通過母系血漿的高通量平行DNA基因組測序來進行胎兒染色體非整倍性的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷

1、通過母系血漿的高通量平行DNA基因組測序來進行胎兒染色體非整倍性的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷前言染色體非整倍性是很多配偶選擇做產(chǎn)前檢查的主要原因?，F(xiàn)在決定性診斷的方法主要靠破壞性的過程，比如絨毛膜取樣和羊膜穿刺術(shù)，然而這些方法都有流產(chǎn)的風(fēng)險。雖然胎兒的DNA可以在母親的血漿中找到，但是作為其中非常微小的部分，總是伴隨著大量母系DNA背景。因此胎兒基因組內(nèi)的非整倍性染色體數(shù)量上的不同對于母親血漿中全部的染色體序列表達就非常的微小。即使用非常精確的單分子計數(shù)方法比如數(shù)碼PCR，為了達到必要的分析精度仍必須分析大量的DNA分子，即需要大量的母系血漿。這樣我們就證明了使用獨立位點的方法比定位于某一基因位點的方法將極

2、大的提高從相同一定容量的血漿中可供分析的非整倍性染色體目標分子的數(shù)量。因此我們?yōu)榱诉_到產(chǎn)前胎兒二十一三體綜合癥的無創(chuàng)檢測，應(yīng)使用高通量平行基因組測序來量化母系DNA序列。我們檢測了28個懷孕六個月內(nèi)母親的血漿樣本并正確辨別出了其中14個二十一三體綜合征胎兒和14個整倍性胎兒，高通量平行血漿DNA測序展示了一個為所有孕婦進行無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒染色體非整倍性診斷的新途徑。正文檢測胎兒非整倍性是許多孕期婦女做產(chǎn)前診斷的主要原因。傳統(tǒng)的產(chǎn)前檢測方法包括絨毛膜取樣和羊膜穿刺術(shù)，這些具有破壞性的取樣方法有可能導(dǎo)致流產(chǎn)，因此許多人都在研究無創(chuàng)取樣方法，其中超聲波掃描和母親血清的生物化學(xué)標記被證明是有效的篩選方法，

3、然而他們發(fā)現(xiàn)的是負現(xiàn)象而不是染色體異常的病理學(xué)特征。這些方法也存在很大的局限性，比如妊娠期適用性和同時需要聯(lián)合多個標記，甚至需要通過不同的時間節(jié)點來達到一個臨床上有用的靈敏度和特異性。為了從母親血樣中直接檢測胎兒的染色體和基因組異常，早期的工作聚焦于如何將稀少的胎兒有核細胞從母親血漿中分離出來。1997年發(fā)現(xiàn)的母親血漿中無細胞胎兒核酸開創(chuàng)了新的可能，然而胎兒DNA僅僅占母親血漿DNA的很小部分。絕大多數(shù)都是孕婦自己的DNA，這點造成了巨大的挑戰(zhàn)。最近，生物學(xué)家發(fā)明了大量的方法。一個策略以母親血漿中胎兒特異性的核酸作為目標，比如說胎盤的mRNA和DNA分子創(chuàng)造了一個胎盤特異性DNA甲基化信號。胎

4、兒的染色體劑量然后用目標分子中SNPs的等位基因比率分析來評估，這種策略叫做RNA-SNP等位基因比率法和表觀遺傳等位基因比率法。這種基于等位基因比率的方法只能用在被分析的SNPs位點上是雜合的胎兒中，所以為了提高這種方法的覆蓋率需要多樣的標記。為了創(chuàng)造一種從母系血漿中檢測胎兒染色體非整倍性的單獨多態(tài)性的方法，我們團隊最近提出了使用數(shù)碼PCR來進行相關(guān)染色體劑量（RCD）測量的原則。數(shù)碼RCD是用來數(shù)母系血漿中可能的非整倍性染色體的一個特殊位點的總數(shù)量，比如說二十一三體綜合癥中的二十號染色體，并且將其與參考染色體比較。因此我們檢測到由三條二十一號染色體帶來的基因位點與對照基因的微小增加時，我們

