2019年貞清方調節(jié)SREBP

1、貞清方調節(jié)SREBP-lc減少糖尿病大鼠腎臟脂質沉積文秀英，1許明旺，2胡勤瑾，3羅瓊，3魯敏，3（1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院中西醫(yī)結合科，武漢430077;2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院老年醫(yī)藥學研究所；3.華中科技大學同濟醫(yī)學院碩士研究生） 摘要：目的 探討貞清方對糖尿病大鼠腎臟脂質代謝的調節(jié)作用及其分子機制。方法高糖高脂飼料加低劑量鏈脲佐菌素注射制備2型糖尿病大鼠模型，將成模大鼠分為：貞清方組、二甲雙胍組、模型組，另設正常對照組，每組18只大鼠。分別在治療8周和12周時檢測大鼠的腎皮質 TG含量。12周時，采用RT-PCR 檢測腎皮質固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c （ S

2、REBP-1C）和脂肪酸合成酶（FAS）的 mRNA表達，同時，檢測血糖、血甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）和尿微量白蛋白排泄率（UAE），腎臟行HE染色、在光鏡下作腎組織形態(tài)學觀察。結果8周時模型組腎皮質TG含量有增高的趨勢，但與正常組比較無顯著性差異 （P>0.05）,兩治療組的腎皮質TG含量與正常組比較無明顯變化。12周時，與正 常組相比，模型組大鼠腎皮質TG含量顯著升高（P<0.01）,且SREBP-1C和FAS mRNA的表達明顯上調（P<0.01）。貞清方組和二甲雙胍組腎皮質 TG含量較模 型組明顯減少（P<0.01）。貞清方組SREBP-1C mRNA的

3、表達非常顯著低于模型 組（P<0.01）,二甲雙胍組的SREBP-1C mRNA表達亦低于模型組（P<0.01），但 高于正常組（P<0.05）。貞清方組和二甲雙胍組的FAS mRNA表達均顯著低于模 型組（P<0.01）。與模型組比較，兩治療組血糖、TG和UAE明顯下降（P<0.01）， TC亦下降（PV0.05）。貞清方組和二甲雙胍組的腎臟病理改變較模型組減輕。結論 貞清方可通過下調糖尿病大鼠腎組織 SREBP-1C及其下游基因FAS mRNA 的表達，減少腎臟的脂肪沉積，改善腎功能和形態(tài)學改變。關鍵詞：貞清方；糖尿病腎病；固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c ;脂肪酸

4、合成酶基金項目：國家自然基金資助項目（30672730）作者介紹：文秀英，女，博士，教授，主任醫(yī)師。*通訊作者： 許明旺，女，副主任藥師，Telemail:haile n2006Zhenqing Recipe Reduce Lipid Accumulation in Diabetic Rat Kidneyby Regulating Expression of SREBP-1c mRNAWEN Xiu-ying, XU Ming-wang ， HU Qin-jin, ( Liyuan Hospital , Tongji Medical College， Huazhon

5、g University of Science and Technology, Wuhan 430077, Chin)a ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate Zhenqing Recipe(ZQR) in regulation of renal lipid metabolism and its molecular mechanisms. Methods Type 2 diabetic rat model was established with feeding high-glucose and high-fat diet, and injecting low

6、dose streptozotocin. The model rats were divided into: untreated model group, ZQR group, metformin group, normal rats served as control, 18 rats in each group. At week 8 and week 12 after treatment, TG contents in renal cortex were measured. And at week 12, the expression of sterol regulatory elemen

7、t binding-protein- 1c (SREBP-1c ) and fatty acid synthase (FAS) mRNA were detected by RT-PCR. Meanwhile, fasting blood glucose (FBG), total triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) and urine albumin excretion (UAE) were measured. Kidney histomorphology was observed by the light microscope with H

8、E staining. RESULTS At week 8 , the level of TG in renal cortex had a tendency to increase in model rats, however, there was no difference with control ( P>0.05). And the level of renal TG showed no obvious change in two treated groups. At week 12 , the renal TG was higher in untreated model rats

