生化進展 綜述

1、家蠅抗菌肽的研究進展 專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué) 姓名：邢建曉 學(xué)號：20141155 摘要 家蠅抗菌肽是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類抵抗外界病原體感染的肽類生物活性物質(zhì),廣泛存在于昆蟲、植物、動物及人體內(nèi)。昆蟲是地球上現(xiàn)存種類最多、數(shù)量最大的低等動物,而尤以家蠅的繁殖率最高。和其他高等動物一樣,昆蟲也具有一個完整的細胞和體液免疫反應(yīng)系統(tǒng),存在著防御病原體感染,保持自我穩(wěn)定和免疫監(jiān)督的種種機能,但其免疫體系遠不如高等動物那樣專一、完善和發(fā)達。昆蟲既沒有專門和高效的免疫器官和組織(T、B 淋巴系統(tǒng)),體液中也沒有免疫球蛋白及補體的存在,而昆蟲能在自然界中占據(jù)極大的優(yōu)勢,表明其防御系統(tǒng)必然有其獨到之處。

2、通過克隆新的家蠅抗菌肽基因雙翅肽（diptericin）的全長序列并對其進行相關(guān)生物信息學(xué)分析。根據(jù)已經(jīng)克隆的家蠅抗菌肽基因diptericin片段設(shè)計1對引物，運用cDNA末端快速擴增技術(shù)、T-A克隆和序列測定，將所得序列與GenBank中已知的diptericin基因進行同源性分析，并對其進行組織表達水平進行了研究。進一步研究了抗菌肽在醫(yī)藥、抗生素、添加劑、防腐劑等方面的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：抗菌肽 diptericin 天蠶素 AbstractHousefly antibacterial peptide is a class of biological immune system to prod

3、uce resistance to the outside world the pathogen infection of peptide bioactive substances, widely exists in insects, plants, animals and human body.Insects are most existing species on earth, the largest number of lower animals, and especially in the housefly reproduction rate is highest.And other

4、higher animals, insects also have a complete cellular and humoral immune response system, there exists a defense against pathogens infection, maintain stability of the self and a variety of immune surveillance function, but its immune system is much less than the higher animals so single-minded, per

5、fected and developed.Insects are neither special and efficient immune organs and tissues (T, B lymphocyte system), nor the existence of immunoglobulin and complement in the body fluids, and insects can occupy a huge advantage in nature, suggests that its defense system must have its unique feature.B

6、y cloning new housefly antibacterial peptide gene length of the wings peptide (diptericin) sequence and its related bioinformatics analysis.According to have cloned housefly diptericin antibacterial peptide gene fragment 1 for primer design, using cDNA end rapid amplification technology, T - A cloni

7、ng and sequencing, the sequence and GenBank known diptericin gene homology analysis, and carries on the expression levels were studied.Further study on the antibacterial peptides in medicine, the application of antibiotics, additives, preservatives, etc.Keywords: antibacterial peptide diptericin wil

8、d silkworm前言家蠅 Musca domestica 隸屬昆蟲綱、雙翅目、環(huán)裂亞目、家蠅科。體內(nèi)外通常攜帶有害因子數(shù)量多達數(shù)萬億,能夠機械傳播人、畜多種病原體如細菌、病毒和寄生蟲卵等, 而自身并不感病。即使在人工大規(guī)模高密度飼養(yǎng)的條件下, 也不會發(fā)生集體染病, 這是緣于家蠅體內(nèi)外抗菌活性物質(zhì)的作用。對人類危害極大。家蠅攜帶眾多病原微生物而自身并不染病的現(xiàn)象引起了人們極大關(guān)注,多年來科學(xué)家們一直在研究它。這些抗菌活性物質(zhì)包括血淋巴受體外異物刺激而增加表達量的抗菌肽、凝集素,幼蟲排放到體外有生物活性的分泌物, 表皮中的幾丁質(zhì), 也有存在于其他組織器官或代謝產(chǎn)生的糞產(chǎn)堿菌、有機化合物和尿囊素