5、就可以診斷出二十一三體綜合癥，二十一號染色體序列成比例的增加預(yù)期就很小，因為胎兒DNA在母親血漿DNA中僅占很小一部分。為了可信的檢測出這個微小的增加，需要高精度地分析和計數(shù)大量確定數(shù)量的二十一號染色體和由數(shù)碼PCR試驗定位的位點的對照染色體序列。因此當部分富集的循環(huán)胎兒DNA非常低，比如說在早期懷孕時，就需要大量的母親血漿。另一種方法是進行多個遺傳位點的多樣化分析，然而多路復(fù)用的數(shù)碼PCR法的優(yōu)化十分具有挑戰(zhàn)性。如果使用熒光標記，我們就能很快地分辨出不同位點的各種標記。為了克服以上的限制，我們打算用一種獨立于任何特定基因位點的方法來計量母系血漿中二十一號染色體序列的數(shù)量。當使用獨立位點的方法

6、時，非整倍性染色體的每一個DNA片段都會對這條染色體的數(shù)量的計量產(chǎn)生影響。因此對任何固定容量的母系血漿中可計量的序列都比特定位點基因試驗中作為模版的DNA分子多，所以過量或較低的非整倍性染色體的表達更容易被精確地檢測出。我們之前提議高通量平行基因測序（MPGS）平臺會是無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒染色體非整倍性診斷DNA序列的一種方法。在這份研究中我們證明Solexa測序技術(shù)（Illumina）可以實現(xiàn)這個目標。結(jié)果過程框架。母系血漿中的無創(chuàng)胎兒染色體非整倍性檢測使用MPGS的過程框架按圖示表達在圖一中，在這份研究中我們使用了Solexa的合成測序方法。因為母系血漿中地DNA分子在自然條件下就已經(jīng)變成碎片了，

7、所以我們無需再將其碎片化。每個血漿DNA碎片的一個同源衍生拷貝的末端都進行了測序且用Illumina Genome Analyzer標準前測序生物信息學(xué)分析方法進行處理，后者使用了高效、大范圍核苷酸數(shù)據(jù)庫軟件分析（ELAND）。這個測試的目的在于簡單辨別測序血漿DNA碎片的染色體來源，但我們并不需要知道他們基因特異性位點的相關(guān)細節(jié)。每一個人類染色體上任何特定染色體的序列數(shù)量之后會被計數(shù)和制表。在這份研究中我們只數(shù)了沒有錯誤配對并且只能和對照人類基因組作一個位點映射的序列，比如說那些在人類基因組中視為特殊的那些序列。我們根據(jù)ELAND序列測試軟件（Illumina）的輸出數(shù)據(jù)把這些序列稱作U0-

8、1-0-0。然后我們用某一染色體的U0-1-0-0數(shù)除以所有樣本中的U0-1-0-0總數(shù)，通過該比例得出的值叫做%chrN。為了確定我們測試的母系血漿樣本屬于二十一三體綜合癥，我們需要計算一個叫做Z-score的值，這個Z-score是根據(jù)參照組數(shù)據(jù)平均值的標準偏差得出的。因此對于二十一三體綜合癥胎兒來說，我們就會看到其Z-score要高于整倍體胎兒。為了使無創(chuàng)產(chǎn)前胎兒非整倍性體染色體檢測的過程高效，必須符合幾個假設(shè)。首先，MPGS需要足夠靈敏來捕捉和產(chǎn)生在母系DNA的背景下所有胎兒DNA的小片段的序列讀數(shù)。其次，捕捉來做測序的血漿DNA碎片必須是在母系血漿中有類似染色體間的分布的具有代表性的

9、樣本。再次，對每條染色體上DNA測序的能力不應(yīng)有巨大偏見。當這些假設(shè)成立時，%chrN就能反映出母系血漿中母親和胎兒的基因表達。更甚的是，如果在母系血漿中，母親和胎兒的基因是平等表達的，每條染色體上成比例的血漿DNA序列的貢獻會產(chǎn)生人類基因組里每條染色體相對大小的關(guān)聯(lián)。如果%chrN值可以通過測序和點一個夠大的血漿DNA庫來使其變得足夠精確，我們假設(shè)可以辨別出大量映射到非整倍體染色體序列表達上的不同。我們準備分別測試這些假設(shè)。在母系血漿中檢測胎兒DNA。如果MPGS可以可以給母系血漿中胎兒DNA測序，那么我們就應(yīng)該可以檢測出血漿中有y染色體的DNA，如果孕婦懷的是男性胚胎，從四個懷著整倍體胎兒

