核酸提取常見試劑的作用原理

1、核酸提取常見試劑的作用原理異硫氟酸瓜 強用力的蛋白質(zhì)變性劑,能迅速溶解蛋白質(zhì),導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破碎,核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu) 的破壞消失而迅速與核酸別離.月瓜鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑,在通常使用的蛋白 質(zhì)變性劑中作用最強的是異硫鼠酸月瓜,它們可以使多數(shù)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成一隨機的卷曲狀態(tài). 含有強力的陰離子和陽離子基團,它們可以形成較強的氫鍵.在復(fù)原劑存在的情況下,異 硫鼠酸月瓜可以斷裂氫鍵,而去垢劑,如 SDS存在的情況下,可以破壞疏水作用.鹽酸月瓜、尿素鹽酸月瓜是一個核酸酶的強抑制劑,它并不是一種足夠強的變性劑,可以允許完整的RNA從富含RNase的組織中提取出來.4-8M可斷裂氫鍵,有兩種可能機制

2、：1變性蛋白和鹽酸月瓜、尿素優(yōu)先結(jié)合,形成變性蛋 白-變性劑復(fù)合物,當復(fù)合物被除去,從而引起 N-D反響平衡向右移動,隨著變性劑濃度 增加,天然狀態(tài)的蛋白不斷轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合物,最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)完全變性；2鹽酸瓜、尿素對氨基酸的增溶作用,能形成氫鍵,當濃度高時,能破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu),結(jié)果鹽酸月瓜、尿素 就稱為非極性殘基的較好溶劑,使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水殘基伸展和溶解性增強,鹽酸月瓜、尿 素引起的變性往往是不可逆的.高濃度尿素使蛋白質(zhì)變性并抑制 Rnase活性十二烷基肌氨酸鈉使蛋白質(zhì)解體 變性1預(yù)防蛋白質(zhì)或酶等如輔酶 A分子中SH基團氧化成二硫鍵,2在某些酶反響過程中 維持體系的復(fù)原環(huán)境.DTT, DDTE、

3、琉基乙醇應(yīng)用最廣,谷胱甘肽也常應(yīng)用,由于他是 生物體內(nèi)的復(fù)原劑,同時氧化后能被谷胱甘肽復(fù)原酶原位釋放.DNA提取中,常使用琉基乙醇,維持緩沖液的復(fù)原環(huán)境,預(yù)防多酚類氧化,由于具有一定的毒性,濃度不應(yīng)高于 2%0&琉基乙醇的主要作用是破壞 RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵肽和蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘 基中的鍵.1復(fù)原蛋白質(zhì)二硫鍵,使 Rna酶變性2抑制酚類氧化,假設(shè)氧化,核酸會變成灰黑色,苯酚的氧化產(chǎn)物苯酶等氧化物引起磷酸二 酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián)3保護蛋白質(zhì)的琉基 蛋白質(zhì)提取中需要 琉基乙醇復(fù)原二硫鍵,使RNA酶失活化學(xué)變性劑SDS、尿素、鹽酸瓜能破壞疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華

4、力使蛋白質(zhì)變性但 不影響肽鍵和二硫鍵,不能使蛋白質(zhì)徹底變性加上復(fù)原劑琉基乙醇或 DTT,能復(fù)原二硫鍵,使 RNA徹底變性DTT二硫蘇糖醇刺激性氣味要小很多,毒性也比琉基乙醇低很多.而且 DTT比琉基乙醇的濃度低 7倍時, 兩者效果相近,但DTT價格略高一些.由于容易被空氣氧化,因此 DTT的穩(wěn)定性較差； 但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命.由于質(zhì)子化的硫的親核性較低, 隨著pH值的降低,DTT的有效復(fù)原性也隨之降低；DTT或含有DTT的溶液不能進行高 壓處理.抑制Rnase?舌性TCEP三2-甲酰乙基瞬鹽酸鹽Trizol苯酚、異硫鼠酸瓜、8羥基唾咻、&琉基乙酉1等.TRI

5、zol的主要成分是苯酚.苯酚的主 要作用是裂解細胞,使細胞中的蛋白,核酸物質(zhì)解聚得到釋放.苯酚雖可有效地變性蛋白 質(zhì),但不能完全抑制RNA酶活性,因此TRIzol中還參加了 8羥基唾咻、異硫氟酸瓜、 &琉基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源 RNase RNA酶.0.1%的8羥基唾咻可以抑制RNase,與氯仿聯(lián)合使用可增強抑制作用.異硫鼠酸瓜屬于解偶劑,是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑,可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu) 消失,導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)降解,核蛋白迅速與核酸別離.&琉基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵.組織破碎,裂解細胞十二烷基硫酸鈉陰離子去垢劑,高溫55-65C裂解細胞,使染色體離

