cas9技術(shù),靶向基因組定點(diǎn)精準(zhǔn)靶向修飾技術(shù)_CRISPR-Cas9

1、新技術(shù)介紹新技術(shù)介紹CRISPR-CasCRISPR-Cas系統(tǒng)基因系統(tǒng)基因修飾技術(shù)修飾技術(shù)匯報(bào)人：李新匯報(bào)人：李新時(shí)間：時(shí)間：2013年年5月月9日日2中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1 CRISPR-Cas概述概述u1987年，日本大阪大學(xué)（年，日本大阪大學(xué)（Osaka University）在對(duì)一種細(xì)菌）在對(duì)一種細(xì)菌編碼的堿性磷酸酶（編碼的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因進(jìn)行研究時(shí)，）基因進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的發(fā)現(xiàn)在這個(gè)基因編碼區(qū)域的附近存在一小段不同尋常的DNA片段，這些片段是由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的片

2、段，這些片段是由簡(jiǎn)單的重復(fù)序列組成的，而且在片段的兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列。兩端還存在一段不太長(zhǎng)的特有的序列。u2013以后，研究者們?cè)诎ㄒ院螅芯空邆冊(cè)诎╯cience和和nature biotechnology等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹等著名雜志上發(fā)表多篇文章介紹CRISPR-Cas系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚(yú)等物種上實(shí)現(xiàn)精確系統(tǒng)，并且已成功在人類、小鼠、斑馬魚(yú)等物種上實(shí)現(xiàn)精確的基因修飾。的基因修飾。3中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1 CRISPR-Cas概述概述CRISPR-Cas：一種來(lái)源是細(xì)菌獲得性免疫的由：一種來(lái)源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)指導(dǎo)C

3、as蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。4中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院CRISPR-Cas主要由兩部分組成：主要由兩部分組成：識(shí)別識(shí)別切割切割1 CRISPR-Cas概述概述5中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)CRISPR：（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） CRISPR 是一個(gè)特殊的是一個(gè)特殊的DNA重復(fù)序列家族重復(fù)序列家族, 廣泛分布于廣泛分布于細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中。CRISPR 位點(diǎn)通常由短的高度保守位點(diǎn)通常由短的

4、高度保守的重復(fù)序列的重復(fù)序列(repeats) 組成組成, 重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常重復(fù)序列的長(zhǎng)度通常 2148 bp, 重復(fù)序列之間被重復(fù)序列之間被 2672 bp 間隔序列間隔序列(spacer)隔開(kāi)。隔開(kāi)。CRISPR就是通過(guò)這些間隔序列（就是通過(guò)這些間隔序列（space）與靶基因進(jìn)行識(shí)別。）與靶基因進(jìn)行識(shí)別。6中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.1 CRISPR結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)7中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院1.2 Cas家族家族Cas（CRISPR associated）：）： 存在于存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在核酸酶，能在guid

5、e RNA引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類似，酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。8中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，是很多細(xì)菌和大部分古生菌的天然免疫系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)入侵的病毒和核酸進(jìn)行通過(guò)對(duì)入侵的病毒和核酸進(jìn)行特異性特異性的識(shí)別，利用的識(shí)別，利用Cas蛋白進(jìn)蛋白進(jìn)行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫。行切割，從而達(dá)到對(duì)自身的免疫。9中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的

6、發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)10中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)11中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn) CRISPR-Cas系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對(duì)外源系統(tǒng)賦予原核細(xì)胞針對(duì)外源DNA特異性免特異性免疫疫, 而這種特異性是由間隔序列（而這種特異性是由間隔序列（spacer）決定的。在宿主）決定的。在宿主防御噬菌體攻擊中，針對(duì)自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)防御噬菌體攻擊中，針對(duì)自然界中龐大的噬菌體種群，細(xì)菌進(jìn)化了菌進(jìn)化了CRISPR 介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫。這種免疫功能的發(fā)揮是由揮是由CR

7、ISPR 間隔序列的動(dòng)態(tài)性變化，即通過(guò)增加或刪間隔序列的動(dòng)態(tài)性變化，即通過(guò)增加或刪除間隔序列（除間隔序列（spacer）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。12中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：最主要的要求：PAM（protospacer-adjacent motif）為）為NGG。13中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系統(tǒng)靶向要求 在人類基因組中，平均每在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個(gè)就出現(xiàn)一個(gè)NGG PAM。14中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2 CRISPR-Cas系統(tǒng)靶向要求系

8、統(tǒng)靶向要求15中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3 CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾系統(tǒng)介導(dǎo)基因修飾16中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.1 dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換介導(dǎo)編輯模板替換 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems一文中，作者利用一文中，作者利用CRISPR-Cas系系統(tǒng)用設(shè)計(jì)好的統(tǒng)用設(shè)計(jì)好的DNA模板替換的相應(yīng)基因來(lái)達(dá)到基因的定向模板替換的相應(yīng)基因來(lái)達(dá)到基因的定向修飾。修飾。

9、17中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.1 dual-RNA：Cas介導(dǎo)編輯模板替換介導(dǎo)編輯模板替換18中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾 2013年年1月月29日在日在nature biotechnology上發(fā)表的上發(fā)表的efficient genome editing in zebra fish using a CRISPR-Cas system一文中，作者利用人工合成的一文中，作者利用人工合成的sgRNAs能指導(dǎo)能指導(dǎo)Cas9內(nèi)源性核酸酶對(duì)斑馬魚(yú)胚胎基因進(jìn)行修飾。內(nèi)源性核酸酶對(duì)斑馬魚(yú)胚胎基因進(jìn)行修飾。19中山大學(xué)生命科學(xué)

10、學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾20中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾21中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.2 sg-RNA：Cas介導(dǎo)基因修飾介導(dǎo)基因修飾Cas9sg-RNA22中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 2013年年2月月15日在日在science上發(fā)表的上發(fā)表的Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems一文一文中，作者利用一個(gè)包含兩個(gè)靶向不同基因的中，作者利用一個(gè)包含兩個(gè)靶向不同基因的spacers的

11、的crRNA實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行編輯。實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行編輯。3.3 cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾介導(dǎo)雙基因修飾 23中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院3.3 cr-RNA：Cas介導(dǎo)雙基因修飾介導(dǎo)雙基因修飾 24中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 這是一項(xiàng)靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項(xiàng)極具有這是一項(xiàng)靶向基因修飾的革新技術(shù)，一項(xiàng)極具有可能獲得諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)?？赡塬@得諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)。25中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 2013年年4月月12日在日在cell stem c

12、ell上發(fā)表的上發(fā)表的Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs一文中，作者一文中，作者利用利用TALENs和和CRISPRs對(duì)同一基因進(jìn)行修飾，效率分別為對(duì)同一基因進(jìn)行修飾，效率分別為0%-34%和和51%-79%。26中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析 而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來(lái)說(shuō)，而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來(lái)說(shuō)，CRISPRs比比TALENs更更容易操作，因?yàn)槊恳粚?duì)容易操作，因?yàn)槊恳粚?duì)TALENs都需要重新合成，而用于都需要重新合成，而用于CRISPR的的gRNA只需要替換只需要替換20個(gè)核苷酸就行。個(gè)核苷酸就行。27中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院4 CRISPR-Cas系統(tǒng)前景分析系統(tǒng)前景分析u 只需合成一個(gè)只需合成一個(gè)sgRNA就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，Cas蛋白不具特異性。蛋白不具特異性。u 編碼編碼sgRNA的序列不超過(guò)的序列不超過(guò)100bp，因此比構(gòu)建，因此比構(gòu)建TALENs和和ZF