水稻蛋白質(zhì)組學研究進展

1、水稻蛋白質(zhì)組學研究進展魏敏 1,2 李陽生 2 傅彬英 1(1中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所 , 北京 100081; 2武漢大學生命科學學院 , 武漢 430072摘 要 : 蛋白質(zhì)組是一個基因組所表達蛋白質(zhì)的總稱 , 研究內(nèi)容包括蛋白質(zhì)基本氨基酸序列的鑒定到相關 性狀 、 修飾 、 功能及不同類型蛋白分子相互作用等等 。 本文簡要介紹了蛋白質(zhì)組學的產(chǎn)生背景 , 以及主要研究技術 包括雙向電泳 (2D 2PA GE 質(zhì)譜 、 蛋白質(zhì)芯片 、 酵母雙雜交 , 并重點介紹了近期水稻蛋白質(zhì)組學應用研究進展 。關鍵詞 : 水稻 蛋白質(zhì)組學 雙向電泳 質(zhì)譜Advance in Rice Proteomi

2、csWei Min Li Yangsheng Fu Binying(1I nstit ute of Corp S cience , CA A S , Bei j ing 100081;2College of L i f e S cience , W uhan y , Abstract : Proteomics covers the systematic , from the identification of their primary amino 2acid sequence to association with other proteins or mol 2ecules of diffe

3、rent of proteomics , primary technology including 2D 2PA GE , 2system , and recently advance in rice proteomics application investi 2gation.K ey words : Rice Proteomics 2D 2PA GE MS1 植物蛋白質(zhì)組學背景蛋白質(zhì)組 (Proteome 是指基因組表達產(chǎn)生的 所有相應的蛋白質(zhì) , 即細胞或組織或機體全部蛋白質(zhì)的存在及活動方式 1,2。蛋白質(zhì)組的概念和基因 組的概念有許多差別 , 基因組基本上是固定不變的 , 然而蛋白質(zhì)組

4、具有時空性和可調(diào)節(jié)性 , 能反映出特 定基因的表達時間 、 表達量 , 以及蛋白翻譯后的加工 修飾和亞細胞分布等 , 它隨著組織 、 環(huán)境狀態(tài)的不同 而改變 , 是一個動態(tài)的概念 。蛋白質(zhì)組學是在基因組學的研究成就和高通量 的蛋白質(zhì)分析技術取得突破的背景下產(chǎn)生的新興學 科 , 基因組研究的發(fā)展是蛋白質(zhì)組學產(chǎn)生的重要前 提 。 水稻 (Oryza sativa 是亞洲最重要的糧食作物 , 因為它較小的基因組而作為單子葉植物遺傳和分子 生物學研究的模式植物 3。 2002年中國科學家和Syngenta 公司的科學家分別發(fā)表秈稻和粳稻基因組 “ 工作框架圖” 4,5, 隨后日本和中國的科學家分別發(fā)表

5、了粳稻第 1號和第 4號染色體的全序列以及秈稻粳稻基因的 “精細結(jié)構(gòu)圖” 6,7, 這些研究結(jié)果 為進一步開展功能基因組學研究打下了堅實的基 礎 。在后基因組時代 , 研究重心轉(zhuǎn)移到基因功能的 解析 , 即利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息和高通量的 實驗手段在轉(zhuǎn)錄組 (Transcriptome 和蛋白質(zhì)組水 平上系統(tǒng)地分析基因的功能 。2 蛋白質(zhì)組學研究技術蛋白質(zhì)組分析技術是蛋白質(zhì)組功能研究和應用 研究的基本手段 , 目前主要是利用雙向聚丙烯酰胺 凝膠電泳來分離蛋白質(zhì)組分 , 然后采用氨基酸組成 分析 、 微量蛋白質(zhì)序列分析 、 質(zhì)譜分析等技術對特異收稿日期 :2005209226基金項目 :國家

6、重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目 (973 “ 水稻抗旱基因發(fā)掘與遺傳網(wǎng)絡解析及重要抗旱基因克隆” (2003CB114308 資助 作者簡介 :魏敏 (19792 , 碩士研究生 , 主要從事水稻功能基因組學研究 生物技術通報 綜述與專論 B IOTEC HNOLOGY BULL ETI N 2005年第 6 期蛋白質(zhì)進行精細的鑒定 , 從而獲得有關蛋白質(zhì)性質(zhì) 、 表達變化及翻譯后加工等方面的信息 。2. 1 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)雙向電泳是將蛋白質(zhì)等電點和分子量兩 種不同特性結(jié)合起來對蛋白質(zhì)進行分離的技術 , 具 有較高的分辨率和靈敏度 。 雙向電泳方法的應用始 于 20世紀 70年代 ,

7、由 O Farrell 于 1975年建立并 成功地分離 1000多個 E. coli 蛋白 (肽 。 80年代早 期固相 p H 梯度 (Immobilized p H gradient , IP G 的 出現(xiàn) , 解決了 p H 梯度不穩(wěn)的問題 , 達到高度的重復 性 。 目前常用的大規(guī)格膠 (20cm ×20cm 是可再生 的 , 分離后的斑點檢測借助于考馬斯亮藍染色和銀 染 , 可對蛋白質(zhì)進行定量分析 ; 應用熒光染料 , 可分 離上千種蛋白質(zhì) , 同時應用兩種不同的熒光染料標 記兩個樣品 (差異凝膠電泳 , 在同一凝膠上電泳后 對圖像進行分析 ,2. 2 質(zhì)譜技術質(zhì)譜是蛋白

