中，標(biāo)記。4冰箱中冷凍保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。223可溶性蛋白含量的測(cè)定：采用Bradford的考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定15。224谷胱甘肽（GSH）含量的測(cè)定：按照南京建成生物工程研究所提供的試劑和說明方法測(cè)定。225超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定：參照Giannopolitis等的方法，以抑制NBT光化還原50%為一個(gè)酶活性單位16。226過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定：參照Del Rio等的氧電極法進(jìn)行14，以1min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活單位（u）。227丙二醛(MDA)含量的測(cè)定：參照Hea

11、th和Parker的硫代巴比妥酸（TBA）比色法測(cè)定MDA17。丙二醛在酸性和高溫條件下，可與硫代巴比妥酸（ TBA ）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（ 3,5,5 三甲基惡唑 2,4- 二酮），該物質(zhì)在532nm處有最大吸收峰，可用比色法測(cè)量丙二醛的含量。3結(jié)果與討論311不同鹽度培養(yǎng)對(duì)大米草根系活力的影響根系活力=(C1-C2-C)*VT/（t*FW） C為對(duì)照組前后的濃度差VT為總體積，等于50ml,t為1h,FW為0.5g。表2-1-1培養(yǎng)植株說用NaCl濃度5minOD值C1(5min后-萘胺法含量ug/ml)1hOD值C2(1h后-萘胺法含量ug/ml)根系活力ug/gh26.7260.5

12、40 26.500 0.534 26.100 -60.000 200.53926.30.52225.30150.517250.52225.3-70100.532260.55327-20050.532260.48623.911000.554270.53626.2-20圖2-1-1312不同鹽度培養(yǎng)對(duì)大米草可溶性蛋白含量的影響 標(biāo)準(zhǔn)曲線 牛血清的濃度（g/l）OD值牛血清的濃度（g/l）OD值00000.020.010.20.1220.040.0130.40.230.060.0170.60.3860.080.0230.80.5080.10.02910.688表2-1-2培養(yǎng)植株所用NaCl濃度g/

13、lOD1可溶性蛋白1g/lOD2可溶性蛋白2g/l00.210.320.2420.3850.3020.480.3670.59100.4630.720.4640.72150.4160.640.2950.47200.2230.350.270.4226.7260.4480.70.410.63 圖2-1-2313不同鹽度培養(yǎng)對(duì)大米草GSH含量的影響表2-1-3-1OD值OD值標(biāo)準(zhǔn)管0.102空白管0.050g/l測(cè)定管0.1180g/l空白管0.0965g/l測(cè)定管0.1315g/l空白管0.10610g/l測(cè)定管0.1410g/l空白管0.11215g/l測(cè)定管0.115g/l空白管0.07920g

14、/l測(cè)定管0.11320g/l空白管0.10126.726g/l測(cè)定管0.1426.726g/l空白管0.136提取液中GSH的含量=標(biāo)準(zhǔn)管濃度*（測(cè)定管OD-測(cè)定空白管OD）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管OD）其中標(biāo)準(zhǔn)管濃度為0.5mmol/l?？傻?表2-1-3-2培養(yǎng)植株說用NaCl濃度g/lGSH含量mmol/l00.21250.245100.275150.206200.11826.7260.039 圖2-1-3314不同鹽度培養(yǎng)對(duì)大米草可溶性蛋白含量的影響一個(gè)酶活力單位定義為將NBT的還原抑制到對(duì)照一半（50%）時(shí)所需的酶量SOD的總活性=(A0-AS)*VT/( A0*0.5*FW*V1)

15、 A0為對(duì)照管的吸光值，AS為測(cè)定管的吸光值，VT為酶提取液的總體積（ml）；由實(shí)驗(yàn)可知此處為5ml。V1測(cè)定用粗酶液體積（ml）；此處為aml.FW樣品鮮重（g）；由實(shí)驗(yàn)可知此處為0.5g。表2-1-4培養(yǎng)植株所用NaCl濃度g/la=30ul時(shí)ODa=30ul時(shí)總活力U/ga=50ul時(shí)ODa=50ul時(shí)總活力U/ga=100ul時(shí)ODa=100ul時(shí)總活力U/g00.34244.80.2821660.37249.150.34244.80.272174.30.36452.3100.32270.70.2412000.36551.9150.35232.50.301150.20.37547.92

