伴與不伴遠處轉(zhuǎn)移乳頭狀甲狀腺癌患者血清的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析及

1、伴與不伴遠處轉(zhuǎn)移乳頭狀甲狀腺癌患者血清的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析及篩選模型的建立        【摘要】     目的比較伴遠處轉(zhuǎn)移與不伴遠處轉(zhuǎn)移的乳頭狀甲狀腺癌(PTC)患者血清的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，建立伴遠處轉(zhuǎn)移PTC患者的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜篩選模型。方法收集36例伴遠處轉(zhuǎn)移PTC患者和29例不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC患者的血清，其中建模組45例(伴遠處轉(zhuǎn)移PTC 26例，不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC 19例)，盲法篩選組20例(伴遠處轉(zhuǎn)移PTC 10例，不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC 10例)。 采

2、用固定金屬親和表面(IMAC3)芯片，以表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)測定得到血清蛋白質(zhì)譜。運用Ciphergen Proteinchip 3.1軟件比較伴與不伴遠處轉(zhuǎn)移兩組PTC患者的血清蛋白質(zhì)譜的差異。采用生物信息學(xué)分析方法建立決策樹模型并進行盲法驗證。結(jié)果在質(zhì)荷比1.520.0 ku范圍內(nèi)，兩組患者血清中共檢測到69個蛋白質(zhì)峰，其中10個蛋白質(zhì)峰在兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。用建模組數(shù)據(jù)構(gòu)建的決策樹模型對20個盲法篩選樣本進行歸類預(yù)測，其靈敏度為80%，特異度為80%。結(jié)論伴與不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC患者的血清蛋白質(zhì)譜存在顯著差異，以此建

3、立的決策樹模型對PTC伴與不伴遠處轉(zhuǎn)移能夠做出較為準確的預(yù)測判斷。     【關(guān)鍵詞】  甲狀腺腫瘤;癌，乳頭狀;蛋白質(zhì)組學(xué);腫瘤轉(zhuǎn)移;表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜技術(shù)    【Abstract】ObjectiveTo compare differentially expressed proteins between papillary thyroid carcinoma (PTC) patients with distant metastasis and PTC without distant m

4、etastasis，and establish the predictive models that may be of help to serologic diagnosis of papillary thyroid carcinoma (PTC) with distant metastasis.MethodsSerum samples were collected from 36 PTC patients with distant metastasis and 29 PTC patients without distant metastasis，and randomized into a

5、modelling set (26 PTC patients with distant metastasis and 19 PTC patients without distant metastasis) and a blinding test set (10 PTC patients with distant metastasis and 10 PTC patients without distant metastasis).Serum samples were applied to immobilized metal affinity capture (IMAC3) proteinchip

6、 surfaces and tested by surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry (SELDI-TOF-MS).The data were analyzed by Ciphergen Proteinchip 3.1 software to screen differentially expressed proteins between PTC with distant metastasis and PTC without distant metastasis.Decisio

7、n classification tree models were established by bioinformatics.Doubled-blind test was used to determine sensitivity and specificity of the classification tree models.ResultsA total of 69 effective protein peaks were detected at the molecular range of 1.5 ku to 20 ku，among which 10 were significantl

8、y different between PTC with distant metastasis and PTC without distant metastasis(P<0.05).All the peptide data in the training set were used to obtain decision tree models.Thetree with highest cross validation rate was chosen to construct the classification models which can different PTC patient

9、s with distant metastasis from PTC patients without distant metastasis.With this decision tree,16 cases were correctly forecasted from 20 blind testing samples，with a sensitivity of 80% and a specificity of 80%.ConclusionsThe serum protein profiles between PTC with distant metastasis and PTC without

10、 distant metastasis were differential and the predictive models can discriminate PTC with distant metastasis from PTC without distant metastasis effectively.【Key words】Thyroid neoplasms;Carcinoma，papillary;Proteomics;Neoplasm metastasis;Surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mas

11、s spectrometry乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)約占分化型甲狀腺癌的90%。是否存在遠處轉(zhuǎn)移(肺、骨轉(zhuǎn)移等)是影響其預(yù)后的主要因素1，雖然PTC一般預(yù)后良好，但一旦發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移后，預(yù)后則較差2。若能提前預(yù)測PTC是否易于發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，并據(jù)此進行治療決策，無疑對提高患者的臨床緩解率和長期生存率具有幫助。但是目前尚無有效預(yù)測PTC是否易于發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的方法。因此，探索一種有效預(yù)測PTC是否易于發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的方法十分必要。為此，本研究對伴與不伴遠處轉(zhuǎn)移的PTC患者進行血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，篩選二者血清的差異蛋白質(zhì)，并據(jù)此建立決策樹模型，以