6、析,蛋白變性,形成SDS/蛋白質(zhì)/多糖復(fù)合物,釋放核酸,提升鹽KAc或NaAc濃度并降低溫度冰浴,使 SDS/蛋 白質(zhì)/復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}酸形式,使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀更加完全、離心 后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀水相中的 DNA操作簡單,溫和,可提取到高分子量的 DNA ,但產(chǎn)物多糖類雜質(zhì)較多陽離子強外表活性劑,通常與蛋白酶 K和抗氧化劑、螯合劑一起使用可破壞細胞膜、核膜,并使組織蛋白與 DNA別離溶解膜類蛋白SDS能裂解細胞.使細胞中的蛋白質(zhì)和核酸之間常借著靜電引力或配位鍵結(jié)合,陰離子 去污劑能夠破壞這種價鍵,使染色體離析,蛋白變性,釋放核酸.(1) SDS

7、是一種陰離子外表活性劑,能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵翻開,并結(jié)合到蛋白質(zhì) 的疏水部位；(2) SDS可引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變(3) SDS是一種良好的解離劑,可使蛋白質(zhì)溶解,變性(4)形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,并使復(fù)合物帶負電質(zhì)粒方面：在1%的SDS溶液中慢慢參加5 N的NaCl,你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會 產(chǎn)生沉淀的.因此高濃度的鹽導(dǎo)致了 SDS的沉淀.但如果你參加的不是 NaCl而是KCl, 你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多.這其實是十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate)遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀(potassium dodecylsulfate, PDS ,而PDS是水不

8、溶的,因此發(fā)生了沉淀.如此看來,溶液III參加后的沉淀實際上是鉀離子置換了 SDS中的納離 子形成了不溶性的PDS,而高濃度的鹽,使得沉淀更完全.大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合,平均兩個氨基酸上結(jié)合一個 SDS分子,鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然 就將絕大局部蛋白質(zhì)沉淀了,讓人快樂的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了.基因組DNA 一旦發(fā)生斷裂,只要是50- 100 kb大小的片斷,就沒有方法再被 PDS共沉 淀了CTAB:十六烷基三甲基澳乙胺,低溫時易沉淀陽離子去污劑一種在高鹽下能和核酸結(jié)合形成可溶、穩(wěn)定的復(fù)合物,低鹽濃度下可沉淀的外表活性劑 是一種陽離子去污劑,低離子強度(0.

9、1-0.5M NaCl),沉淀核酸與酸性多聚糖,而蛋白質(zhì) 和中性多聚糖仍留在溶液中.在高離子強度的溶液中(>0.7mol/L NaCl), CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物,只是不能沉淀核酸.通過有機溶劑抽提,去除蛋白,多糖,酚類等 雜質(zhì)后參加乙醇沉淀即可使核酸別離出來.CTAB可從大量產(chǎn)生黏多糖的植物及某些革蘭氏陰性菌制備純化的 DNA ,這種去污劑加 入調(diào)節(jié)至高離子強度的細菌和細胞裂解液中0.7M NaCl,經(jīng)過連續(xù)的酚/氯仿抽提,去除CTAB/黏多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合體,異丙醇/無水乙醇沉淀上清即可將 DNA別離出來CTAB還有提升DNA互補鏈復(fù)性速率及穩(wěn)定已形成的 DNA雙螺旋的作用

10、CTAB法的主要特點是用用較廣CTAB溶液在低于15度會形成沉淀析出,因此在將其參加冰冷的植物材料時,必須預(yù)熱, 且離心溫度不低于15度酶抑制劑,螯合二價金屬,抑制金屬依賴性的酶螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制細胞中DNase的活性,該酶可降解 DNAEDTA是去垢劑,結(jié)合離子用,而它結(jié)合的局部離子是能夠誘發(fā)或者促進RNA酶活性的,比方Ca2+0 EDTA是一種二價離子熬合劑,能熬合Mg2+和Ca2+等二價陽離子,而多種 RNA酶的活性是需要依賴二價陽離子的,所以EDTA能通過熬合二價陽離子來抑制 RNA 酶的活性 堿性條件下才能夠溶解,要和 NaOH粉末混合后,再加水,然后用 NaOH水溶