9、。多種抗菌活性物質(zhì)構(gòu)成了家蠅特殊免疫防御機制,使其能夠長期穩(wěn)定維持家蠅生存而免受細菌、真菌、病毒、腫瘤癌細胞和寄生蟲等侵染。在當(dāng)前有害生物易產(chǎn)生抗藥性,而新型抗菌藥物開發(fā)又非常困難的情況下,許多專家將注意力轉(zhuǎn)向家蠅這種獨特的昆蟲資源。昆蟲防御素是抗菌肽家族中最為普遍的一類,研究較深入,應(yīng)用前景很好。但抗菌肽產(chǎn)量低,天然中分離難度大,而化學(xué)合成成本過高。基因工程方法表達抗菌肽近年來研究很多,但由于抗菌肽分子小,對宿主有毒性,表達產(chǎn)物易降解等特點,往往得不到較高的表達。抗菌肽具有非特異性抗細菌、真菌、病毒的作用,在抗病原微生物藥物開發(fā)中具有較大的發(fā)展?jié)摿?。日本和美國已投巨資積極研究開發(fā)天然抗菌肽,

10、把昆蟲特別是蠅類資源開發(fā)列為高新技術(shù)產(chǎn)業(yè),我國在該領(lǐng)域的研究還處在起步階段。昆蟲抗菌肽是昆蟲遭受外界病原感染而誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類體液免疫物質(zhì),具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性強、分子量小及無免疫原性等特點,其殺菌機制獨特,不易產(chǎn)生耐藥菌,有望開發(fā)為新一代肽類抗生素。最初是由瑞典科學(xué)家G. Boman等用大腸桿菌誘導(dǎo)惜古比天蠶蛹后發(fā)現(xiàn)其血淋巴中產(chǎn)生了抗菌活性多肽物質(zhì),即被命名為天蠶素,它被認為是第一個真正意義上的抗菌肽。隨后,人們又不斷地在魚類、兩棲類、高等動植物、人類中相繼發(fā)現(xiàn)并分離得到了具有類似性質(zhì)的多肽類物質(zhì)。1 抗菌肽的作用機理家蠅抗菌肽之所以不易產(chǎn)生抗藥性, 在于其獨特的作用機理。一般認為是通過破壞

11、細菌的細胞膜而殺傷細菌,細菌有外膜和內(nèi)膜2種膜系。外膜富含帶負電荷的脂多糖,內(nèi)膜為質(zhì)膜。通過靜電引力抗菌肽首先與細菌外膜結(jié)合,然后與內(nèi)膜作用,擾亂膜脂分子的排列,改變細胞膜通透性,在細胞膜上形成許多孔道,使細胞內(nèi)的原生質(zhì)擴散,并從孔道向胞外滲漏,最終導(dǎo)致細胞完全解體,起到抑菌殺菌作用。抗菌肽防御素對病原微生物具很強的嗜膜性、與膜性結(jié)構(gòu)吸附、融合、改變其通透性、導(dǎo)致其內(nèi)容物外泄而致其死亡；具廣譜抗菌、抗病毒活性，病原微生物不易對其產(chǎn)生耐藥性；抗菌肽防御素在工作濃度時對動植物的宿主細胞無毒性?？咕姆烙胤肿訉τ诟鞣N病原微生物的細胞或病毒的膜性結(jié)構(gòu)具有高度的嗜膜性。但是在分別殺滅細菌、病毒、真菌等

12、不同的病原微生物時它們的作用機理也是不同的。例如：在殺滅細菌時一般認為抗菌肽防御素是通過正、負電荷間的相互作用來發(fā)揮作用的。它們可以附著在細菌細胞質(zhì)膜上穿孔而形成離子孔道造成細菌細胞膜結(jié)構(gòu)破壞引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出而最終導(dǎo)致細菌死亡每毫升抗菌肽可以殺死150萬300萬個金黃色葡萄球菌和高致病大腸桿菌但是在殺滅各種病毒時，一般認為它們一方面可以作用于病毒的膜性結(jié)構(gòu)，使其喪失對易感細胞的侵染或即使能夠侵染進入易感細胞，病毒也不能有效地在細胞內(nèi)復(fù)制病毒，另一方面他們也可以通過改變易感細胞膜表面的受體，來有效阻斷病毒進入細胞的途徑。而在抗殺真菌時，有些抗菌肽防御素是通過它們能與甲殼素緊密結(jié)合的特性