12、預(yù)測PTC的遠處轉(zhuǎn)移性，為評價PTC的臨床惡性程度提供參考和幫助。材料與方法一、研究對象65例PTC患者血清來源于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院20082009年住院病例，其中不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC 29例，伴遠處轉(zhuǎn)移PTC 36例。分別抽取清晨空腹前臂靜脈全血 5 ml。從65例樣本中隨機取出45例樣本(26例為伴遠處轉(zhuǎn)移PTC,19例為不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC)作為建模型組，20例樣本(10例為伴遠處轉(zhuǎn)移PTC,10例為不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC)作為盲法篩選組。二、 試劑與儀器乙酸鈉、乙腈、三氟乙酸、白芥子酸(SPA)、3-環(huán)己胺-1-丙磺酸(CHARPS)均購自Sigma公司，固定金屬親和表面(immob

13、ilized metal affinity capture，IMAC3)蛋白芯片和蛋白質(zhì)芯片閱讀機(PBSc型)、Ciphergen Proteinchip 3.1軟件購自美國Ciphergen公司。三、方法1. 血清標本制備：PTC患者外周靜脈血采集后室溫靜置2 h后，3000 r/min離心15 min(離心半徑8.6 cm)，取血清，20 l/管分裝后置于-80 冰箱保存?zhèn)溆?。使用時取出分裝的血清樣品，冰上融化，4 12 000 r/min離心10 min(離心半徑19.7 cm)，除去血清中的不溶物。2. IMAC3-Cu檢測：(1)芯片活化：取100 mmol/L 的 CuSO4溶液

14、，按每孔 10 l 加入芯片加樣孔中，濕盒中搖2次，每次10 min。吸去CuSO4后，用去離子水洗3次。再每孔加入50 mmol/L(pH 4.0)的NaAc 10 l，濕盒中搖2 min。吸去NaAc后，去離子水洗3次。(2)芯片平衡：將芯片裝入生物芯片處理器中，每孔加入200 l NaCl濃度為500 mmol/L 的 PBS(pH 7.2)，室溫搖2次，每次5 min。(3)血清樣品稀釋：取6 l 血清樣品，加入234 l NaCl 濃度為500 mmol/L的PBS(pH 7.2)混勻稀釋。(4)芯片上樣：取稀釋后的血清樣品，按每孔200 l 加入平衡好的芯片加樣孔中，置芯片于搖床孵

15、育90 min。(5)樣品洗脫：取NaCl濃度為500 mmol/L 的PBS(pH 7.2)，按每孔200 l加入芯片加樣孔中，洗脫2次，每次5 min。每孔加入300 l 的去離子水沖洗芯片。(6)蛋白質(zhì)獲能：取能量吸收劑SPA(飽和芥子酸溶于50%乙腈和0.15%三氟乙酸)，按每孔0.5 l加入芯片加樣孔中，待自然揮發(fā)后再重復(fù)加SPA 1次。(7)芯片檢測：將芯片置入蛋白芯片閱讀機中，將加有All-in-one 標準蛋白質(zhì)的NP20芯片儀器校正至0.1%范圍內(nèi)。芯片閱讀儀參數(shù)設(shè)置如下：激光強度165，檢測靈敏度7，優(yōu)化范圍100010 000，最高分子量30 000，芯片上的每個點采集1

16、70次。用Ciphergen Proteinchip 3.1 軟件收集數(shù)據(jù)，畫坐標圖，其中縱坐標為蛋白質(zhì)相對含量，橫坐標為蛋白質(zhì)質(zhì)荷比(M/Z)。3. 統(tǒng)計學(xué)分析： 用Ciphergen Proteinchip 3.1軟件計算相同M/Z的蛋白質(zhì)在伴遠處轉(zhuǎn)移PTC組與不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC組間峰值差異的P值。根據(jù)wilcoxon sum rank test 統(tǒng)計分析的原理計算總圖譜內(nèi)伴遠處轉(zhuǎn)移PTC組與不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC組相同M/Z蛋白質(zhì)表達差異的P值。以Excel表輸出差異表達蛋白的分子量和相對強度。結(jié)果1. 與PTC遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異表達蛋白：PTC患者伴與不伴遠處轉(zhuǎn)移的血清蛋白指紋圖譜經(jīng)標準化