11、液調(diào)節(jié)pH.0.01M, DNase酶根本失活.酶抑制劑,使一些降解酶的活性的外表變性精胺或其他多胺酶抑制劑,降低核酸酶的影響酶抑制劑,降低重金屬氧化酶的影響減少酚類、酶類、單寧類物質(zhì)的影響,抗氧化作用,絡(luò)合多酚和菇類物質(zhì),預(yù)防多酚類褐 變而氧化,去除多糖和色素,色素是 PCR強抑制劑,必須去除樣品液氮研磨及提取緩沖液中參加 PVP或PVPP等能絡(luò)合多酚和菇類物質(zhì),離心或氯仿 抽提出去,有效預(yù)防多酚氧化成酶類,預(yù)防溶液變褐色而具有抗氧化水平提取液中參加適量的PVP或PVPP能提升DNA的純度,用量根據(jù)雜質(zhì)而定1-6%, PVP同時能去除多糖,因此將 PVP和琉基乙醇配合使用并調(diào)整用量,能有效預(yù)

12、防多酚污 染PVP聚乙烯叱咯烷酮是酚的絡(luò)合物,能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì),有效去除多酚, 減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合,有效去除多糖.Triton-x100Triton X100之類的去垢劑有苯環(huán)結(jié)構(gòu),所以在 280nm有很強的吸收.蛋白酶K:切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶,切割脂族和芳香族氨基酸的竣基端肽鍵,將蛋 白質(zhì)降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地別離出來.蛋白酶K在較廣的pH范圍內(nèi)均有活性(pH 4-12.5)溫度范圍37-60度鹽濃度3MGuHCl或4M尿素中均有活性 在一些去污劑：Tween20(5%)、Triton X-100 (1%)和 SDS(1%滌件下也有

13、活性.蛋白酶K消化裂解法適用于所有標本的消化處理,尤以 DNA樣品為佳.如組織細胞(包括 石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血沙全血)局局部泌物、尿,糞便等.蛋 白酶K的一般工作濃度是50100仙g/ml蛋白酶(蛋白酶K或鏈酶蛋白酶)可以降解蛋白質(zhì),滅活核酸酶(DNase和RNase) ,DNase和RNase也用于去除不需要的核酸,有人使用蛋白酶替代DEPC處理水的,但有些人說效果不好.蛋白酶K,威力巨大的廣譜蛋白酶,95C加熱10分鐘,那么完全失活.數(shù)年前首次使用它 替代DEPC處理RNA抽提用的離心管和槍頭,效果不錯；后來又用于處理RNase-Free的水,效果也是一級棒.從此

14、就再也不用 DEPC 了.配制RNA裂解試劑時,直接用滅菌的 雙蒸水配制,最后,參加蛋白酶 K至終濃度1ug/ml.輕輕混勻,室溫放置15分鐘后即可. 槍頭及離心管去除RNase：先將槍頭及離心管清洗干凈后,移入預(yù)先混好的含1ug/ml蛋白酶K的雙蒸水,徹底浸入.室溫放置 30分鐘后,連水一起高壓滅菌.棄水后,烘干即 可.RNase-Free水的獲得：直接在滅菌的雙蒸儲水中參加蛋白酶K至終濃度1ug/ml.輕輕混勻,室溫放置15分鐘后,滅菌處理即可.該蛋白質(zhì)的殘留對后續(xù)實驗沒有可見的影 響.無蛋白質(zhì)殘留的RNase-Free水的獲得：這比較麻煩.直接在滅菌的雙蒸儲水中參加 蛋白酶K至終濃度1u

15、g/ml0輕輕混勻后,倒入專用的蒸儲器中.放置 15分鐘后,加熱蒸 儲,流出的就是無蛋白質(zhì)殘留的 RNase-Free水.要提醒的是,該專用蒸儲器頭幾次流出 來的水,只能當普通蒸儲水用,由于通道中難保證RNase-Free的環(huán)境；另外,一定要主要密閉性,否那么,流出的水又被污染了.因此混合使用最正確,經(jīng)酚第一次抽提的水相有殘留的酚,由于酚和氯仿互溶,可用氯仿第二次帶走酚,也可在第二次抽提中混合使用,比例為 1:1苯酚/氯仿 苯酚、氯仿抽提去除蛋白質(zhì)非極性分子 水為極性分子,當?shù)鞍姿芤号c他們混合時,蛋白質(zhì)分子見的水分子被擠去, 使蛋白失去水合狀態(tài)而變性,經(jīng)離心,變性蛋白密度比對大,而與水相別離