9、 compared with control( P<0.01). In contrasted to control, expression of SREBP-1c and FAS mRNA in model group were up-regulated (P<0.01). Contents of renal TG in ZQR and metformin groups were decreased compared with model group ( P<0.01). The expression of SREBP-1c was significantly down-re

10、gulated in ZQR group than model group (P<0.01). And expression of SREBP-1c mRNA in metformin group was also decreased compared with model group(P<0.01)， but it is higher than control( P<0.05). Both treated groups showed lower level of FAS mRNA than those of model group (P<0.01). The leve

11、l of FBG, TG and UAE in two treated groups was significantly decreased(P<0.01), and TC was also lower than those of model group ( P<0.05). Pathological changes were ameliorated in ZQR and metformin groups compared with model group. CONCLUSION ZQR decrease renal fat deposit through down-regulat

12、ion of SREBP-1c and FAS mRNA expression in type 2 diabetic rats. Therefore, it improve renal function and morphology.KEY WORDS : zhenqing recipe; diabetic nephropathy ;sterol regulatory element binding-protein- 1c; fatty acid synthase糖尿病狀態(tài)異常的脂質代謝引起腎臟脂質沉積在糖尿病腎?。―N ）的發(fā)病及病理進程中起著重要作用 。DN的血脂異常表現(xiàn)為TG、TC、LD

13、L-C升高， HDL-C 下降， VLDL 可增高 2,3。脂質代謝異?？沙霈F(xiàn)脂質在腎臟沉積、直接損傷腎臟4,5;還引起TG1B i的表達增強、誘導腎小球系膜細胞外基質大量合成 1；腎小球脂質沉積，單核 - 巨噬系統(tǒng)吞噬增加 , 泡沫細胞形成，發(fā)生類似于動 脈粥樣硬化的血管損傷，導致腎小球硬化與腎功能受損 3,6。固醇調節(jié)元件結合蛋白（ Sterol Regulatory Element-binding Protein，SREBP）屬于堿性-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸鋅指（bHLH-ZIP）轉錄因子，在調節(jié)脂 肪合成、脂肪酸自穩(wěn)態(tài)和組織細胞脂肪沉積方面起關鍵作用 7,8。SREBPs家族由 SRE

14、BP-1和 SREBP-2兩個成員組成 ,SREBP-1有兩個亞型： SREBP-1a和 SREBP-lc亞型SREBP-lc位于17pll.2 染色體,SREBP-1（作用于脂肪酸合成酶（FAS等靶基因，控制游離脂肪酸和甘油三酯的生物合成，在糖尿病腎病的發(fā)病中介導TG在腎臟沉積10。 過度表達SREBP - 1c的PEPCK -promotor 轉基因小鼠，顯現(xiàn)系膜增生、基質積聚，蛋白尿增加 11。前人對SREBP-1C及其靶基因FAS與糖尿病腎病的關系的研究主要是對STZ誘導的 1 型糖尿病大鼠和基因鼠的研究 1,11。人類糖尿病 95%為 2 型糖尿病，其 發(fā)病與高糖高脂飲食有關， 目前

15、用高糖高脂誘導再加小劑量鏈脲佐菌素注射所致 的2型糖尿病模型已在國內外得到認可12,13，這種模型的腎臟SREBP-1c的表達 情況如何還未見報道。 本次實驗采用高糖高脂加小劑量鏈脲佐菌素注射所致的 2 型糖尿病模型，在我們以前證實貞清方對這種 2型糖尿病大鼠腎臟病變有防治作 用的基礎上14 ，研究貞清方對SREBP-1c及其下游基因FAS的調節(jié)作用，進一步 探討貞清方防治DN的分子機制。1材料與儀器1.1 實驗動物純系7周齡雄性Wistar大鼠（清潔級）72只，體重150170g。購自湖北省醫(yī) 學科學院實驗動物中心， 飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院清潔級動 物房，標準飼料喂養(yǎng)，自由

