第17章流式細胞儀分析技術及應用

1、第十七章第十七章 流式細胞儀分析技術及應用流式細胞儀分析技術及應用第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 一、工作原理一、工作原理 二、散射光的測定二、散射光的測定 三、熒光測量三、熒光測量 四、細胞分選原理四、細胞分選原理第二節(jié)第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析數(shù)據(jù)的顯示與分析 一、參數(shù)一、參數(shù) 二、數(shù)據(jù)顯示方式二、數(shù)據(jù)顯示方式 三、設門分析技術三、設門分析技術第三節(jié)第三節(jié) 流式細胞儀免疫分析的技術要求流式細胞儀免疫分析的技術要求一、免疫檢測樣品制備一、免疫檢測樣品制備二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色三、免疫膠乳顆粒的應用三、免疫膠乳顆粒的應用四、流式細胞免疫學技術的質(zhì)量控

2、制四、流式細胞免疫學技術的質(zhì)量控制第四節(jié)第四節(jié) 流式細胞術在免疫學檢查中的應用流式細胞術在免疫學檢查中的應用 一、淋巴細胞及其亞群的分析一、淋巴細胞及其亞群的分析 二、淋巴細胞功能分析二、淋巴細胞功能分析 三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型三、淋巴造血系統(tǒng)分化抗原及白血病免疫分型 四、腫瘤耐藥相關蛋白分析四、腫瘤耐藥相關蛋白分析 五、五、aidsaids病檢測中的應用病檢測中的應用 六、自身免疫性疾病相關六、自身免疫性疾病相關hlahla抗原分析抗原分析 七、移植免疫中的應用七、移植免疫中的應用思考題思考題小結小結流式細胞術流式細胞術(flow cytometry, fcm)是以流式是以

3、流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分單個細胞理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的新技術。選的新技術。 流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及流式細胞術最大的特點是能在保持細胞及細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態(tài)下，細胞器或微粒的結構及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細胞進行定量分析或純化分選。信號對細胞進行定量分析或純化分選。 細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量細胞不被破壞，測量快速、大量、準確、靈敏、定量流式細胞術的特點流式

4、細胞術的特點 流式細胞儀流式細胞儀是測量染色細胞標記物熒是測量染色細胞標記物熒光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分光強度的細胞分析儀，是在單個細胞分析和分選基礎上發(fā)展起來的對細胞的物析和分選基礎上發(fā)展起來的對細胞的物理或化學性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結構、理或化學性質(zhì)（如大小、內(nèi)部結構、dnadna、rnarna、蛋白質(zhì)、抗原等）進行快速、蛋白質(zhì)、抗原等）進行快速測量并可分類收集的高技術。測量并可分類收集的高技術。第一節(jié)第一節(jié) 概述概述細胞組成細胞組成細胞功能細胞功能大小大小細胞表面細胞表面/ /胞漿胞漿/ /核核-特異性抗原特異性抗原粒度粒度細胞活性細胞活性dna, rnadna, rna含量含量胞內(nèi)

5、細胞因子胞內(nèi)細胞因子蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量激素結合位點激素結合位點鈣離子鈣離子, ph, ph值值, , 膜電位膜電位酶活性酶活性流式細胞儀常檢測的細胞特性流式細胞儀常檢測的細胞特性采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢利用熒光染料與單克隆抗體技術結合的標記技術，保證檢測的靈敏度和特異性；測的靈敏度和特異性；用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)用計算機系統(tǒng)對流動的單細胞懸液中單個細胞的多個參數(shù)信號進行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確信號進行數(shù)據(jù)處理分

6、析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。性。 一、工作原理一、工作原理 （1 1） 液流系統(tǒng)液流系統(tǒng) （2 2） 光學系統(tǒng)光學系統(tǒng) （3 3） 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)1.流式細胞儀的基本結構：流式細胞儀的基本結構： 由樣本和鞘液組成由樣本和鞘液組成 待測細胞待測細胞 單個細胞的懸液單個細胞的懸液 熒光染料標記的熒光染料標記的單抗對其染色單抗對其染色 受清潔氣體壓力受清潔氣體壓力 從樣品管進從樣品管進入流動室形成樣本流入流動室形成樣本流 鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液。主要作用是鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細胞處于噴嘴中心包裹樣本流的周圍，保持樣