16、,苯酚/氯仿比重大,保存在最下層苯酚氯仿 使蛋白質(zhì)變性 量要足夠,由于苯酚去除蛋白是有一定的飽和度的,超過飽和度, 裂解體系中蛋白質(zhì)不能被一次性去除,必須屢次抽提.離心后分三層,下層有機層中有一 些脂溶性的雜質(zhì),中間層白色絮狀沉淀是蛋白,上清液中即含有核酸；變性后的蛋白質(zhì)從水相中析出,位于苯酚中或苯酚與水相之間.抽提DNA,為混合均勻,容易產(chǎn)生氣泡,氣泡會阻止相互間的充分作用,參加異戊醇降 低分子外表張力,一般采用氯仿：異戊醇 =24: 1或酚：氯仿：異戊醇=25: 24: 1 不必 先配置,臨用前參加即可減少操作過程中產(chǎn)生的氣泡.減少蛋白質(zhì)變性操作過程中產(chǎn)生的氣泡.異戊醇可以降低外表張力,從

17、而減少氣泡產(chǎn)生. 另外,異戊醇有助于分相,使離心后的上層含 DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有 機溶劑相維持穩(wěn)定.提供一個高鹽環(huán)境,使DNA充分溶解于液相沉淀DNA時總會參加高濃度的鹽,加鹽的目的是破壞能使蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定的兩個因素 ,使 蛋白和DNA別離并沉淀下來.而此時鹽的陽離子會與 DNA結(jié)合形成DNA-陽離子鹽溶于 溶液中,再用無水乙醇可以將DNA-陽離子鹽沉淀下來提取DNA時先加0.14mol/L氯化鈉,由于在這種濃度的氯化鈉溶液中,DNA的溶解度最低,而蛋白質(zhì)的溶解度增加,這樣通過過濾能將DNA別離開,以除去蛋白質(zhì).再參加 95%的酒精能使DNA沉淀,由于在這個濃度下 DNA溶解

18、度最低.如果直接加酒精不先加氯 化鈉,DNA和蛋白質(zhì)都能被酒精所沉淀,就無法將 DNA和蛋白質(zhì)別離開.所以必須先加 氯化鈉后加酒精,順序不能顛倒.DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在,當參加乙醇時,乙醇會奪去DNA周圍的水分子,使DNA失水而易于聚合.這樣可以是 DNA沉淀出來在pH為8左右的溶液中,DNA分 子是帶負電荷的,加一定濃度的 NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的負電荷,減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀,當參加的鹽溶液濃度太低時,只有局部DNA形成DNA鈉鹽而聚合,這樣就造成 DNA沉淀不完全,當加 入的鹽溶液濃度太高時,其效果也不好

19、.在沉淀的 DNA中,由于過多的鹽雜質(zhì)存在,影 響DNA的酶切等反響,必須要進行洗滌或重沉淀.它可以限制反響體系的離子強度,同時還有一定的緩沖作用,保證體系PH的相對穩(wěn)定狀態(tài),總之檸檬酸鈉在這里的作用類似于食物中的防腐劑.焦碳酸二乙酯,它通過和 RNA酶的活性基團組氨酸的咪唾環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性,從而抑 制酶的活性.與肝素何用效果增強.在 Tris中不穩(wěn)定,很快會分解為二氧化碳和乙醇.強烈但不徹底的RNA酶抑制劑0.1%濃度Tris-HCl緩沖體系,使pH變化不會太大參加異丙醇之后立即出現(xiàn)絮狀沉淀,我一直以為這是正確的,看了帖子才知道是蛋白質(zhì)污 染,異丙醇的沉淀效果要比無水乙醇的沉淀效果要好,但