10、的孕婦獲得的血漿樣本（三男一女）用Illumina的beta hIP-Seq-protocol進行處理，這個功能包括副本文件中所描述的化學(xué)凝膠電泳尺寸分流法步驟之前或之后的適配器綁定的DNA片段的放大。這四個樣本的臨床信息和測序的數(shù)據(jù)詳見S1表格。從每個樣本獲得的總的序列數(shù)約為9*106。每例中總的U0-1-0-0計數(shù)范圍為1.8*1062.0*106。映射到每個染色體的U0-1-0-0計數(shù)的比例見圖S1。對于這三個懷男性胎兒的孕婦，比如3009、3034和3143完全的和部分的映射到y(tǒng)染色體的計數(shù)分別為636（0.032%）、858（0.048%）和1054（0.056%）。然而沒想到177

11、（0.009%）的序列同樣映射到了y染色體，包括一個女性胎兒。對sry基因的實時PCR對著之后的血漿樣本產(chǎn)生了否定的結(jié)果。我們?nèi)缓罂紤]凝膠電泳時可能有男性序列污染的出現(xiàn)。血漿DNA的測序方案。我們創(chuàng)造了一個新的方案來為MPGS準備血漿DNA樣本，不需要凝膠電泳和二次放大步驟，這個新的和原來的方案作了對比，并且分別表示為方案A和方案B。為了將低DNA通量在測序結(jié)果中造成的偏差降到最低，三個血漿樣本每個都抽取了100ng的DNA。每個血漿樣本的一半（50ng）都用兩個方案作了處理，并且進行了同樣的測序。被測試的血漿樣本包括一個懷著女性胚胎的孕婦，一個懷著男性胚胎的孕婦,和一個兩個男性個體的血漿混合

12、體。最后一個樣本需要做混合那樣才能獲取100ng的DNA。這三個樣本分別叫作樣本1、2、3。每個樣本和每個方案的臨床細節(jié)和測序結(jié)果顯示在表格S2中?？傮w的U0-1-0-0結(jié)果分布在2.0*1062.2*106。全部和部分的使用新方案的樣本1、2、3的映射到y(tǒng)染色體的U0-1-0-0結(jié)果是184（0.009%）,1444（0.066%）和3523（0.175%）。相應(yīng)的，原來的方案的數(shù)值為218（0.011%），1615（0.077%）和3468（0.169%）。因此污染主要是由凝膠凈化產(chǎn)生，而二次放大步驟得不到證實。我們接下來探索了是否存在一個生物信息學(xué)的解釋，我們使用Basic Local

13、Alignment Search Tool（BLAST），來分析這三個樣本的每一個樣本和每一種方案的映射到y(tǒng)染色體的每一個U0-1-0-0序列。我們用BLAST評估了只能匹配到y(tǒng)染色體的DNA序列的所占比例。通過BLAST得出的特異性匹配到y(tǒng)染色體的序列的比例，分別用新的和舊的方案進行了對比（表格S3）。懷著女性胎兒的孕婦的血漿樣本，只有30%的通過ELAND映射到y(tǒng)染色體的序列被BLAST確證只映射到y(tǒng)染色體。這和樣本2、3形成了鮮明的對比,他們有超過90%被ELAND映射到y(tǒng)染色體的序列可以被BLAST確證。盡管如此，懷有男性胎兒孕婦的血漿樣本中檢測出的y染色體序列可以證明母系血漿中的胎兒

14、DNA可以用MPGS進行測序。為了確認ELAND軟件得出的U0-1-0-0序列有著比較小的映射錯誤，我們進行了一個涵蓋三個血漿DNA樣本的在每一個染色體上的利用新方案進行的基于120個隨機選擇的U0-1-0-0序列的BLAST分析，正如表格S4所示。在選取的測試的序列中大于99%的利用ELAND來映射到常染色體的U0-1-0-0序列被BLAST確認只匹配到相應(yīng)的染色體。樣本一中所有的120個ELAND映射的x染色體序列都被BLAST確認了，它僅包含女性DNA。樣本二和三中超過97%ELAND映射的x染色體序列被B LAST所確認，它們包含男性DNA。這些數(shù)據(jù)表明ELAND所映射的U0-1-0-

15、0序列除去y染色體外還是基本上非常準確的。母系血漿DNA序列在人類染色體中的分布。樣本一、二、三分別計算了每一個染色體的U0-1-0-0數(shù)量占所有序列的U0-1-0-0的比例的貢獻。為了調(diào)查是否母系血漿DNA序列在人類基因組重平均分布，我們比較了血漿DNA數(shù)據(jù)和每條染色體的期望的基因貢獻。我們主要的目的是分析占支配地位的DNA背景為女性的母系血漿DNA。因此我們計算了一下基因的相對表達，比如說每條染色體的大小，基于一位女性參考者的單倍體人類基因組的每條染色體的核苷酸構(gòu)成，每條染色體的相對大小和測序的血漿DNA樣本的U0-1-0-0序列的染色體貢獻的比例被繪在一起。正如圖表2中所示，使用新方案進