7、本流中細胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。（1）液流系統(tǒng)）液流系統(tǒng)噴嘴噴嘴fluorescencefluorescencesignalssignalsfocused laserfocused laserbeambeam鞘液鞘液液流系統(tǒng)示意圖液流系統(tǒng)示意圖fcmfcm的液流系統(tǒng)（如的液流系統(tǒng)（如何形成單個細胞流）何形成單個細胞流）樣本管樣本管鞘液管鞘液管 激光光源：氣冷式氬離子激光器激光光源：氣冷式氬離子激光器 分色反光鏡：反射長分色反光鏡：反射長/ /短波長，通過短短波長，通過短/ /長長波長波長 光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡光束成形器：兩十字交

8、叉放置的透鏡 透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光 濾片：長通、短通、帶通濾片：長通、短通、帶通 光電倍增管：光電倍增管：fs, ssfs, ss（散射光），（散射光）， fl1, fl2, fl3, fl4fl1, fl2, fl3, fl4（熒光）（熒光）（2）光學系統(tǒng)）光學系統(tǒng)flowflowtiptiplaserlaserss and flss and fldetectordetectorfs detectorfs detector光學系統(tǒng)示意圖光學系統(tǒng)示意圖主要由計算機及其軟件組成主要由計算機及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)基本工作原理基本工作原理

9、單細胞液柱已標記的單細胞懸液和鞘液硅化管流動室噴嘴熒光檢測系統(tǒng)和散射光感受系統(tǒng)收集光信號熒光染料被激發(fā)發(fā)光光電倍增管脈沖信號計算機系統(tǒng)分析結果放大垂直相交形成穩(wěn)態(tài)水平激光與之基本過程基本過程區(qū)別區(qū)別流式細胞儀流式細胞儀顯微鏡顯微鏡光源光源激光激光自然光、燈光自然光、燈光對象對象細胞、生物粒子細胞、生物粒子細胞、組織等細胞、組織等承載工具承載工具鞘液及流動室鞘液及流動室載玻片載玻片檢測信號檢測信號光學信號光學信號形態(tài)及染色形態(tài)及染色放大方式放大方式pmtpmt、放大電路、放大電路目鏡目鏡物鏡、光學放大物鏡、光學放大統(tǒng)計統(tǒng)計計算機，計算機，50005000人工，人工，200200結果結果多參數(shù)，綜

10、合分析多參數(shù)，綜合分析簡單，單參數(shù)簡單，單參數(shù)流式細胞儀與顯微鏡的區(qū)別流式細胞儀與顯微鏡的區(qū)別 細胞在液柱中與激光束相交時細胞在液柱中與激光束相交時向周圍向周圍360立體角方向散射的光線立體角方向散射的光線信號，它的強弱與細胞的大小、形信號，它的強弱與細胞的大小、形狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關，主要分狀、胞內(nèi)顆粒折射等有關，主要分為為前向散射光前向散射光和側向散射光側向散射光。二、散射光的測定二、散射光的測定前向散射光前向散射光（forward scatter, forward scatter, fsfs）：激光束照射細胞時，光激光束照射細胞時，光以相對軸較小角度以相對軸較小角度(0.5(0.510

11、10) )向前方散射的訊號用于檢測細向前方散射的訊號用于檢測細胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比胞等粒子的表面屬性，信號強弱與細胞體積大小成正比。fals sensorlaser前向散射光示意圖前向散射光示意圖側向散射光（側向散射光（side scatter, ssside scatter, ss）：）：激光束照射細激光束照射細胞時，光以胞時，光以9090角散射的訊號，用于檢測細胞角散射的訊號，用于檢測細胞內(nèi)部內(nèi)部結構屬性。結構屬性。fals sensor90ls sensorlaser側向散射光側向散射光示意圖示意圖 測得的測得的fsfs與與ssss信信號通過計算機處理，號通過

12、計算機處理，可得到可得到fs-ssfs-ss圖，由圖，由此可僅用散射光信號此可僅用散射光信號對未染色的活細胞進對未染色的活細胞進行分析或分選。行分析或分選。 此為血細胞分類此為血細胞分類的基本原理，但不能的基本原理，但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴細胞淋巴細胞單核細胞單核細胞中性粒細胞中性粒細胞光散射測量最有效用途：光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群從非均一群體中鑒別出某些亞群 熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。發(fā)后產(chǎn)生，發(fā)射的熒光波長與激發(fā)光波長不同。 每種熒光染料會產(chǎn)生特定

