中藥中皂苷類化合物的抗氧化活性評價研究

1、中藥中皂苷類化合物的抗氧化活性評價研究【摘要】目的以人參、西洋參、三七中的皂苷類化合物為研究對象研究其抗氧化性能。方法采用Photochemi-luminescence (PCL)抗氧化活性體外評價體系為分析平臺系統(tǒng)考察皂苷類化合物的抗氧化活性，并利用DPPH法進行對照評價。結(jié)果人參、西洋參和三七95%乙醇提取的皂苷類化合物均具有一定的清除自由基活性，并且隨著皂苷含量的增加，其清除自由基能力增強。結(jié)論PCL法成功應(yīng)用于皂苷類化合物的清除自由基能力研究。 【關(guān)鍵詞】 人參； 西洋參； 三七； 皂苷類化合物； 抗氧化活性The Antioxidative Activity Evaluations

2、of the Saponins in Traditional Chinese MedicineWANG Jing,LIU Chunming*,BAI Helong,LI Li（Changchun Normal University,Changchun，Jilin 130032,China）Abstract：ObjectiveTo explore the antioxidative activity of the saponins in Panax ginseng, Panax quinquefoljus and Panax notoginseng. MethodsPhotochemi-lumi

3、nescence (PCL) was applied to determine the antioxidative activity of the saponins for the first time, and DPPH method was developed for evaluating the scavenging activity of the extracts.Photochemi-luminescence (PCL) was applied to determine the antioxidative activity of the saponins for the first

4、time, and DPPH method was developed for evaluating the scavenging activity of the extracts.ResultsThe saponins of 95% ethanol extracts from Panax ginseng, Panax quinquefoljus, Panax notoginseng had obvious anti-radical capacity, the efficiency inereased with the contents of major saponins extracted

5、from plants.ConclusionPCL method is successfully applied to study the the antioxidative activity of the saponins.1 材料與儀器 實驗所用液相試劑均為色譜純試劑（Caledon LaboratoriesL Ltd公司，加拿大），0.45 m濾膜（安捷倫公司，美國），其它試劑為分析純 （北京化工廠），用于PCL 分析的溶劑由AnalytikJena AG公司 （德國）提供。二苯基苦基苯肼自由基 （1，1 -diphenyl- 2 - p icryhydrazyl， DPPH）購于Sig

6、ma公司（美國）。人參切片、西洋參切片、三七根部藥材均購于北京同仁堂大藥房（長春分店），人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rb2，Rc，Rd和三七皂苷 R1對照品購于中國藥品生物制品檢定所。Agilent-1100高效液相色譜(安捷倫公司，美國)；DU800紫外可見分光光度計(Backman公司，美國)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)；S180H超聲清洗器(Elma 公司，德國)；BS 124S電子天平( Sartorius AG，德國)；耶拿Photochem抗氧化劑與自由基分析儀（AnalytikJena AG 公司，德國）。2 方法2.1 樣品溶液的制備分別精密稱取人參、西洋參、三七藥材

7、粉末 (0.15 mm粒徑) 1.006 3 ，1.004 7 ，1.002 7 g。用30 ml，95%乙醇浸泡(2 h)超聲提取 30 min，提取3次。將乙醇提取液過濾，減壓回收乙醇，濃縮至干，殘渣用甲醇溶解過 0.45 m濾膜，定容于10 ml容量瓶中，制得人參、西洋參和三七樣品溶液。 分別精密稱取人參、西洋參、三七藥材粉末 (0.15 mm粒徑) 1.005 6 g、1.004 8 g和1.006 9 g。用30 ml，95%乙醇浸泡(2 h)回流提取2 h，提取3次。將乙醇提取液過濾，減壓回收乙醇，濃縮至干，殘渣用甲醇溶解過 0 . 45 m濾膜，定容于10 ml容量瓶中，制得人參

8、、西洋參和三七樣品溶液。 分別精密稱取人參、西洋參、三七藥材粉末 (0.15 mm粒徑) 1.007 8 g 1.0063 g和1.006 0g。用30 ml，95%乙醇浸泡(2 h)60水浴溫浸提取 2 h，提取3次。將乙醇提取液過濾，減壓回收乙醇，濃縮至干，殘渣用甲醇溶解過 0.45 m濾膜，定容于10 ml容量瓶中，制得人參、西洋參和三七樣品溶液。2.2 高效液相色譜條件采用美國Agilent1100系統(tǒng)，DAD二極管陣列檢測器。Agilent 1100 Series自動進樣器；Agilent-C18 色譜柱 (4.6 mm 250 mm，5 m) (美國安捷倫)，柱溫 35。采用二元線