16、行的血漿DNA的標本，比如說樣本1A、2A和3A，和每個人類染色體預(yù)想中的基因表達比相關(guān)的用原來方案進行的標本，比如說樣本1B、2B和3B都更加相似。我們進行了線性回歸分析來比較，從新舊兩種方案中獲得的每個染色體的百分之U0-1-0-0和在人類基因組中每個染色體的預(yù)期的基因表達。正如圖表S2所示，樣本1A、2A和3A中獲得的斜率大于0.95，而樣本1B、2B和3B分別為0.755，0.795和0.859。樣本1A、2A和3A的R2大于0.980，但是樣本1B、2B和3B分別為0.803，0.840和0.910。這些數(shù)據(jù)客觀上證實了只有一個PCR放大步驟的和疏忽了凝膠電泳過程的DNA處理方案會產(chǎn)

17、生一個大量的序列的簡況，比原來的方案更好的符合每條人類染色體的基因構(gòu)成。更重要的是這些數(shù)據(jù)表明母系血漿的DNA分子的在人類基因組中的總體分布是相當平均的。母系血漿樣本（1A和2A）的DNA分子的染色體分布和成年男性血漿（樣本3A）是相似的。這些觀察結(jié)果表明母系血漿中的母親和胎兒的DNA序列不太可能在它們的基因分布上有顯著的不同。否則如果母親DNA和胎兒的DNA在基因分布上有著本質(zhì)上的不同，我們可以預(yù)見總體的基因表達會和非懷孕的人類血漿DNA樣本有差異。從母系血漿中檢測出胎兒二十一三體綜合癥。我們進一步測試是否胎兒的染色體非整倍性會導(dǎo)致非整倍性染色體的匹配序列的百分比貢獻中的數(shù)量上的擾動。血漿樣

18、本采自六月之內(nèi)的十四個懷著整倍體胎兒的孕婦和十四個懷著二十一三體綜合癥胎兒的孕婦。胎兒的染色體狀態(tài)由完全的人類染色體核型分析來確認。二十八個孕婦的血漿DNA(平均懷孕周數(shù)為14.1周)用新的方案來處理并且進行了測序，每個樣本的臨床細節(jié)和測序結(jié)果展示在表格S5中。二十八個樣本間隔六周分兩批進行處理并且流動地在四組細胞中進行測序。每個樣本產(chǎn)生的平均序列數(shù)為10.8*106。平均的U0-1-0-0數(shù)為2.5*106。每條染色體的U0-1-0-0序列的百分比貢獻和人類基因組的每條染色體的基因表達的百分比標繪在一起，見圖S3。二十一號染色體和x號染色體的數(shù)據(jù)展示在圖表3A里。和二十一號染色體相匹配的U0

19、-1-0-0序列的百分比在二十一三體綜合癥中比整倍體樣本稍高，女性胎兒與男性胎兒相比%chrX更高而%chrY更低。為了客觀的計量二十一三體綜合癥胚胎的二十一號染色體序列的過量表達的程度，我們使用十個整倍體男性胚胎的數(shù)據(jù)作為一個參考群體來數(shù)每條染色體的%U0-1-0-0平均值和SD值。參考群體被限制為整倍體男性胚胎，這樣的話%chrX在女性胚胎中將會觀察到一個預(yù)期的增長。使用這些參考值，我們數(shù)了這二十八個樣本除了Y染色體外的每一條染色體的z值，結(jié)果顯示在圖表S4中。二十一號染色體和X染色體的z值展示在圖表3B中。所有的二十一三體綜合癥的樣本在二十一號染色體上都有一個大于3的z值（在5.03-2

20、5.11之間），比如與建立在整倍體男性胚胎參考組相比其標準偏差為3。女性胚胎的樣本在X染色體上有z值大于1.67。所有二十八個樣本中的其他染色體z值都在+-3之間。染色體表達的百分比的計量的重現(xiàn)性。在測試的二十八個母系血漿樣本中，我們預(yù)計在二十一三體綜合癥和整倍體胚胎的%chr21表達上和女性及男性胚胎的%chrX表達上有差異。然而非常有趣我們觀察到%chr21表達只有一個非常微笑的絕對差異，這個之后引起了巨大的z值差，但是%chrX表達上的巨大的差異隨后反而引起了樣本中z值上的微笑的差異（圖表3）。男性和女性胚胎中的X染色體的絕對差異本來預(yù)想要比二十一三體綜合癥和整倍體胚胎的21號染色體的數(shù)