13、，來破壞真菌細胞壁中的結(jié)構(gòu)性物質(zhì)甲殼素而殺滅真菌的。（1毫克的抗菌肽可以高效殺死2500個霉菌孢子）由于抗菌肽防御素獨特地抗菌、抗病毒的作用機理，使得病原微生物很難對其產(chǎn)生耐藥性。2 抗菌肽的種類根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能不同可分為5類:天蠶素類,具有2個兩性的螺旋結(jié)構(gòu),分子量在4 kDa 左右,對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌都有抗性。昆蟲防御素類,含有半胱氨酸且形成二硫鍵,具有螺旋和折疊結(jié)構(gòu),分子量為4 kDa,對革蘭氏陽性菌有生物活性。富含脯氨酸的抗菌肽,分子量為24 kDa,抗革蘭氏陰性菌。富含甘氨酸的抗菌肽,分子量為1030kDa,對革蘭氏陰性菌有活性。3 家蠅的抗菌肽基因DipericinDip

14、ericin 是一種屬于富含甘氨酸的抗菌肽，主要作用便是通過IMD（immune deficiency，免疫缺陷）信號途徑來抵御 G-細菌的入侵。3.1對Dipericin 進行克隆3.1.1總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄家蠅幼蟲經(jīng)新鮮培養(yǎng)的多重耐藥大腸埃希菌菌液及耐甲氧西林葡萄球菌菌液（A6001.0）誘導(dǎo)后，針刺其腹部后于新鮮飼料中帶菌飼養(yǎng)，10h后取8條活力好的幼蟲（約 80 mg），以TRIzol reagent提取總RNA并分離純化mRNA后，用試劑盒中的CIP（小牛腸堿性磷酸酶）將mRNA進行去磷酸化處理及用TAP（煙草酸焦磷酸酶）去帽處理，再向裝有等分的、凍干的GeneRacer TM

15、RNA Oligo（0.25 g ）管中加入7l已脫去磷酸、已去帽的RNA，混勻后，RNA Oligo 就連接成脫去帽狀結(jié)構(gòu)的mRNA，以O(shè)ligo dT為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。3.1.2末端RACE方法克隆全長家蠅diptericin基因 首先進行 5RACE ,依據(jù)本課題組前期研究用基因芯片方法獲得的diptericin基因部分序列信息，設(shè)計家蠅diptericin 基因特異性下游引物，GSP R：TGTGGTTGCCGATGATAAGTCACAGC；上游用通用引物，GeneRacer5Primer：5 GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3，以GeneRacer

16、5Primer為正向引物，GSP-R為反向引物，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，首先94 2 min 變性，94 30s，72 30s 5 個循環(huán)；94 30s，70 30s 5個循環(huán)；94 30s，6068 30s，68 30s 25個循環(huán)；68延伸10 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物將目的片段切膠回收， 將純化PCR產(chǎn)物連接到pMD18 -T載體上轉(zhuǎn)化，挑取克隆測序得到5端序列。 3RACE方法與5RACE末端序列擴增條件相比，只需將5通用引物替換為3通用引物：GeneRacer 3Primer：5GCTGTCAACGAT ACGCTACGTAACG-3，設(shè)計家蠅 diptericin 特異性上游

17、引物GSP-F：CACCACCACGGTAATCAGGACGACTA，擴增條件、純化及T-A克隆同上。挑取克隆測序得到3端序列。3.2 家蠅抗菌肽基因diptericin核酸及氨基酸序列分析 將5RACE 和3RACE測序結(jié)果在NCBI上進行Contig分析，使用在線工具 http：/pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php 拼接成全長序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠅diptericin含有99個氨基酸，富含甘氨酸殘基。家蠅抗菌肽diptericin的分子質(zhì)量（Mr）和等電點（pI）分別10.86 kd和8.76。家蠅diptericin基因編碼的氨基酸序列與廄蜇蠅dipte ricinA（D

18、Q060072.1）、刺舌蠅 diptericin（AF368906）、新陸原伏蠅（X15851）diptericin、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster ） （AF322252、AF334182、NM_057460）、果蠅（AAB82532.1）diptericinB、果蠅(AAQ09897.1） diptericinB及黑森癭蚊(Mayetiola destructor）（DQ538392）編碼的氨基酸序列同源性分別為61%、74%、57%、57%、55%、41%、40%、55%、39%。3.3 抗菌肽diptericin 基因的組織表達 應(yīng)用地高辛標(biāo)記的Diperi