20、是異丙醇沉淀有一個弊端就是 會沉淀下來好多的鹽和蛋白質(zhì)這樣會影響下一步的操作,一般我加異丙醇是等體積的效果 還可以.70%乙醇70%乙醇洗滌DNA沉淀由于在70%乙醇里DNA是不溶的,而鹽離子卻可溶,用無水乙醇 那么達不到這個目的！乙醇對于蛋白質(zhì)、核酸的沉淀效應(yīng)隨分子量加大而增大,小分子的核 酸和蛋白質(zhì)碎片是可以溶于75%乙醇的.漂洗DNA,是為了去除剩余的鹽類,去除過量 SDS和酚等雜物,由于SDS在70%的乙醇中保持溶解狀態(tài),不與 DNA共沉淀,從而通 過棄上清液去除這種去污劑,預(yù)防對以后PCR反響的影響.焦碳酸二乙酯：常用RNA酶抑制劑,與RNA酶的活性基團組氨酸的咪唾環(huán)結(jié)合使蛋 白質(zhì)變

21、性,強烈但不徹底的RNA酶抑制劑用高濃度甲酰胺替代苯酚從細胞裂解物的蛋白酶 K消化物中別離抽提DNA,甲酰胺是一 種離子化溶劑,能別離蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物并使蛋白變性和釋放,因其不影響蛋白酶 K的 活性,特別適于別離高分子質(zhì)量的 DNA,其別離物籍火棉膠袋的透析,去除變性蛋白進 而純化DNA.聚乙二醇PEG有機聚合物,無毒,親水性強,相對分子量 6-20k,沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關(guān),同時受離子強度、溶液 pH值和溫度等因素的影響,采用該方法可將病毒濃縮10倍以上.為一種非離子多聚物,多離子多聚物是六十年代開展起來的一類重要沉淀劑.基于多聚物的沉淀作用主要依賴于多聚物的濃度和被沉淀

22、物的分子量大小,Laurent等1967提出PEG的沉淀機理主要是通過空間位置排斥,使液體中的微粒包括生物大分子、病毒和細菌等被迫集聚在一起而引起沉淀的發(fā)生.PEG最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白IgG和沉淀一些細菌病毒,今年來逐漸應(yīng)用于核酸和酶的別離純化,特別是用PEG別離質(zhì)粒DNA,已相當普遍.用PEG8000代替乙醇沉淀DNA,可以在500ul DNA液中參加200ul 20% PEG8000冷 1. 2 mol/LNaCl),冰浴 20min(Li et al . , 1994).該操作的優(yōu)點在于：操作 條件溫和,不易引起生物大分子的變性.同時具有極高的沉淀效能,少量的 PEG可以沉 淀相當多

23、的生物大分子.乙基黃原酸鉀乙基黃原酸鉀能夠與多糖結(jié)合,形成可溶性復(fù)合物,使細胞壁破裂,釋放出核酸.此復(fù)合 物在錢離子存在的情況下可轉(zhuǎn)變?yōu)樗蝗苄?并可通過簡單的離心除去,不需要苯酚或氯仿 抽提.另外,乙基黃原酸鉀能夠結(jié)合金屬離子,抑制 DNase的活性.Tillett等(2000)利用 該方法從藍細菌、微生物、環(huán)境樣品中提取到高質(zhì)量的核酸,DNA可以用于酶切、克隆、PCR, RNA可以用于RT-PCR, Southern雜交等反響,并且樣品中不含核酸酶,溫育 16 h 沒有發(fā)生降解.異硫氟酸瓜強用力的蛋白質(zhì)變性劑,能迅速溶解蛋白質(zhì),導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破碎,核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu) 的破壞消失而迅速與核酸

24、別離.月瓜鹽是破壞蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的離液劑,在通常使用的蛋白 質(zhì)變性劑中作用最強的是異硫鼠酸月瓜,它們可以使多數(shù)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成一隨機的卷曲狀態(tài). 含有強力的陰離子和陽離子基團,它們可以形成較強的氫鍵.在復(fù)原劑存在的情況下,異 硫鼠酸月瓜可以斷裂氫鍵,而去垢劑,如 SDS存在的情況下,可以破壞疏水作用.鹽酸月瓜、尿素鹽酸月瓜是一個核酸酶的強抑制劑,它并不是一種足夠強的變性劑,可以允許完整的RNA從富含RNase的組織中提取出來.4-8M可斷裂氫鍵,有兩種可能機制：1變性蛋白和鹽酸月瓜、尿素優(yōu)先結(jié)合,形成變性蛋 白-變性劑復(fù)合物,當復(fù)合物被除去,從而引起N-D反響平衡向右移動,隨著變性劑濃度增加,天然