9、性梯度洗脫，流速為0.5 ml /min，流動相組成為乙腈（A），0.05%的磷酸水溶液（B），樣品分析時間為50 min，樣品進樣量為10 l，檢測波長為203 nm。流動相梯度：02 min，75%75%B；250 min，75%50% B。2.3 抗氧化活性的PCL法分析采用Photochem (Berlin, Germany)超快速抗氧化劑和自由基全自動分析儀，測定原理是由光化學(xué)法生成自由基，并利用化學(xué)發(fā)光法檢測自由基。發(fā)光氨(Luminol)是一種光致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，通過測量反應(yīng)所生成的光強度來測量自由基的瞬間含量（光強與自由基含量成正比）14。在實驗中使用有光化學(xué)激發(fā)作用的光敏劑（P

10、hotosensitizer，發(fā)光氨）激發(fā)反應(yīng)分子，使之在紫外燈的作用下以比正常條件下快1000倍的速度發(fā)生氧化反應(yīng)，迅速產(chǎn)生自由基。 采用PCL-ACW-Kit方法測量人參、西洋參和三七提取物中水溶性成分的抗氧化活性。首先，配置分析混合液為 1.0 ml 反應(yīng)緩沖液，包括 0.1 mol/L Sodium Carbonate (pH 10.5)和0.1 mmol/L Na2-EDTA；1.5 ml ACW-diluent (water)；1 mmol/L Luminol（25 l），作為光敏劑激發(fā)反應(yīng)分子，使其迅速產(chǎn)生自由基，同時又作為光致化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。樣品和標準品均為10 l。每個樣品平行

11、測試2次。2.4 抗氧化活性的DPPH法分析二苯基苦基苯肼自由基 (DPPH) 是一種性質(zhì)較為穩(wěn)定的自由基，其溶液顯紫色，在 515 nm處有最大吸收，當有自由基清除劑存在時，DPPH的單電子由于被配對，其濃度減小而使其顏色變淺，吸光度值變小，這種顏色變淺的程度與配對電子數(shù)成化學(xué)計量關(guān)系，因此可用比色法進行定量分析。清除劑直接作用于DPPH自由基，反應(yīng)時間短，用分光光度計即可測定，該方法操作簡單、直接、靈敏、快速，因此DPPH分光測定法在國內(nèi)外廣泛用于清除自由基物質(zhì)性質(zhì)的研究。 取0.1 ml樣品溶液，加入2 ml的60 mol/L的DPPH溶液混勻，放置30 min，以原溶劑調(diào)零點，在515

12、 nm處測起吸光度為Ai；同法0.1 ml溶劑+2 ml DPPH溶液混勻測定吸光度極為Ac；0.1 ml樣品溶液+2 ml溶劑混勻測定吸光度極為Aj。按下述公式計算其自由基清除率。 清除率（%）=1-（Ai-Aj）Ao100% IP（）1-（Ai-Aj）/Ac100%，其中Aj反應(yīng)樣品自身對吸光度的貢獻；Ai樣品對DPPH作用后的吸光度數(shù)值；Ac為DPPH本身在測定波長的吸收。3 結(jié)果3.1 提取方法的確定人參、西洋參、三七的乙醇超聲提取物以及對照品的液相色譜圖示于圖1。分別采用3種提取方法提取3種藥材中的皂苷類化合物。結(jié)果見圖2。對于3種藥材，超聲提取的效果均較好，皂苷類化合物含量較高，且

13、快速、安全、簡便、溶劑消耗少，常溫提取其成分又不會被破壞，這一結(jié)果與文獻所報道一致15。3.2 自由基清除作用的評價研究3.3 提取物清除自由基能力的比較根據(jù)所測得到人參、西洋參、三七中的主要皂苷的總量(見圖2)。同時結(jié)合提取物對自由基的清除實驗，可以看出兩個實驗體系中所得到的提取物對自由基的清除效果基本一致（見圖34）。對于三七的提取物來說，其清除自由基的效果隨著皂苷含量的增加而顯著增大，對于提取的皂苷含量，超聲提取法回流提取法溫浸提取法（見圖2），其清除自由基能力也是超聲提取法回流提取法溫浸提取法（見圖34）。而西洋參和人參提取物的皂苷含量和其清除自由基能力的趨勢略有差別。實驗結(jié)果表明，二者都是超聲提取法提取的效果要高于回流提取；但在清除自由基實驗中，回流提取法卻表現(xiàn)出最好的清除自由基能力，超聲提取法次之，但二者的差別較?。欢鴮ξ餮髤⒑腿藚碚f皆是溫浸提取法的提取的皂苷含量最低，其清除自由基能力也最弱。這可以說明皂苷的含量對于自由基的清除能力有一定的影響，而之所以在西洋參和人參的提取物中出現(xiàn)了皂苷含量與其清除自由基能力不相符的想象，有可能是由于回流提取法提取溫度較高，提取的成分較復(fù)雜，對于自由基的清除能力產(chǎn)生了一定影響，這有待