19、cin基因反義RNA探針，對大腸桿菌刺激后家蠅體內(nèi)Dipericin基因的表達量變化進行檢測。分析表明在未經(jīng)誘導(dǎo)的家蠅幼蟲體內(nèi)Dipericin基因的表達量很低,經(jīng)過大腸桿菌刺激后Dipericin基因表達迅速上調(diào),在12h達到高峰,隨后逐漸恢復(fù),72h后趨于恢復(fù)向正常水平,通過t檢驗,Dipericin基因表達量在672 h后均高于未刺激的對照組,且具有顯著性差異。在以家蠅Dipericin 基因正義 RNA 探針作陰性對照的各組織中均未檢測到家蠅 Dipericin 基因表達的陽性信號，體壁和肌肉誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)均未表達，在未經(jīng)微生物刺激的家蠅幼蟲部分組織內(nèi)也有檢測到陽性信號，如氣管有很弱的表

20、達，而馬氏管則誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)均有表達，而在誘導(dǎo)后的家蠅幼蟲脂肪體及中腸中有極強的表達。4 抗菌肽的應(yīng)用前景 家蠅抗菌肽具有分子量小,受溫度影響小,水溶性好,無免疫原性,廣譜的生物活性等特點,可以抑殺多種細菌、真菌、病毒,更令人興奮的是還能殺傷多種腫瘤細胞,但不損傷正常的體細胞,無毒副作用。因此它可以被廣泛用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。農(nóng)業(yè)方面,采用分子生物學(xué)和基因工程的方法將家蠅抗菌肽基因?qū)雱?、植物體內(nèi)獲得優(yōu)良的抗病品系并在其種內(nèi)遺傳,降低成本,增加收入。東京大學(xué)藥學(xué)部教授名取俊二從蒼蠅蛹中分離出一種由39個基酸組成的抗菌肽,并將其基因進行克隆成功地導(dǎo)入煙草,獲得抗野火病菌的煙草品系。將抗菌肽基

21、因表達于真核細胞,獲得大量抗菌肽,進行構(gòu)效關(guān)系研究并進行分子設(shè)計，篩選出高活性抗菌肽,然后可以通過基因工程大量生產(chǎn)。4.1 抗菌肽在疾病防治中的應(yīng)用近年來，隨著傳統(tǒng)抗生素的廣泛應(yīng)用，抗生素殘留及耐藥菌株的不斷出現(xiàn)破壞了動物的微生態(tài)平衡，進而危害到了人類健康，人們開始意識到開發(fā)新型的抗菌藥物已經(jīng)迫在眉睫。范闊海認為，與傳統(tǒng)的抗生素相比，抗菌肽具有許多優(yōu)勢：廣譜的生物學(xué)活性、作用機制獨特、不易產(chǎn)生抗藥菌株、不會導(dǎo)致畸形、無毒、無殘留。張衛(wèi)民通過實驗證明，柞蠶抗菌肽對大鼠大腸癌具有預(yù)防作用。麻延峰對抗菌肽防治金華豬呼吸道疾病綜合癥的療效進行了研究，結(jié)果表明：飼養(yǎng)含有抗菌肽日糧的實驗組發(fā)病率為10%、

22、治愈率為88%；飼養(yǎng)含有抗生素日糧的實驗組發(fā)病率為30%、治愈率為80%，說明抗菌肽在預(yù)防和治療豬呼吸道疾病的效果方面高于抗生素。抗菌肽這種具有潛力的新型抗生藥物在動物疾病有效預(yù)防與治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。4.2 在醫(yī)藥方面的應(yīng)用 抗菌肽具有許多優(yōu)勢，廣譜的生物學(xué)活性、作用機制獨特、不易產(chǎn)生抗藥菌株、不會導(dǎo)致畸形、無毒、無殘留。張衛(wèi)民通過實驗證明，柞蠶抗菌肽對大鼠大腸癌具有預(yù)防作用。麻延峰對抗菌肽防治金華豬呼吸道疾病綜合癥的療效進行了研究，結(jié)果表明：飼養(yǎng)含有抗菌肽日糧的實驗組發(fā)病率。醫(yī)藥方面,由于其抗菌譜廣,還具有抗腫瘤等重要藥用價值,不損傷人體正常細胞,與傳統(tǒng)阻斷生物大分子合成的抗生素具有