25、狀態(tài)的蛋白不斷轉(zhuǎn)變?yōu)閺?fù)合物,最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)完全變性；2鹽酸瓜、尿素對氨基酸的增溶作用,能形成氫鍵,當濃度高時,能破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu),結(jié)果鹽酸月瓜、尿素 就稱為非極性殘基的較好溶劑,使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水殘基伸展和溶解性增強,鹽酸月瓜、尿 素引起的變性往往是不可逆的.高濃度尿素使蛋白質(zhì)變性并抑制 Rnase活性十二烷基肌氨酸鈉使蛋白質(zhì)解體 變性1預(yù)防蛋白質(zhì)或酶等如輔酶 A分子中SH基團氧化成二硫鍵,2在某些酶反響過程中 維持體系的復(fù)原環(huán)境.DTT, DDTE、琉基乙醇應(yīng)用最廣,谷胱甘肽也常應(yīng)用,由于他是 生物體內(nèi)的復(fù)原劑,同時氧化后能被谷胱甘肽復(fù)原酶原位釋放.DNA提取中,常使用琉基乙醇,維持緩沖液的

26、復(fù)原環(huán)境,預(yù)防多酚類氧化,由于具有一定的毒性,濃度不應(yīng)高于 2%0&琉基乙醇的主要作用是破壞 RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵肽和蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘 基中的鍵.1復(fù)原蛋白質(zhì)二硫鍵,使 Rna酶變性2抑制酚類氧化,假設(shè)氧化,核酸會變成灰黑色,苯酚的氧化產(chǎn)物苯酶等氧化物引起磷酸二 酯鍵的斷裂及導(dǎo)致RNA和DNA的交聯(lián)3保護蛋白質(zhì)的琉基 蛋白質(zhì)提取中需要琉基乙醇復(fù)原二硫鍵,使RNA酶失活化學(xué)變性劑SDS、尿素、鹽酸瓜能破壞疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華力使蛋白質(zhì)變性但 不影響肽鍵和二硫鍵,不能使蛋白質(zhì)徹底變性加上復(fù)原劑琉基乙醇或 DTT,能復(fù)原二硫鍵,使 RNA徹底變性DTT二硫蘇糖醇刺激性氣味

27、要小很多,毒性也比琉基乙醇低很多.而且 DTT比琉基乙醇的濃度低 7倍時, 兩者效果相近,但DTT價格略高一些.由于容易被空氣氧化,因此 DTT的穩(wěn)定性較差； 但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命.由于質(zhì)子化的硫的親核性較低, 隨著pH值的降低,DTT的有效復(fù)原性也隨之降低；DTT或含有DTT的溶液不能進行高 壓處理.抑制Rnase?舌性TCEP三2-甲酰乙基瞬鹽酸鹽Trizol苯酚、異硫鼠酸瓜、8羥基唾咻、&琉基乙酉1等.TRIzol的主要成分是苯酚.苯酚的主 要作用是裂解細胞,使細胞中的蛋白,核酸物質(zhì)解聚得到釋放.苯酚雖可有效地變性蛋白 質(zhì),但不能完全抑制RNA酶活性,

28、因此TRIzol中還參加了 8羥基唾咻、異硫氟酸瓜、 &琉基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源 RNase RNA酶.0.1%的8羥基唾咻可以抑制RNase,與氯仿聯(lián)合使用可增強抑制作用.異硫鼠酸瓜屬于解偶劑,是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑,可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu) 消失,導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)降解,核蛋白迅速與核酸別離.&琉基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵.組織破碎,裂解細胞十二烷基硫酸鈉陰離子去垢劑,高溫(55-65 C)裂解細胞,使染色體離析,蛋白變性,形成 SDS/蛋白質(zhì)/ 多糖復(fù)合物,釋放核酸,提升鹽(KAc或NaAc)濃度并降低溫度(冰浴),使 SDS/蛋 白質(zhì)/復(fù)合物轉(zhuǎn)

29、變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}酸形式,使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀更加完全、離心 后除去沉淀,上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,乙醇沉淀水相中的 DNA操作簡單,溫和,可提取到高分子量的 DNA ,但產(chǎn)物多糖類雜質(zhì)較多陽離子強外表活性劑,通常與蛋白酶 K和抗氧化劑、螯合劑一起使用可破壞細胞膜、核膜,并使組織蛋白與 DNA別離溶解膜類蛋白SDS能裂解細胞.使細胞中的蛋白質(zhì)和核酸之間常借著靜電引力或配位鍵結(jié)合,陰離子 去污劑能夠破壞這種價鍵,使染色體離析,蛋白變性,釋放核酸.(1) SDS是一種陰離子外表活性劑,能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵翻開,并結(jié)合到蛋白質(zhì) 的疏水部位；(2) SDS可引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變(3) SD