17、后，用Ciphergen Proteinchip 3.1軟件對兩組患者血清中蛋白質(zhì)峰的數(shù)量和相對強度進行分析比較。在分子量為 1.520 ku 的范圍內(nèi)共檢測到69個蛋白質(zhì)峰，其中10個蛋白質(zhì)峰的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中1個蛋白質(zhì)峰(M/Z=11403.40)在伴有遠處轉(zhuǎn)移PTC組呈高表達，9個蛋白質(zhì)峰在不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC組呈高表達(表1)。在不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC組呈明顯高表達的 1蛋白質(zhì)峰(M/Z=9088.04)的質(zhì)譜圖見圖1。表1伴與不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC患者血清差異表達蛋白質(zhì)峰的比較蛋白質(zhì)差異峰,M/Z,相對峰強度2. PTC遠處轉(zhuǎn)移預(yù)測模型的建立：建模組經(jīng)過500次的交

18、叉驗證，從中選出交叉證實準確率最高的1個決策樹模型作為“PTC伴與不伴遠處轉(zhuǎn)移”分組篩選的最優(yōu)決策樹模型(圖2)。3. 盲法預(yù)測：用上述的最優(yōu)決策樹模型對盲法篩選組的20個預(yù)測樣本進行預(yù)測。預(yù)測方法為：以預(yù)測樣本中的樣本DM2為例，預(yù)測結(jié)果認為該樣本屬于伴遠處轉(zhuǎn)移PTC，實際上該樣本就來自伴遠處轉(zhuǎn)移PTC組，為預(yù)測正確。若預(yù)測結(jié)果認為該樣本屬于不伴遠處轉(zhuǎn)移PTC，而實際上該樣本來自伴遠處轉(zhuǎn)移組，為預(yù)測錯誤。結(jié)果16例被準確預(yù)測和分組。該盲法驗證的靈敏度為80%(8/10)，特異度為80%(8/10)，預(yù)測正確率為80%(16/20)。討論蛋白質(zhì)組學(xué)認為惡性腫瘤是一種蛋白質(zhì)缺陷病，其發(fā)生發(fā)展過程

19、中會出現(xiàn)多種蛋白質(zhì)分子，如各種生長因子和酶都可能成為潛在的腫瘤標記物。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以篩選腫瘤不同階段中表達的各種蛋白質(zhì)，尤其是與腫瘤相關(guān)的低豐度蛋白質(zhì)，從而發(fā)現(xiàn)眾多的標記物，聯(lián)合多種標記物篩檢將有望提高腫瘤診斷的特異性與敏感性，檢測蛋白質(zhì)譜的變化可以更準確地判斷腫瘤的發(fā)生與發(fā)展進程3。任何疾病在出現(xiàn)病理變化之前，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在成分和數(shù)量上都會有相應(yīng)的改變，所以，通過對蛋白質(zhì)的動態(tài)檢測，可以檢測出疾病病理變化早期蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的變化4。表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-

20、mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對于檢測成分復(fù)雜的血清蛋白質(zhì)尤為合適5。SELDI-TOF-MS技術(shù)集質(zhì)譜技術(shù)和芯片技術(shù)于一身，整合樣品的分離、純化、生化反應(yīng)和檢測分析為一體6，能同時檢測標本中大量的蛋白質(zhì)分子，已逐步用于腫瘤標記物的篩查和臨床檢測7。SELDI-TOF-MS技術(shù)作為一種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，具有以下優(yōu)勢：(1)待測樣本來源廣，如血清、尿液、體液、腦脊液、細胞培養(yǎng)液、組織提取物等，不需要特殊處理，便可直接點樣進行檢測分析;(2)樣品用量極少，每次分析只需要0.55.0 l或2000個細胞的超微量樣本;(3)可檢測的分子量范圍很廣，且特別適合

21、于分析分子量20 kD以下的蛋白質(zhì)，而這一范圍是二維凝膠電泳分析的弱項;(4)可進行小樣本實驗與高通量檢測的自由選擇，每次可測8、24、96或192個樣品，可滿足臨床檢測、普查或大樣本篩查的需要;(5)檢測速度快，通常完成一條8孔芯片的閱讀時間僅為35 min，可快速獲取實驗結(jié)果;(6)攜帶的分析軟件可以迅速發(fā)現(xiàn)各種疾病特異性變化的差異蛋白質(zhì)，用于發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的一種或一組生物標記物，提供疾病診斷的最佳組合指標;而二維電泳膠上的蛋白質(zhì)斑點往往包含一種以上的蛋白質(zhì)分子8-9。應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)研究甲狀腺癌蛋白質(zhì)組學(xué)的文獻報道十分有限。盧秀波等10采用弱陽離子交換(weak cation exchange，WCX2)芯片檢測甲狀腺癌、甲狀腺良性結(jié)節(jié)和正常人血