AnneinV,PI雙染方法

1、Annexin V是一種檢測(cè)細(xì)胞凋亡的試劑,在正常細(xì)胞中,磷脂酰絲氨酸只分 布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),細(xì)胞發(fā)生凋亡早期,膜磷脂酰絲氨酸PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè).Annexin V作為一種磷脂結(jié)合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親 和力,它通過(guò)細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合.因此 Annexin V是檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo).細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的根本特征之一,它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境 的穩(wěn)定等方面起著十分重要的作用.在正常細(xì)胞中,磷脂酰絲氨酸PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),而在細(xì)胞凋亡早期,細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸PS 由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè).Annexin V是一種分子量為3

2、5-36kD的Ca依賴(lài)性磷脂結(jié) 合蛋白,能與細(xì)胞凋亡過(guò)程中翻轉(zhuǎn)到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合.用標(biāo)記了 FITC的Annexin V作為熒光探針,利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡 可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完整的.Propidium iodide PI是一種核酸染料,它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜,但在凋亡中晚期的細(xì) 胞和死細(xì)胞,PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色.將 Annexin V與PI匹 配使用,可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái).離心收集懸浮細(xì)胞,微量離心機(jī)轉(zhuǎn)速 2000RPM,離心時(shí)間5min,棄培養(yǎng)基； 用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次；用 400ul 1

3、X Binding Buffer 懸浮細(xì)胞,濃度大約為 1 X 10 cells/ml ；在細(xì)胞懸浮液中參加5ul Annexin V-FITC ,輕輕混勻后于2-8 °C避光條件下 孵育15分鐘.5.參加10ul PI后輕輕混勻于2-8 C避光條件下孵育5分鐘；在1小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測(cè).使用流式細(xì)胞儀正確分析Annexin V-FITC/PI雙染的細(xì)胞前要求儀器的熒光 補(bǔ)償來(lái)去除兩種染料激發(fā)光之間的疊加.由于熒光補(bǔ)償設(shè)置與PMT的電壓直接相關(guān),所以不同儀器之間的補(bǔ)償不同.建議在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始階段分析經(jīng)Annexin V、PI分別單染的細(xì)胞來(lái)調(diào)整熒光補(bǔ)償去除光譜重疊.根據(jù)未處

4、理細(xì)胞空白對(duì)照和 經(jīng)Annexin V、PI分別細(xì)胞染色后的單染對(duì)照的分析設(shè)定十字門(mén)的位置.Apoptosis-Annexjn V *鬲/邢至1 .上樣未經(jīng)染色的細(xì)胞,在線性 FS-SS點(diǎn)圖上顯示細(xì)胞并設(shè)門(mén)圈出目標(biāo)細(xì)胞 群體.2 .建立LogFL1-LogFL2 最好用FL3雙參數(shù)點(diǎn)圖并分析以上光散射圖中設(shè) 門(mén)的細(xì)胞；保證98%的細(xì)胞處于在X、Y軸Log 1為邊界的左下象限中央?yún)^(qū)域.3 .檢測(cè)annexin V-FITC單染的細(xì)胞并檢查FL1-FL2 或FL3散點(diǎn)圖,保證 在左上和右上象限內(nèi)沒(méi)有顆粒.如果有顆粒出現(xiàn)在上端象限那么說(shuō)明有熒光滲漏； 此時(shí)FL1的熒光被FL2 或FL3 PMT檢測(cè)到

5、了.為了糾正這種現(xiàn)象,增加 FL1漏到FL2 或FL3熒光的補(bǔ)償 這可能在1-5%之間.如果這個(gè)調(diào)節(jié)沒(méi) 有有效地去除FL2的陽(yáng)性信號(hào),此時(shí)要降低 FL2 或FL3 PMT的電壓.4 .檢測(cè)PI單染的細(xì)胞并檢查FL1-FL2 或FL3散點(diǎn)圖,保證在右上和右下 象限內(nèi)沒(méi)有顆粒.如果有顆粒出現(xiàn)在右側(cè)象限那么說(shuō)明有熒光滲漏；此時(shí) PI的熒 光被FL1 PMT檢測(cè)到了.為了糾正這種現(xiàn)象,增加 FL2 或FL3漏到FL1熒 光的補(bǔ)償 這可能在15-25%之間.如果這個(gè)調(diào)節(jié)沒(méi)有有效地去除 FL1的陽(yáng) 性信號(hào),此時(shí)要降低FL1 PMT的電壓.注：如果在以上調(diào)節(jié)補(bǔ)償過(guò)程中更改了 PMT的電壓,建議重復(fù)3、4步驟

6、, 保證不引起過(guò)度熒光補(bǔ)償.過(guò)度補(bǔ)償可以從陽(yáng)性細(xì)胞十分貼近從標(biāo)這一現(xiàn)象觀察 出來(lái).一個(gè)恰當(dāng)?shù)难a(bǔ)償應(yīng)該是單陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度與落在左下Log 1為邊界象限中間陰性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度一致.5 .設(shè)定十字門(mén)的位置,FL1和FL2 或FL3的劃定方法如下：5.1 設(shè)定FL1標(biāo)尺位置：處于左下象限內(nèi)的大群細(xì)胞是 Annexin V染色陰性 的細(xì)胞一般這些細(xì)胞會(huì)在FL1軸方向上升至2個(gè)對(duì)數(shù)坐標(biāo)值.將垂直的FL1 標(biāo)尺設(shè)定在緊靠Annexin V陰性群體右側(cè)0.1-0.2Log單位的地方.5.2 設(shè)定FL2 或FL3標(biāo)尺位置：可以通過(guò)一定數(shù)據(jù)的雙陽(yáng)性細(xì)胞來(lái)區(qū)分 PI+和PI-的細(xì)胞群體.在此條件下可能會(huì)識(shí)別出兩群細(xì)胞,一是位于散點(diǎn)圖的右下方ANN+/PI-還有就是右上方ANN+/PI+ .水平線可以置于這兩群細(xì)胞 的中間.如果在分析的細(xì)胞群體中沒(méi)有 PI+細(xì)胞,區(qū)分PI+細(xì)胞最好是參照雙陰 性細(xì)胞群體,將水平線設(shè)在雙陰性細(xì)胞以上0.1-0.3 Log單位的地方.注：在陰性群體門(mén)以外的細(xì)胞可被識(shí)為 Annexin V或Annexin V和PI陽(yáng)性的 細(xì)胞.熒光顯微鏡觀察：滴一滴用Annexin V-FIT