16、飲水。1.2 藥品與試劑 葡萄糖、甘油三酯和膽固醇試劑盒（北京北化康泰臨床試劑有限公司） ，鏈 脲佐菌素 （美國 Sigma 公司）, 尿微量白蛋白放射免疫分析測定盒（北京北方生物 技術研究所）。Trizol、MMLV 逆轉錄酶、RNAase Inhibitor、dNTP 和 Oligo（dT）（日本 TOYOBO 公司），TaqDNA 聚合酶、DNA Marker I （北京 TIANGEN 公 司），引物序列（美國 Invitrogen 公司）。鹽酸二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥公司） 。女貞子、山藥和地龍等中藥飲 片（武漢銀杏中藥飲片廠） 。1.3 儀器AU-400 全自動生化儀（日本 O

17、lympus 公司）， PCR 儀（德國 Eppendorf 公 司），GENEGENIUS成像儀（美國 GENE公司）,5415R型4C離心機（德國 eppendorf 公司）， UV4802H 型紫外可見分光光度儀（上海尤尼柯儀器有限公 司），顯微鏡及顯微攝像儀（日本 Olympus 公司）。2 方法2.1 藥物制備貞清方中的女貞子和山藥等植物藥采用水煮醇沉法， 過濾濃縮， 以提取干膏 收率和齊墩果酸 （女貞子的主要成分） 作為綜合評價指標； 地龍采用水提、 濃縮， 以次黃嘌呤作為控制指標。將提取液混合即得貞清方提取液，配置液為 3g 生藥 /ml， 40C 保存。二甲雙胍用蒸餾水配制成3

18、0mgml-1的混懸液，4°C保存。2.2 動物模型的建立、分組及處理隨機將大鼠中的 1 8只用于作正常對照組， 喂以常規(guī)飼料；另 54只用于建立 2 型糖尿病模型 12，高糖高脂飲食喂養(yǎng) 1 個月后，給予 30mg/kg 鏈脲佐菌素（STZ）（用0.1mol L-1檸檬酸緩沖液配制成2%溶液，pH4.4） 次性腹腔注射，1周后尾靜脈采血測空腹血清血糖，以空腹血糖大于11.1mmol/L,定為造模成功。分組：糖尿病模型大鼠分為貞清方組，給予貞清方提取液26gkg-1 d-1灌胃；二甲雙胍組，給予二甲雙胍混懸液 150mg- kg-1 d-1 ;模型組和正常組給予蒸餾水灌 胃。每組均為

19、 18只大鼠。各組均于每天上午 8-10時灌胃一次。治療持續(xù) 12周， 每周稱重一次，根據(jù)體重變化調整給藥劑量，每月觀察攝食量和飲水量的變化。2.3 標本收集分別于注射STZ后1周、造模成功后給藥12周尾靜脈采血(采血時間均為 上午 8 時)，分離血清，用于測血糖和血脂。用藥第 8周，每組各取 6只大鼠，斷頭處死，迅速打開腹腔 , 游離并摘除腎 臟,放置-80r冰箱凍存，用于檢測腎皮質 TG含量。其余大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)。用藥第12周，各組以代謝籠收集24h尿，用二甲苯防腐，記錄尿量，混勻 后留取少量尿標本放置 -200C 冰箱中，用于測尿微量白蛋白。 最后斷頭處死大鼠， 迅速打開腹腔 ,游離并摘除雙

20、腎 ,左腎去包膜后沿正中剖開 , 置于 10%中性福爾馬 林液中固定，用于作病理檢測。右腎立即置液氮中、繼之移置-0C冰箱凍存，用于作 SREBP-1c 和 FAS mRNA 表達檢測，以及腎皮質 TG 測定。2.4 指標檢測2.4.1 生化指標的測定血糖用葡萄糖氧化酶法；血脂用酶偶聯(lián)比色法；尿微量白蛋白(UAE) 檢測用放射免疫法。2.4.2 組織病理學觀察腎組織經(jīng) 10%的福爾馬林液固定后 ,常規(guī)石蠟包埋，制作連續(xù)切片、厚約 4呵，分別行HE染色。光鏡下觀察腎組織形態(tài)學改變。2.4.3 腎皮質 TG 含量測定參考Folch方法15:從-80 C冰箱中取出腎臟，切取同一部位腎皮質100mg，