13、波長的熒光和顏色，通過每種熒光染料會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。光信號區(qū)分開，送入不同的光電倍增管。 選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的選擇不同的單抗及染料就可同時測定一個細胞上的多個不同特征。多個不同特征。 線性放大器和對數(shù)放大器線性放大器和對數(shù)放大器三、熒光測量三、熒光測量熒光染料的特性熒光染料的特性激發(fā)波長激發(fā)波長(exciting)(exciting)發(fā)射波長發(fā)射波長(emission)(emission)熒光補償熒光補償 通過流式細胞儀進行細胞分選通

14、過流式細胞儀進行細胞分選主要是在對具有某種特征的細胞需主要是在對具有某種特征的細胞需進一步培養(yǎng)和研究時進行的。進一步培養(yǎng)和研究時進行的。四、細胞分選原理四、細胞分選原理細胞懸液形成液流柱細胞懸液形成液流柱流動室振動流動室振動液流斷裂成液滴液流斷裂成液滴空白液滴空白液滴含細胞的液滴含細胞的液滴棄去棄去偏轉落入收集器偏轉落入收集器壓電晶體壓電晶體產(chǎn)生產(chǎn)生機械振動機械振動不充電不充電充電充電（一）分選基本原理（一）分選基本原理 分選速度：分選速度：單位時間內(nèi)分選的細胞數(shù)量。與懸單位時間內(nèi)分選的細胞數(shù)量。與懸液中細胞的含量成正比。液中細胞的含量成正比。 分選純度：分選純度：分選出的目的細胞占所有收獲細

15、胞分選出的目的細胞占所有收獲細胞的百分率。的百分率。 分選收獲率：分選收獲率：實際收獲的分選細胞與設定通過實際收獲的分選細胞與設定通過測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。測量點的分選細胞之間的比率。與純度成反比。 分選得率：分選得率：從一群體細胞懸液中分辨出目的細從一群體細胞懸液中分辨出目的細胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細胞的實際得率。胞的總量，再經(jīng)分選后得到目的細胞的實際得率。與分選速度成反比。與分選速度成反比。（二）分選的技術要求（二）分選的技術要求 參數(shù)：參數(shù)：fs,ss,flfs,ss,fl 數(shù)據(jù)顯示方式數(shù)據(jù)顯示方式 （單參數(shù)直方圖（單參數(shù)直方圖 、雙、雙參數(shù)散點圖參數(shù)散點圖 、

16、二維等高圖、二維等高圖 、假三維、假三維等高圖等高圖 、三參數(shù)散點圖、三參數(shù)散點圖 ） 設門分析技術設門分析技術 第二節(jié)第二節(jié) 數(shù)據(jù)的顯示與分析數(shù)據(jù)的顯示與分析fsfs：反映顆粒的大?。悍从愁w粒的大小ssss：反映顆粒的內(nèi)部結構復雜程度：反映顆粒的內(nèi)部結構復雜程度flfl：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少：反映顆粒被染上的熒光數(shù)量多少一、一、 參數(shù)參數(shù) 單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖 雙參數(shù)直方圖雙參數(shù)直方圖: :點圖點圖 二維等高圖二維等高圖 假三維等高圖假三維等高圖 三參數(shù)直方圖三參數(shù)直方圖 多參數(shù)分析多參數(shù)分析直分析方圖直分析方圖設門分析設門分析: :region和和gate設置設置二、數(shù)據(jù)顯示方

17、式二、數(shù)據(jù)顯示方式 由一維參數(shù)由一維參數(shù)( (散射光或熒光散射光或熒光) )與顆粒計數(shù)與顆粒計數(shù)(count)構成，反映同樣散射光或熒光構成，反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。強度的顆粒數(shù)量的多少。（一）單參數(shù)直方圖（一）單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖單參數(shù)直方圖細胞相對數(shù)量細胞相對數(shù)量信道信道(channel(channel ) ) 雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測雙參數(shù)直方圖：縱軸和橫軸分別代表被測量細胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)量細胞的兩個測量參數(shù)，根據(jù)這兩個參數(shù)就可以確定細胞在圖上的表達位置。就可以確定細胞在圖上的表達位置。 雙參數(shù)信號雙參數(shù)信號通常采用對數(shù)信號，最常用的通常

18、采用對數(shù)信號，最常用的是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，是點密圖，在圖中，每個點代表一個細胞，點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光點圖利用顆粒密度反映同樣散射光或熒光強度的顆粒數(shù)量的多少。強度的顆粒數(shù)量的多少。（二）雙參數(shù)直方圖（二）雙參數(shù)直方圖1.雙參數(shù)直方圖點圖雙參數(shù)直方圖點圖綠色熒光強度綠色熒光強度紅色熒光強度紅色熒光強度雙參數(shù)直方圖點圖雙參數(shù)直方圖點圖2. 二維等高圖二維等高圖 由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是由類似地圖上的等高線組成，其本質(zhì)也是雙參數(shù)直方圖。雙參數(shù)直方圖。 等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數(shù)，即胞相對或絕對數(shù)

