Affymetrix全轉(zhuǎn)錄本芯片實(shí)驗(yàn)流程

1、 Whole Transcript 芯片實(shí)驗(yàn)流程簡介簡要流程 各個(gè)步驟所需時(shí)間第一天 rRNA 消減 1.5小時(shí) (僅針對(duì) Exon 芯片 第一次循環(huán), cDNA 合成 3小時(shí)cRNA 合成 16小時(shí)第二天第二次循環(huán), DNA 一鏈的合成、片段化及標(biāo)記 8小時(shí) 雜交第三天 第 天洗滌、染色和掃描 2小時(shí) 實(shí)驗(yàn)的起始PolyA 的參入Gene Array RNA起始量 100ng 300ng Exon Array RNA起始量 1ug 2ug根據(jù)操作手冊(cè)中的比例,參入 poly A內(nèi)標(biāo)記 rRNA 的消減和檢測(cè)針對(duì) Exon 芯片 片使用 Agilent BioAnalyzer 2100檢測(cè)消減

2、結(jié)果 RNA 消減后 的純化 rRNA 消減結(jié)果檢測(cè) (Exon 芯片第一次循環(huán),cDNA 一鏈的合成加入含有 T7的隨機(jī)引物 70度 5分鐘, 4度至少 2分鐘配制 cDNA 第一鏈合成試劑 分鐘 分鐘 分鐘 25度 10分鐘, 42度 60分鐘, 70度 10分鐘, 4度 2分鐘 第一次循環(huán),cDNA 二鏈的合成氯化鎂的稀釋二鏈合成體系的配制 16度 120分鐘(無熱蓋, 75度 10分鐘(加熱蓋, 4度 2分鐘。 cRNA的合成和純化1. cRNA 合成體系的配制2. 37度 16小時(shí)(過夜 IVT3. 第二天使用純化柱純化 cRNA4. 兩次洗滌提高產(chǎn)量5. Nanodrop 測(cè)定濃度

3、6. -80度可保存 cDNA一鏈的合成 70度 5分鐘, 25度 5分鐘, 4度 2分鐘 cRNA的水解和 DNA 單鏈的純化加入 1. RNaseH37度 45分鐘, 95度 5分鐘, 4度 2分鐘。2. 使用試劑盒對(duì) DNA 單鏈進(jìn)行純化3. Nanodrop 進(jìn)行定量4. -20度保存 DNA單鏈的片段化DNA 單鏈溶液配置 Frag 體系配置 37度 60分鐘, 93度 2分鐘, 4度 2分鐘BioAnalyzer 2100檢測(cè), -20度保存 DNA單鏈片段化結(jié)果檢測(cè) 片段化后DNA 單鏈的標(biāo)記 37度 60分鐘, 70度 10分鐘, 4度 2分鐘 雜交體系的配置 雜交條件45度,

4、 60rpm , 17±1小時(shí) 洗滌,染色和掃描1. 采用 Affymetrix 洗滌染色試劑盒2. 根據(jù) protocol ,分裝不同的染色液3. 根據(jù)芯片類型,選擇不同的洗滌程序4. 洗滌和染色大致為 90分鐘5. 根據(jù)芯片的不同,掃描時(shí)間不一 芯片質(zhì)控和數(shù)據(jù)分析 1. 芯片掃描圖片觀測(cè) 2. 使用Expression Console進(jìn)行QC 3. 選擇其它軟件進(jìn)行高級(jí)數(shù)據(jù)分析 Th W The Way Ahead. Ah d ©2004 Affymetrix, Inc. All rights reserved. Affymetrix, the Affymetrix l

5、ogo, and GeneChip, and The Way Ahead are registered trademarks and CustomExpress, q, NetAffx, , and Tools to take you y as far as your y vision are trademarks owned or used by y Affymetrix, y , Inc. MegAllele g is a trademark of ParAllele CustomSeq, BioScience. Array products may be covered by one or more of the following patents and/or sold under license from Oxford Gene Technology: U.S. Patent No's. 5,445,934; 5,744,305; 6,261,776; 6,291,183; 5,700,637; 5,945,334; 6,346,413; 6,399,365; and 6,610,482 ; and EP 619 321; 373 203 and