21、 加入20倍體積(2ml)氯仿甲醇(2: 1)勻漿液，冰浴勻漿后，于室溫下緩慢搖動 過夜，3000r min-1離心10min,取上清液加入0.2倍體積生理鹽水，充分混勻，-1靜置10min后3000r min離心10min，除去上層液相，下層有機相在真空抽干機 中抽干后加入1ml無水乙醇充分溶解后在自動生化儀上檢測 TG含量，同時設置 空白無水乙醇對照。2.4.5 RT-PCR測定腎皮質 SREBP-1C mRNA和 FAS mRNA勺表達從80C冰箱中取出腎臟，切取少量腎皮質，提取總RNA，用紫外分光光度計測定OD260、OD280,計算比率及RNA濃度。每個樣本取總 RNA 5ug, 2

22、0ul 反應體系逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增。目的基因的引 物和內參照B -actin引物設計根據(jù)其核苷酸序列、用 Primier 5.0軟件設計，序列 如下：SREBP-lc：上游弓I物：5'-GGAGCCATGGATTGCACATT-3 '下游弓I物：5'-AGGAAGGCTTCCAG AGAGGA-3 'FAS:上游弓I物：5'-CTGGACAGCATTCCAAACCT-3 '下游弓I物：5' -GGCTC TGGTGGCTTCTAGTG-3 'B -actin： 上游弓 I物：5'-CCAA

23、GGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3 ' 下游弓I物：5'-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3 '反應總體積為25ul，其中10duffer 2.5ul, dNTP 2ul，上下游引物各1.0ul， TaqDNA 聚合酶 0.5ul，cDNA 模板 1ul，DEPC18ul。PCR 反應條件：94C預變 性 5min, 94C變性 45s, 57C退火 45s, 72C延伸 1min, 72C后延伸 7min,共 30個循環(huán)。PCF產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠（含goldview50卩l(xiāng) L-1）電泳，B -actin 為內參照，用ge nes

24、n ap紫外凝膠系統(tǒng)攝像，gen etools進行圖像分析，確定條帶 的質量值（quantity）,結果用目的基因的質量值/ B -actin的質量值表示。3統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,結果以x_s表示，多組間均 數(shù)的比較采用One-Way ANOVA，組間均數(shù)的比較采用q檢驗。4結果4.1動物的一般情況成模后各組表現(xiàn)出多飲、多食、體重增加，治療后二甲雙胍組和貞清方組的 攝食量、飲水量和體重明顯低于模型組（數(shù)據(jù)從略）。實驗過程中正常組有1只 被咬傷剔除，模型組有2只死亡，二甲雙胍組和貞清方組各有 1只死亡。4.2 給藥12周各組大鼠血清 FBG、TG、TC和UA

25、E的比較（見表1）治療12周后，與模型組比較，貞清方組和二甲雙胍組 FBG和TG均顯著降 低（P<0.01）、TC含量亦降低（P<0.05）、UAE非常顯著減少（P<0.01）。表1貞清方治療12周對大鼠FBG、TG、TC和UAE的影響，x -sTab. 1 Effects of ZQR on FBG, TG, TC and UAE level in type 2 diabetic rats after12 weeks treatment x 二 sFBGTGTCUAEn (mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)(ug/24h)Co ntrol114.51±

26、.720.85±.491.79±.6169.72±8.06Model1016.29±.70 2)1.86±.23 2)4.98±.82 2)596.7496.52 2)Metformin1010.37±.12 2) 4)1.27±.19 1) 4)4.36±.69 2) 3)255.9583.73 2)4)ZQR109.46±.93 2) 4)1.12±.17 1) 4)4.23±.66 2) 3)239.8291.96 2)4)注：與正常組比較1)P<0.05, 2)