23、不同作用機理,且不易產(chǎn)生抗藥性,在目前抗生素抗藥性問題非常突出,而開發(fā)新型抗生素又非常困難的情況下,家蠅抗菌肽有望開發(fā)成為新一代肽類抗生素。如已有應(yīng)用基因工程技術(shù)開發(fā)的具有抗病功能的高新技術(shù)保健品工程蠅抗菌肽問世。還可通過基因工程方法將家蠅抗菌肽基因?qū)肽[瘤癌細胞,對癌癥基因治療提供幫助。家蠅抗菌肽對人體無毒副作用,也可以作為綠色食品添加劑。當(dāng)然,抗菌肽在家蠅體內(nèi)含量少,分離和純化比較困難,體外易被蛋白酶水解,要得到大量能用于生產(chǎn)實踐的抗菌肽還需要作出更多的研究和努力,如抗菌肽抗菌譜廣,需要用基因工程獲得大量抗菌肽,需穩(wěn)定的表達載體;抗菌肽富含堿性氨基酸易被蛋白酶水解,急需研究其構(gòu)效關(guān)系,進行

24、分子設(shè)計 , 結(jié)構(gòu)修飾,提高穩(wěn)定性,增加活性。4.3 抗菌肽作為飼料添加劑的應(yīng)用 抗菌肽相比較于傳統(tǒng)抗生素有其明顯優(yōu)勢，將其作為綠色飼料添加劑，適用范圍越來越廣泛。4.3.1抗菌肽可作為飼料添加劑長期使用 首先，抗菌肽水溶性比較好，殺菌作用機理獨特，動物食用后體內(nèi)無殘留、無毒、無副作用、使用效果穩(wěn)定。其次，抗菌肽不易失活，溫劉發(fā)等研究顯示：抗菌肽在飼料制粒的高溫作用下能夠保持穩(wěn)定，在規(guī)模生產(chǎn)的過程中，經(jīng)過高溫濃縮工序，不會使抗菌肽失活。4.3.2 抗菌肽對動物的生長有明顯的促進作用 陳冰以凡納濱對蝦為實驗材料，通過測定成活率、增重率、特定生長率和飼養(yǎng)效率四個指標(biāo)，探討了家蠅抗菌肽對凡納濱對蝦生

25、長性能的影響。結(jié)果表明：在飼料中添加適量的抗菌肽對凡納濱對蝦的生長有一定促進作用。王秀青使用基因工程重組Cecropin B飼養(yǎng)雛雞，通過檢測體重的方式探討抗菌肽對雛雞生長發(fā)育的影響，結(jié)果表明：抗菌肽Cecropi n B對雛雞有明顯的促生長作用。馬衛(wèi)明的研究認為：抗菌肽可以改變雞腸道的結(jié)構(gòu)，提高飼料轉(zhuǎn)化率，進而促進動物生長。此外，溫劉發(fā)認為：抗菌肽可以提高飼料的利用率，從而促進動物生長。4.4 抗菌肽作為天然防腐劑的應(yīng)用 抗菌肽對與食品腐敗有關(guān)的許多革蘭氏陽性、陰性細菌均有殺滅作用，并且安全無毒，甚至對人體具有一定保健效果，作為天然防腐劑已經(jīng)成為食品工業(yè)研究和開發(fā)利用的一個新熱點。2002年

26、，邱芳萍利用從林蛙干皮中提取得到的抗菌肽，探討了抗菌肽對以香腸、草莓為代表的肉制食品和瓜果蔬菜的保鮮防腐作用，得到了比較令人滿意的效果。隨后，有學(xué)者證明從家蠅幼蟲中提取的抗菌肽類物質(zhì)可以作為食品的中級防腐劑，趙紅艷綜述了動物、細菌、植物三種源抗菌肽在食品防腐劑中的應(yīng)用。鑒于人們切需求和抗菌肽作為食品防腐劑的顯著優(yōu)勢，抗菌肽類食品防腐劑有著廣闊的應(yīng)用前景。 參考文獻1Ferrandon D,ImlerJL, Hetru C, et al. The Drosophila systemic immune response: sensing and signaling during bacterial and fungal infectionsJ. Nat Rev Immunol, 2013,7(11): 862-874.2Hao Z, Kasumba I, Lehane MJ, et al. Tsetse immun