19、，即“等高等高”。 曲線層次越高曲線層次越高( (越里面的線越里面的線) ) 所代表的細胞所代表的細胞數(shù)愈多。數(shù)愈多。 等高線越密集則表示細胞數(shù)變化率越大。等高線越密集則表示細胞數(shù)變化率越大。二維等高圖二維等高圖3. 假三維等高圖假三維等高圖（三）三參數(shù)直方圖（三）三參數(shù)直方圖 多參數(shù)分析：當細胞標記了多色熒光，被激多參數(shù)分析：當細胞標記了多色熒光，被激發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信發(fā)光激發(fā)后，得到的熒光信號和散射光信號可根據(jù)需要進行組合分析。號可根據(jù)需要進行組合分析。（四）流式細胞儀的多參數(shù)分析（四）流式細胞儀的多參數(shù)分析 gate gate設置：指在某一張選定參數(shù)的直設置：指在某一張

20、選定參數(shù)的直方圖上，根據(jù)該圖的細胞群分布選定方圖上，根據(jù)該圖的細胞群分布選定其中想要分析的特定細胞群，并要求其中想要分析的特定細胞群，并要求該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只該樣本所有其他參數(shù)組合的直方圖只體現(xiàn)這群細胞的分布情況。體現(xiàn)這群細胞的分布情況。根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓根據(jù)門的形狀又分為了線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。形門、多邊形門、任意形狀門和十字門。 三、設門分析技術三、設門分析技術a a 淋巴細胞淋巴細胞b b 單核細胞單核細胞c c 中性粒細胞中性粒細胞a a、b b、c c均均為任意門為任意門線性門線性門 region設置設置: 區(qū)閾（區(qū)閾

21、（region, r）與門）與門(gate, g ) 是兩個是兩個相關的概念，區(qū)閾可與門對應，但是也相關的概念，區(qū)閾可與門對應，但是也可以包含于門?？梢园陂T。d1 cd4+/cd3-d2 cd4+/cd3+d3 cd4- /cd3-d4 cd4- /cd3+如十字門分析時，起如十字門分析時，起就可以由四個區(qū)域構就可以由四個區(qū)域構成，即成，即g=d1+d2+d3+d4。 樣本制備樣本制備 標記染色標記染色 液相芯片技術液相芯片技術 質(zhì)量控制質(zhì)量控制 第四節(jié)第四節(jié) 流式細胞儀免疫分析的技術要求流式細胞儀免疫分析的技術要求 外周血淋巴細胞樣品的制備外周血淋巴細胞樣品的制備分離單個核細胞分離單個核

22、細胞培養(yǎng)細胞的樣品制備培養(yǎng)細胞的樣品制備 蛋白酶消化蛋白酶消化 機械吹打機械吹打 使貼壁細胞脫落使貼壁細胞脫落 洗滌洗滌 尼龍網(wǎng)過濾尼龍網(wǎng)過濾單細胞懸液單細胞懸液一、免疫檢測樣品制備一、免疫檢測樣品制備新鮮實體組織單細胞懸液的制備新鮮實體組織單細胞懸液的制備 機械法機械法 酶處理法酶處理法 化學試劑處理法化學試劑處理法 表面活性劑處理法表面活性劑處理法單細胞懸液的保存單細胞懸液的保存 深低溫保存法（一年）深低溫保存法（一年） 乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2 2周）周） 甲醛或多聚甲醛保存法（甲醛或多聚甲醛保存法（2 2月）月）適用條件適用條件: : 有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù)有較高的量

23、子產(chǎn)額和消光系數(shù) 對對488nm488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收的激發(fā)光波長有較強的吸收 發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差發(fā)射光波長與激發(fā)光波長間有較大的波長差 易與標記單抗結合而不影響抗體的特異性易與標記單抗結合而不影響抗體的特異性二、常用的熒光染料與標記染色二、常用的熒光染料與標記染色fitcfitctexas redtexas redpe.pc.apcpe.pc.apcpecy5pecy5fl1fl2fl3fl4激光激光細細胞胞懸懸液液異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素得州紅得州紅能量傳遞復合染料能量傳遞復合染料藻膽蛋白類藻膽蛋白類（一）幾種常見的熒光染料（一）幾種常見的熒光染料名稱名