27、P<0.01 ;與模型組比較3)P<0.05, 4)P<0.01。1)2)3)Note: compared with control group,P<0.05, P<0.01; compared with model group, P<0.05,4)P<0.014.3腎臟的組織形態(tài)學變化：正常組腎組織結構清晰，模型組腎小球系膜細胞和細胞外基質增生、基底膜 增厚、腎小球節(jié)段性硬化；二甲雙胍組和貞清方組腎小球體積較正常增大，但系膜基質增生及基底膜增寬較模型組有明顯改善，未見明顯的腎小球硬化(圖 1)。ABCD圖1各組大鼠腎小球的形態(tài)改變,HE染色(X 40

28、0)A.正常組；B模型組；C.二甲雙胍組；D.貞清方組。Fig.1 Morphological changes of glomeruli stained with HE( 400) XA - Con trol; B - Model; C - Metfor min; D - ZQR同時，對腎小管也進行了觀察，光鏡下見正常組腎小管結構清晰，腎小管上 皮細胞胞漿紅染，核藍。模型組腎小管上皮細胞出現(xiàn)重度脂肪變性和水樣變性， 細胞體積明顯增大，細胞界限不清，胞漿透明，整個細胞膨大如氣球，故又稱氣 球樣變。二甲雙胍組和貞清方組腎小管上皮細胞輕度水樣變性及脂肪變性，細胞體積輕度增大，胞漿淡染，較透明，胞核顏

29、色變淡(見圖 2)。ABCD圖2各組大鼠腎小管的形態(tài)改變，HE染色（X 400）A.正常組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.貞清方組。Fig.2 Morphological cha nges of renal tubules stai ned with HE（400） A - Con trol; B - Model; C - Metfor min; D - ZQR4.4各組大鼠腎皮質TG含量比較（見表2）成模第8周，模型組腎皮質TG含量有增高的趨勢，但無顯著性差異（P>0.05）, 兩治療組的腎皮質TG含量與正常組比較無明顯變化。12周時，模型組大鼠腎皮 質TG含量顯著升高（P<0

30、.01）,二甲雙胍組和貞清方組腎皮質 TG含量較模型 組明顯減少（P<0.01）。表2不同治療時程大鼠腎皮質 TG的變化，來二S，mg/100mg kidney tissueTab. 2 Chan ges of renal TG contents inrats at differe nt time course of treatme nt,X： s， mg/100mg kidney tissueWeek 8Week 12nTGnTGCo ntrol60.154 ±063110.169 ±057Model60.189 ±074100.294 ±087

31、 1)Metformin60.150 ±059110.201 ±079 2)ZQR60.162 ±061110.195 ±075 2)注：與正常組比較1)P<0.01 ;與模型組比較2)P<0.011） 2）Note: compared with control group, P<0.01 ； compared with model group, P<0.01 4.5腎皮質SREBP-1c和FAS mRNA的表達模型組SREBP-1c和FAS mRNA的表達顯著高于正常組（P<0.01）。與模型 組比較，貞清方組SREBP-

32、1c mRNA的表達非常顯著下調（P<0.01），二甲雙胍 組的SREBP-1c mRNA表達亦顯著下調（P<0.01），但仍高于正常組（P<0.05）。 貞清方組和二甲雙胍組的FAS mRNA表達均顯著低于模型組（P<0.01），見表3、 圖3。表3貞清方對大鼠腎皮質 SREBP-1C和FAS mRNA表達的影響， X _ STab. 3 Effects of ZQR on SREBP-1c and FAS mRNA levelin rats kidney, X _ snSREBP-1cFASCo ntrol110.308 ± 0.0530.268 

33、7; 0.037Model100.581 ± 0.0662)0.489 ± 0.051 2)Metformin110.362 ± 0.0501) 3)0.308 ± 0.045 3)ZQR110.326 ± 0.054 3)0.315 ± 0.048 3)注：與正常組比較 *P<0.05, *P<0.01 ;與模型組比較AAP<0.011) 2)Note: compared with control group, P<0.01, P<0.01 ； compared with model group, 3)