30、S是一種良好的解離劑,可使蛋白質(zhì)溶解,變性(4) 形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,并使復(fù)合物帶負電質(zhì)粒方面：在1%的SDS溶液中慢慢參加5 N的NaCl,你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會 產(chǎn)生沉淀的.因此高濃度的鹽導(dǎo)致了 SDS的沉淀.但如果你參加的不是 NaCl而是KCl, 你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多.這其實是十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate)遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀 (potassium dodecylsulfate, PDS ,而PDS是水不溶的, 因此發(fā)生了沉淀.如此看來,溶液III參加后的沉淀實際上是鉀離子置換了 SDS中的納離 子形成了不溶性的PDS,而高濃

31、度的鹽,使得沉淀更完全.大家知道SDS專門喜歡和蛋 白質(zhì)結(jié)合,平均兩個氨基酸上結(jié)合一個 SDS分子,鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然 就將絕大局部蛋白質(zhì)沉淀了,讓人快樂的是大腸桿菌的基因組 DNA也一起被共沉淀了.基因組DNA 一旦發(fā)生斷裂,只要是50- 100 kb大小的片斷,就沒有方法再被 PDS共沉 淀了CTAB:十六烷基三甲基澳乙胺,低溫時易沉淀陽離子去污劑一種在高鹽下能和核酸結(jié)合形成可溶、穩(wěn)定的復(fù)合物,低鹽濃度下可沉淀的外表活性劑 是一種陽離子去污劑,低離子強度(0.1-0.5M NaCl),沉淀核酸與酸性多聚糖,而蛋白質(zhì) 和中性多聚糖仍留在溶液中.在高離子強度的溶液中(>0.

32、7mol/L NaCl), CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物,只是不能沉淀核酸.通過有機溶劑抽提,去除蛋白,多糖,酚類等 雜質(zhì)后參加乙醇沉淀即可使核酸別離出來.CTAB可從大量產(chǎn)生黏多糖的植物及某些革蘭氏陰性菌制備純化的 DNA ,這種去污劑加 入調(diào)節(jié)至高離子強度的細菌和細胞裂解液中(>0.7M NaCl),經(jīng)過連續(xù)的酚/氯仿抽提,去除CTAB/黏多糖/蛋白質(zhì)復(fù)合體,異丙醇/無水乙醇沉淀上清即可將 DNA別離出來CTAB還有提升DNA互補鏈復(fù)性速率及穩(wěn)定已形成的 DNA雙螺旋的作用CTAB法的主要特點是用用較廣CTAB溶液在低于15度會形成沉淀析出,因此在將其參加冰冷的植物材料時,必須

33、預(yù)熱, 且離心溫度不低于15度酶抑制劑,螯合二價金屬,抑制金屬依賴性的酶螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制細胞中DNase的活性,該酶可降解 DNAEDTA是去垢劑,結(jié)合離子用,而它結(jié)合的局部離子是能夠誘發(fā)或者促進RNA酶活性的,比方Ca2+0 EDTA是一種二價離子熬合劑,能熬合Mg2+和Ca2+等二價陽離子,而多種 RNA酶的活性是需要依賴二價陽離子的,所以EDTA能通過熬合二價陽離子來抑制 RNA 酶的活性 堿性條件下才能夠溶解,要和 NaOH粉末混合后,再加水,然后用 NaOH水溶 液調(diào)節(jié)pH.0.01M, DNase酶根本失活.酶抑制劑,使一些降解酶的活性的外表變性精胺或其他多胺酶抑制劑,降低核酸酶的影響酶抑制劑,降低重金屬氧化酶的影響減少酚類、酶類、單寧類物質(zhì)的影響,抗氧化作用,絡(luò)合多酚和菇類物質(zhì),預(yù)防多酚類褐變而氧化,去除多糖和色素,色素是 PCR強抑制劑,必須去除樣品液氮研磨及提取緩沖液中參加 PVP或PVPP等能絡(luò)合多酚和菇類物質(zhì),離心或氯仿 抽提出去,有效預(yù)防多酚氧化成