16、00.45110.70.269176.80.41133.326.7260.29312.50.239201.70.35556對(duì)照管0.540.4820.493不同鹽濃度對(duì)大米草SOD活性的影響0501001502002503003500102030培養(yǎng)植株說用NaCl濃度g/l總活力U/ga=30ula=50ula=100ul 圖2-1-4315不同鹽度培養(yǎng)對(duì)大米草MDA含量的影響表2-1-5-1OD值OD值標(biāo)準(zhǔn)管0.081空白管0.0160g/l測(cè)定管0.030g/l空白管0.0075g/l測(cè)定管0.0175g/l空白管0.00310g/l測(cè)定管0.02110g/l空白管0.00415g/l測(cè)

17、定管0.01615g/l空白管0.00320g/l測(cè)定管0.01620g/l空白管0.00226.726g/l測(cè)定管0.01626.726g/l空白管0.003OD值2OD值2標(biāo)準(zhǔn)管0.081空白管0.020g/l測(cè)定管0.040g/l空白管0.0095g/l測(cè)定管0.0275g/l空白管0.00710g/l測(cè)定管0.02210g/l空白管0.00115g/l測(cè)定管0.01615g/l空白管0.00220g/l測(cè)定管0.01920g/l空白管0.00526.726g/l測(cè)定管0.01226.726g/l空白管0.003提取液中MDA的含量=標(biāo)準(zhǔn)管濃度*（測(cè)定管OD-測(cè)定空白管OD）/（標(biāo)準(zhǔn)管O

18、D-空白管OD）其中標(biāo)準(zhǔn)管濃度為10mmol/l。 表2-1-5-2培養(yǎng)植株說用NaCl濃度g/lMDA含量mmol/l(1)MDA含量mmol/l(2)03.545.0852.153.28102.623.441522.3202.152.326.72621.48圖2-1-5316不同鹽度培養(yǎng)對(duì)大米草CAT活性的影響表2-1-6培養(yǎng)植株說用NaCl濃度g/l0min1min2min3min4min5minCAT的活力U/gmin01.5061.5021.4991.4981.4991.4990.751.7451.7551.7421.741.7381.7351101.9431.9391.9391.9

19、391.9321.9281.5151.4471.4431.4411.4381.4371.4351.2201.2581.2561.2511.251.251.2490.926.7261.871.8661.8571.861.8571.8541.6圖2-1-632 討論我們認(rèn)為在大米草脫離了原始生活環(huán)境（海水均濃度為26.726g/l）時(shí)，受到了低鹽脅迫后，機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)揮作用，在10g/l濃度下具有最高的抗氧化能力，也有可能具有較高的調(diào)節(jié)能力，這與正仁等4發(fā)現(xiàn)互花米草鹽度最適范圍在1%左右是一致的；而其他濃度處活性低可能由于受脅迫時(shí)消耗有關(guān)。GSH含量在10g/l濃度也具有一個(gè)峰，但在26.7

20、26g/l濃度下含量卻最低，這有可能說明在正常情況下，GSH在抗氧化時(shí)不是起主要作用，而在脅迫時(shí)有重要的抗氧化作用。SOD,CAT屬抗氧化酶系統(tǒng)，可以分別除去O2.-，H2O2。GSH是一種低分子清除劑，可清除O2.-，H2O2,它是組織中主要的非蛋白的巰基化合物，能穩(wěn)定含巰基的酶及其它蛋白酶，使它們免受氧化損傷，從而降低了膜脂過氧化作用。缺乏或耗竭GSH會(huì)促使許多化學(xué)物質(zhì)或環(huán)境因素對(duì)生物體產(chǎn)生中毒作用或加重中毒作用。因而， SOD,CAT活性大小及GSH含量多少是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素。如圖2-1-4和圖2-1-6所示，SOD,CAT活性隨培養(yǎng)用鹽度的下降均先降后升再降，并于10g