34、P<0.013 -actinSREBP-1cCAD Marker100 bp200 bp300 bp400 bp500 bp600 bp100 bp200 bp300 bp400 bp500 bp600 bp100 bp200 bp300 bp400 bp500 bp600 bp圖3各組大鼠腎 SREBP-lc和FAS mRNA 表達FASSREBP-1c, 191 bp； FAS, 397 bp； 3 -actin, 589 bp。A.正常組；B.模型組；C.二甲雙胍組；D.貞清方組。Fig. 3 SREBP-1c and FAS mRNA expressio n in rats ki

35、d neySREBP-1c, 191 bp； FAS, 397 bp； 3 -actin, 589 bp。A - Con trol; B - Model; C - Metfor min; D - ZQR5討論本實驗用高糖高脂加小劑量STZ制備了 2型糖尿病大鼠模型，于造模成功后 的第8周檢測各組中部分大鼠的腎組織 TG含量，模型組腎TG有增高的趨勢，但 與正常組比較無顯著性差異， 說明在 8 周時腎臟的脂質沉積不嚴重。 造模成功后 的第 12 周模型組腎組織 TG 含量顯著增高。模型組大鼠的腎臟病理學檢查可見 腎小球系膜細胞和細胞外基質增生， 基底膜增厚， 腎小球節(jié)段性硬化； 腎小管上 皮細胞

36、出現(xiàn)重度脂肪變性和水樣變性。 這說明隨著造模的時間延長， 腎臟出現(xiàn)了 脂質損害的特征，脂質代謝異常是腎臟病變進展的部分原因。脂代謝異常引起糖尿病腎病的分子機制目前認為與SREBP-lc介導TG在腎臟沉積、引起腎臟損害有關。SREBP-lc直接調節(jié)FAS基因的表達，F(xiàn)AS通過催化 乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而合成長鏈脂肪酸，以TG的形式存儲16,17。有研究 表明單純高糖高脂飼養(yǎng)的C57BL/6J小鼠16和單純STZ注射的1型糖尿病大鼠， 均出現(xiàn) SREBP-1c 和 FAS 高表達和腎組織 TG 含量增高。本實驗對大鼠喂以高 糖高脂飼料加上小劑量 STZ注射建立模型，結果表明SREBP-1C和F

37、AS mRN在 模型組大鼠腎組織高表達， 這與模型組腎臟出現(xiàn)的脂質損害有關。 我們的工作發(fā) 現(xiàn)在造模的第 12周出現(xiàn)明顯的腎臟脂質沉積，這對后人利用此模型來研究糖尿 病腎臟脂質代謝的情況奠定了基礎。調節(jié)SREBP-1C的表達可減少脂質對腎臟的損害，敲除小鼠的SREBP-1C基因，可防止小鼠由于高脂飲食所致的腎臟 TGF-B、PAI-1和VEGF表達的增強以 及細胞外基質的聚積18，亦可防止小鼠由于STZ注射所致的蛋白尿12。有學者 用二甲雙胍治療脂肪肝，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可降低 SREBP-1c mRNA 及蛋白表達 ,從 而改善肝臟脂肪變性 19 。本實驗觀察貞清方對 2 型糖尿病大鼠腎臟脂質代謝

38、的 影響，研究發(fā)現(xiàn)貞清方能下調 SREBP-1C mRN和 FAS mRN的表達，減少腎組織 TG 含量，同時，采用二甲雙胍作為對照用藥，結果顯示二甲雙胍也有相似的效 果。兩藥均能降降低血糖和血脂， 改善腎臟的病理損傷， 減少尿微量白蛋白的排 泄。以SREBP-1C及其下游基因作為靶點來研究中藥治療糖尿病腎病的藥效機制 有較好的應用前景，值得深入探討。REFERENCES1 SUN L, HALAIHELN,ZHANGW, et al. Role ofsterol regulatoryelement-binding protein1 in regulation of renal lipidme

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