24、稱染料染料激發(fā)激發(fā)波長波長熒光顏熒光顏色色溶解性溶解性對對phph敏感敏感性性特點特點異硫氰酸熒異硫氰酸熒光素光素fitcfitc488488綠綠 525525易易敏感敏感易溶于水，與抗體結易溶于水，與抗體結合不影響特異性合不影響特異性得州紅得州紅texas texas redred568568紅紅 615615不易不易不敏感不敏感穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)穩(wěn)定，偶聯(lián)后量子產(chǎn)額低額低藻紅蛋白藻紅蛋白pepe488488橙橙575575易易不敏感不敏感具較多發(fā)光基團，消具較多發(fā)光基團，消光系數(shù)和量子產(chǎn)額高光系數(shù)和量子產(chǎn)額高藻青蛋白藻青蛋白pcpc488488別藻青蛋白別藻青蛋白apcapc633633紅

25、紅670670能量傳遞復能量傳遞復合染料合染料pecy5pecy5488488紅紅670670易易不敏感不敏感減少交叉，成本高減少交叉，成本高常用的幾類熒光染料常用的幾類熒光染料 用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結合在一起，在結合在一起，在488nm488nm激發(fā)光照射下，通過激發(fā)光照射下，通過一個熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長再一個熒光染料被激發(fā)后產(chǎn)生的發(fā)射波長再激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號，從而檢激發(fā)另一熒光染料產(chǎn)生熒光信號，從而檢測到該特定熒光信號。測到該特定熒光信號。能量傳遞復合染料能量傳遞復合染料pecy5cy5cy5488nm575nm670nm紅色

26、熒光花青苷花青苷5 5藻紅蛋白藻紅蛋白能量傳遞復合染料機制能量傳遞復合染料機制熒光染料與細胞成分的四種結合方式熒光染料與細胞成分的四種結合方式結構親和式結構親和式嵌入結合嵌入結合共價鍵結合共價鍵結合熒光標記抗體特異性結合熒光標記抗體特異性結合免疫熒光標記方法免疫熒光標記方法直標直標: :干擾少干擾少, ,但需購買多種單抗但需購買多種單抗間標間標: :步驟多步驟多, ,干擾多干擾多, ,不需標記多種抗體不需標記多種抗體組合標記組合標記（二）免疫熒光標記（二）免疫熒光標記 免疫膠乳顆粒的應用即液相芯片技術免疫膠乳顆粒的應用即液相芯片技術是把微小是把微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色，把的乳膠

27、微球分別染成上百種不同的熒光色，把針對不同檢測物的乳膠微球混合后再加入待標針對不同檢測物的乳膠微球混合后再加入待標本，在懸液中與微粒進行特異性地結合，經(jīng)激本，在懸液中與微粒進行特異性地結合，經(jīng)激光照射后不同待測特產(chǎn)生不同顏色，并可進行光照射后不同待測特產(chǎn)生不同顏色，并可進行定量分析。因檢測速度極快，所以又有定量分析。因檢測速度極快，所以又有“液相液相芯片芯片”之稱之稱 。三、免疫膠乳顆粒技術的應用三、免疫膠乳顆粒技術的應用微小的乳膠微球分別染成上百微小的乳膠微球分別染成上百種不同的熒光色（固相芯片是種不同的熒光色（固相芯片是用探針在芯片上的坐標位置給用探針在芯片上的坐標位置給基因的特異性編碼；

28、而液相芯基因的特異性編碼；而液相芯片則是用顏色來編碼）片則是用顏色來編碼）通過對標記不同熒光素分子的檢測，實通過對標記不同熒光素分子的檢測，實現(xiàn)現(xiàn)fcmfcm對可溶性物質(zhì)的定量分析對可溶性物質(zhì)的定量分析 適當?shù)闹苽浞绞竭m當?shù)闹苽浞绞?處理紅細胞處理紅細胞 實體組織來源標本用機械法實體組織來源標本用機械法 溫度溫度25253737，ph7.0ph7.07.27.2四、流式細胞免疫學技術的質(zhì)量控制四、流式細胞免疫學技術的質(zhì)量控制（一）單細胞懸液制備的質(zhì)控（一）單細胞懸液制備的質(zhì)控 溫度溫度 phph 染料濃度染料濃度 固定劑固定劑（二）免疫熒光染色的質(zhì)控（二）免疫熒光染色的質(zhì)控 光路與流路校正光路