21、/l濃度處有一個(gè)峰，我們認(rèn)為在大米草脫離了原始生活環(huán)境（海水均濃度為26.726g/l）時(shí)，受到鹽脅迫后，機(jī)體生命活動(dòng)受抑制，其后，由于機(jī)體自身調(diào)節(jié)能力，抗氧化系統(tǒng)被激活，并在10g/l濃度達(dá)到峰值，這與正仁等4發(fā)現(xiàn)互花米草最適范圍在1%左右是一致的。GSH含量在10g/l濃度也具有一個(gè)峰，但在26.726g/l濃度下含量卻最低，這有可能說明在正常情況下，GSH在自然狀態(tài)抗氧化時(shí)不是起主要作用，而在脅迫時(shí)有重要的抗氧化作用。可溶性蛋白的成分主要為各種酶類。本實(shí)驗(yàn)主要在0-3%低鹽度情況下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)曲線與SOD,CAT活性曲線較一致，可以認(rèn)為可溶性蛋白含量的變化反映了大米草中抗氧化酶的變化。隨鹽

22、度降低大米草所含可溶性蛋白下降，可能是因?yàn)樯顒?dòng)受抑制以及細(xì)胞調(diào)控滲透壓的需要；而其后上升至10g/l濃度時(shí)含量為峰值進(jìn)一步說明了在此濃度下大米草具有最高的調(diào)控能力。MDA是一種脂質(zhì)過氧化物。機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物，通過鏈?zhǔn)交蜴準(zhǔn)街ф湻磻?yīng)放大活性氧的作用。氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化而引起細(xì)胞的損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞的損傷，因而，MDA的含量常?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞的損傷程度。在本實(shí)驗(yàn)中，MDA變化曲線表明：在正常海水濃度下培養(yǎng)大米草的細(xì)

23、胞損傷程度最低，隨著鹽度地降低，細(xì)胞損傷程度依次升高，并在0g/l(淡水)濃度下細(xì)胞損傷程度最高。此外，SOD、CAT活性和GSH含量以及可溶性蛋白含量在0g/l濃度下均較低，可以說明在此鹽濃度下不適合大米草的生長(zhǎng)；而在10g/l濃度下MDA的含量也比較高，與此濃度下的高抗氧化能力相矛盾，這可能是由于培養(yǎng)的時(shí)間較短（9天），大米草生活環(huán)境改變之后還處在適應(yīng)期間，細(xì)胞的早期損傷較大。4結(jié)論1SOD、CAT活性和GSH含量以及可溶性蛋白含量在10g/l濃度下均具有一個(gè)峰，說明該鹽度下植物具有較高的調(diào)控能力。2SOD、CAT活性和GSH含量以及可溶性蛋白含量在10g/L鹽度以下均下降至0g/L時(shí)最低

24、，此階段細(xì)胞損傷程度加深，不適應(yīng)大米草的生長(zhǎng)，因而可以采取用淡水圍淹的方法限制大米草的生長(zhǎng)。由于實(shí)驗(yàn)只能部分模擬野生環(huán)境條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果必然有局限性；材料數(shù)量及實(shí)驗(yàn)時(shí)間限制重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的次數(shù)，影響結(jié)果的普遍性；只能對(duì)大米草屬兩種植物的生命周期中的某一階段進(jìn)行研究，有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)：1 鐘崇信 大米草簡(jiǎn)史及國外研究概況 南京大學(xué)學(xué)報(bào)（米草研究的進(jìn)展）,1-302 欽佩,鐘崇信 米草的應(yīng)用研究 北京：海洋出版社 1-1583 吳敏蘭,方志亮 大米草與外來生物入侵. 福建水產(chǎn)，2005年3月第1期4 秦衛(wèi)華，王智，蔣明康.互花米草對(duì)長(zhǎng)江口兩個(gè)濕地自然保護(hù)區(qū)的入侵j. 雜草科學(xué)，2004，（4）：15-16.5 陳中義，李博，陳家寬. 米草屬植物入侵的生態(tài)后果及其管理對(duì)策j. 生物多樣性，2004，12（2）：280-289.6 張東，楊明明，李俊祥等. 崇明東灘互花米草的無性擴(kuò)散能力j. 華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，（2）：130-135.7 肖強(qiáng),鄭海雷,陳瑤等 鹽度對(duì)互花米草生長(zhǎng)及脯氨酸、可溶性糖和蛋白質(zhì)含量的影響生態(tài)學(xué)雜志Chinese Journal of Ecology2005,24(4):37337 8 張正仁,經(jīng)美德,欽佩,等.自動(dòng)沙培裝置下互花米草 (Spartina alterniflor