21、據(jù)要大得多。因為一個女性要比男性在X染色體的劑量上要多2倍，但是二十一三體綜合癥比整倍性個體在21號染色體的劑量上只高了1.5倍。此外，X染色體要比21號染色體更大并且在男性胚胎中貢獻了一個均值達到9.5*104的U0-1-0-0數(shù)值，而所有樣本中21號染色體貢獻的均值只有3.2*104。因為z值反映了參考數(shù)據(jù)庫均值的作為SDs數(shù)量表達的計量上的更多的區(qū)別，我們假定，SD在%chr21的衡量中非常小，但是在%chrX的衡量中非常大。既然數(shù)據(jù)庫的SD事實上反映了其計量方法的精確性，我們使用了十個整倍性男性胚胎的數(shù)據(jù)來數(shù)，每個染色體的表達的計量百分比的變化系數(shù)（CV=SD*100%/平均值）。正如

22、表格S6所示，二十一號染色體在所有的染色體里CV第三低（0.54），%chrX的CV=3.1%。因為X染色體的U0-1-0-0序列的絕對計量數(shù)比二十一號染色體高三倍，序列的數(shù)量不能夠解釋精度上的變化。我們因此探索了%U0-1-0-0計數(shù)的CV值和每條染色體的GC容量之間的關(guān)系（圖表S5）。人類染色體可以根據(jù)GC容量的不同水平被分成五組。組一染色體水平最低，組五染色體水平最高。非常有趣地，五組染色體的CVs統(tǒng)計學(xué)差異顯著（P<0.001，ANOVA）。BonferroniT測試確定了第五組的CV值統(tǒng)計學(xué)上比其他四組更高（P<0.05）。第四組和第一組的CV值統(tǒng)計學(xué)上比第二組和第三組更

23、高（P<0.05）。討論我們已經(jīng)證明了MPGS可被用來作為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的一種診斷工具。我們也展示了二十一三體綜合癥胎兒與整倍體胎兒的母系血漿中的二十一號染色體DNA序列的數(shù)量上的差異可以被清楚地檢測出來。男性胚胎和女性胚胎在母系血漿中X染色體和Y染色體兩種DNA序列數(shù)量上的差異也能夠被清楚地觀測到。MPGS的區(qū)分染色體上的基因分布的微小的數(shù)量上的擾動的能力在于對非常大量的分子的分析，這點能夠使數(shù)量上計量的不精確性最小化。因為沒有定位到某一特定的基因位點，所有的血漿DNA碎片一起提供了一個空前的每個分析樣本的分子的數(shù)量。這種方法和現(xiàn)今的方法有顯著的不同，現(xiàn)今的方法一般來說都是只計量能作為位

24、點特異性PCR測試模版的DNA分子，比如說Y染色體上的SRY?；蛭稽c特異性的DNA模板只代表了母系血漿中一個極小部分的DNA碎片。事實上，MPGS是血漿DNA分子的相對基因表達的計量的如此強大的工具，只有人類基因組中數(shù)量和代表性碎片一致的那一部分需要測序。比如說每個血漿樣本產(chǎn)生約一千萬個36核苷酸的讀取框，這只相當于人類基因組的十分之一。此外，在這份研究中只有占每個血漿DNA樣本測序閱讀框20%的U0-1-0-0序列，被用來產(chǎn)生關(guān)于染色體分布情況的定量信息。因此，這和之前描述的一些為定量核苷酸信息并且依靠高覆蓋的測序技術(shù)的依賴測序的方法相當不同，比如說決定在轉(zhuǎn)入組分析中RNA種類的相對豐度。

25、相反，我們現(xiàn)在的方法只簡單的測序了人類基因組的隨機的代表性的片段，大部分DNA片段最多只測序了一次。相關(guān)的染色體大小隨后靠數(shù)染色體匹配的序列的相對數(shù)量來推導(dǎo)出。所數(shù)出的每一個DNA片段的核苷酸序列都是不同的。事實上，每次我們得到的一個樣本的DNA序列池都不同。盡管測序存在隨機性，但是%chr21序列的定量估計如此的精確和堅定，二十一三體綜合癥孕婦的二十一號染色體的z值和對照組的整倍體樣本的平均值有顯著差異。在這份研究中二十一三體綜合癥孕婦的懷孕時間（14.1周）和整倍體組的平均值（15.4周）有的比。所有整倍體組的樣本都是在任何目前懷孕過程中的侵入性過程之前收集的。十一個二十一三體綜合癥孕婦的