29、與流路校正: : 確保激光光路與樣品確保激光光路與樣品流處于正交狀態(tài)，減少變異（流處于正交狀態(tài)，減少變異（cvcv）。）。 pmtpmt（光電倍增管）校準（光電倍增管）校準: : 保證樣品檢測保證樣品檢測時儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。時儀器處于最佳靈敏度工作狀態(tài)。 絕對計數(shù)校準絕對計數(shù)校準: : 保證計數(shù)的準確性。保證計數(shù)的準確性。（三）儀器操作的質(zhì)控（三）儀器操作的質(zhì)控 同型對照：即免疫熒光標記中的陰性對照，同型對照：即免疫熒光標記中的陰性對照，選用相同源性的選用相同源性的未標記單抗未標記單抗作為對照調(diào)整和作為對照調(diào)整和設置電壓，以保證特異性。設置電壓，以保證特異性。 全程質(zhì)量控制：與待測標

30、本一起標記和檢測，全程質(zhì)量控制：與待測標本一起標記和檢測，結果達靶值，提示本次實驗結果可靠。結果達靶值，提示本次實驗結果可靠。（四）免疫檢測的質(zhì)控（四）免疫檢測的質(zhì)控 流式細胞術目前已廣泛地被應用于免疫學流式細胞術目前已廣泛地被應用于免疫學基礎研究和逐步進入臨床應用各方面，用流式基礎研究和逐步進入臨床應用各方面，用流式細胞儀對細胞表面的抗原成分進行標記分析，細胞儀對細胞表面的抗原成分進行標記分析，可區(qū)別多種細胞的特性，為細胞免疫的研究增可區(qū)別多種細胞的特性，為細胞免疫的研究增加了有效的手段和幫助。加了有效的手段和幫助。 第四節(jié)第四節(jié) 在免疫學檢驗中的應用在免疫學檢驗中的應用t t淋巴細胞及其亞

31、群分析淋巴細胞及其亞群分析th(cd3+cd4+cd8-t); tc(cd3+cd4-cd8+t)b淋巴細胞及其亞群分析淋巴細胞及其亞群分析b1(cd19+cd5+):產(chǎn)生產(chǎn)生igm型自身抗體型自身抗體, 參與免疫調(diào)節(jié)、與自參與免疫調(diào)節(jié)、與自身免疫病的發(fā)生有關身免疫病的發(fā)生有關b2(cd19+cd5-):受外來抗原刺激受外來抗原刺激, 產(chǎn)生高親和性特異性抗體產(chǎn)生高親和性特異性抗體nk細胞分析細胞分析nk(cd3-cd16+cd56+)一、淋巴細胞及其亞群的分析一、淋巴細胞及其亞群的分析 細胞介導細胞毒性試驗細胞介導細胞毒性試驗( (死細胞與活細胞比例死細胞與活細胞比例) ) 細胞內(nèi)細胞因子測定

32、細胞內(nèi)細胞因子測定二、淋巴細胞功能分析二、淋巴細胞功能分析三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型三、淋巴造血系統(tǒng)及白血病免疫分型對淋巴瘤和白血病進行多色免疫分型對淋巴瘤和白血病進行多色免疫分型用于選擇化療方案、判斷預后及檢出微小用于選擇化療方案、判斷預后及檢出微小殘留病變殘留病變cd4+th細胞、細胞、cd4+/cd8+比例比例mdr(+)表示對化療藥物耐藥表示對化療藥物耐藥四、腫瘤耐藥基因分析四、腫瘤耐藥基因分析五、五、aids病檢測中的應用病檢測中的應用hla-b27可出現(xiàn)在可出現(xiàn)在58%97%的強直的強直性脊椎炎性脊椎炎(as) 患者患者六、自身免疫病相關六、自身免疫病相關hla抗原分析抗原分析 fcm作為一個強大的技術平臺，已應用于多作為一個強大的技術平臺，已應用于多個領域，其在移植免疫分析中的應用也越來越個領域，其在移植免疫分析中的應用也越來越廣泛。目前移植免疫中的廣泛。目前移植免疫中的fcm應用主要包括流應用主要包括流式細胞術的交叉配型（式細胞術的交叉配型（flow cytometry cross-matching, fcxm）和群體反應性抗體（）和群體反應性抗體（panel reactive antibody, pra）檢測。）檢測。七、移植免疫中的應用七、移植免疫中的應用