26、血樣是在侵入性的產(chǎn)前診斷過程造成的妊娠終止前馬上采集的，平均天數(shù)是六天（范圍在2至22天）。我們目前的研究表明在羊膜穿刺幾天后采集的樣本的胎兒DNA中沒有任何實質(zhì)的區(qū)別。盡管如此，從三個二十一三體綜合癥孕婦所采集的血樣（樣本17、19和25，表格S5），是在絨毛膜取樣之前的三周里采集的。因為二十一號染色體帶來的z值的增加已經(jīng)可見（圖表3B）。理論上，任意染色體上的一定量擾動的存在的決定因素都能夠更精確的達到，例如，考慮胎兒DNA的濃度能夠預(yù)估染色體擾動的預(yù)期程度。胎兒DNA的濃度通過胎兒表觀遺傳標記或者父系遺傳的多態(tài)標記會很容易的測量出來。在我們的研究中，每個樣本中的胎兒DNA濃度不需要源自決

27、定每個樣本疾病情況的臨界值。首先，根據(jù)表格S6，二十一號染色體是表達百分比能被我們目前的非常低精確度的方案所計量的染色體的一個。第二，當與單核數(shù)碼RCD這樣的方法作比較時，這個方法需要與胎兒DNA濃度相關(guān)的疾病臨界值，更多的二十一號染色體的序列是靠測序來計量的。對于數(shù)碼RCD，我們報告了對于一個胎兒DNA濃度達到25%的樣本來說，為了達到97%的正確的分類率我們需要做7680個數(shù)碼PCRs。我們現(xiàn)在的數(shù)據(jù)同樣顯示20%的相當于1536個二十一號染色體分子，7680孔實驗的分析的數(shù)碼PCRs的總數(shù)量，會包括只有二十一號染色體的基因目標，因此是有益的。因此，通過測序方法分析的二十一號染色體分子的數(shù)

28、量（平均值為3.2*104）是數(shù)碼RCD方法的20倍。因此，這種測量會比現(xiàn)在的數(shù)碼PCR分析的范圍明顯更精確。然而考慮到胎兒DNA的濃度，對一些其他染色體或其他批次的的染色體表達的百分比的計量可以做得更精確并因此能夠使錯誤的診斷最小化。事實上，決定母系血漿DNA的基因表達的MPGS的準確度和精確度都能夠通過一系列的交測序分析策略得到改善。例如，出現(xiàn)在已知拷貝多態(tài)性區(qū)域的序列可以被調(diào)整使整倍性懷孕參考范圍更緊密。比如說，在某些情況下與參考基因有1-2處錯誤配對的序列而不是U0-1-0-0，可能就會在測試樣本和參照的人類基因組中表現(xiàn)出多態(tài)的不同，也可能被用來提高可用測序的數(shù)量。我們同時也展現(xiàn)了血漿

29、DNA序列的貢獻比率的測量的再現(xiàn)性在染色體中和染色體GC容量的不同可以部分解釋這種多樣性。因此，每一個樣本需要做的測序的數(shù)量可以改變，來確保每一個其他染色體的定量擾動的發(fā)現(xiàn)的計量可以被是做的足夠準確。事實上，我們預(yù)測，如果計算充足的血漿DNA片段，MPGS就能夠精確的檢測出包含在小于全染色體的區(qū)域的數(shù)量上的失常。我們找到一個當與其他染色體作比較時，Y染色體的ELAND匹配的精確性的不符之處。這有可能歸因于已知的許多Y染色體中重復(fù)序列的存在。即便反復(fù)掩蓋，許多留下的Y染色體序列依舊暴露在低拷貝數(shù)重復(fù)序列之下，后者提高了精確匹配如是序列的困難。盡管如此，對于懷著女嬰的孕婦來說，仍然可以發(fā)現(xiàn)一小部分匹配到Y(jié)染色體。對于男性DNA來說這些血漿樣本是陰性的這點我們已經(jīng)通過業(yè)界廣泛使用的SRY實時PCR實驗論證了。MPGS方法比實時PCR方法更靈敏