8、質(zhì)組學研究中的核心技術 , 其原理 是將樣品分子離子化 , 根據(jù)離子間質(zhì)荷比 (m/z 的差 異來分離并確定質(zhì)量 , 高靈敏度高特異性地快速鑒 定生 物 分 子 。具 體 步 驟 包 括 將 雙 向 電 泳 (2D 2 PA GE 分離到的目標蛋白質(zhì)用特定的蛋白質(zhì)酶 (例 如胰蛋白酶 消化成肽段 , 再用質(zhì)譜儀進行分析 。 質(zhì)譜鑒定有兩條主要的途徑 。一是 “肽鏈質(zhì)量 圖譜” 途徑 。測量質(zhì)譜的方法是基質(zhì)輔助激光解吸 附 /電離法 (Mat rix 2assisted laser desorption/ioniza 2 tion ,MALDI , 通過測定一個蛋白質(zhì)酶解混合物中 肽段的電離飛行

9、時間來確定分子量等數(shù)據(jù) , 所以也 稱為 基 質(zhì) 輔 助 激 光 解 吸 /電 離 飛 行 時 間 質(zhì) 譜 法 (MALDI 2TOF , 最后通過相應的數(shù)據(jù)庫搜索鑒定 蛋白質(zhì) 。 隨著數(shù)據(jù)庫中的全長基因序列越來越多 , MALDI 鑒定的成功率也越來越高 。二是串聯(lián)質(zhì)譜 途徑 , 將胰蛋白酶消化后的單個肽鏈直接從液相經(jīng) “ 電噴離子化” 而被分離 , 分解為氨基酸或含有 C 末 端的片斷 , 片斷被噴射到 “串聯(lián)質(zhì)譜儀” 進行質(zhì)量測 定 , 以得到序列信息 。 它的主要優(yōu)點是 :對鑒定蛋白 質(zhì)來說 , 由幾個肽鏈片段化得到的序列信息比一系 列的肽鏈質(zhì)量更具有特異性 。 片斷的數(shù)據(jù)不僅可以 在

10、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中搜尋 , 還可以在核酸數(shù)據(jù)庫 , 例如 EST 數(shù)據(jù)庫 , 甚至原始的基因組數(shù)據(jù)庫中搜 尋 。近來發(fā)展起了一種新型的質(zhì)譜儀 , 它將 MALDI 離子源與高效的串聯(lián)質(zhì)譜儀系統(tǒng)結(jié)合起來 (可將單 個肽鏈片斷化 , 把高產(chǎn)量的肽鏈圖譜法與高特異性 的肽鏈序列法結(jié)合起來 , 并將兩步的質(zhì)譜分析合并 為一步 。 質(zhì)譜技術還可用于蛋白質(zhì)磷酸化 、 硫酸化 、 糖苷化以及其它一些修飾的研究 。2. 3 蛋白質(zhì)芯片 (Protein chip s 技術蛋白質(zhì)芯片技術是一種高通量 、 微型化和自動 化的蛋白質(zhì)分析技術 。在蛋白質(zhì)芯片技術途徑中 , 首先將一系列的 “誘餌 (如抗體 按照 。

11、, 那些與相應 。而后 把未與抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)洗掉 , 把結(jié)合的蛋白質(zhì)洗 脫下來 , 經(jīng)凝膠電泳之后通過質(zhì)譜法進行鑒定 。這 種技術實際上是一種大規(guī)模的酶聯(lián)免疫分析 ?？梢?迅速地將目標蛋白質(zhì)從混合物中分離出來 , 并進行 分析 。 蛋白質(zhì)芯片上的 “ 誘餌” 蛋白可根據(jù)研究目的 的不同 , 選用抗體 、 抗原 、 受體 、 酶等具有生物活性的 蛋白質(zhì) 。蛋白質(zhì)芯片要比 DNA 芯片復雜得多 。芯片制 作過程中保持蛋白質(zhì)的生物活性 , 成為限制蛋白質(zhì) 芯片發(fā)展的瓶頸技術 。近年來 , 在蛋白質(zhì)芯片制作 方面獲得突破性進展 。 對蛋白質(zhì)芯片的檢測可以通 過對不同狀態(tài)細胞的蛋白質(zhì)進行熒光標記 ,

12、從測定 熒光的強度上可以得知結(jié)合在抗體上的蛋白質(zhì)的富 集程度 。 或直接利用 MALDI/MS 技術檢測結(jié)合到 芯片上的物質(zhì)來檢測 。2. 4 酵母雙雜交系統(tǒng) (Yeast two 2hybrid system 酵母雙雜交系統(tǒng)正成為研究蛋白質(zhì)間相互關系 的有力工具 。其理論基礎是轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)模型 , 即當轉(zhuǎn)錄因子的 DNA 2結(jié)合結(jié)構(gòu)域與激活結(jié)構(gòu)域緊 密結(jié)合后 , 將導致一系列基因轉(zhuǎn)錄的增加 。酵母雙 雜交系統(tǒng)利用轉(zhuǎn)錄因子 GAL4的 DNA 2結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (GAL42BD 與激活結(jié)構(gòu)域 (GAL42AD 的特異載體 , 將許多開放閱讀框架 (ORFs 分別連在這兩種載體 上 , 構(gòu)成文庫

13、, 然后轉(zhuǎn)入酵母細胞 , 并與酵母細胞克 隆雜交 。 當其中兩個 ORF 編碼的蛋白質(zhì)在酵母細 胞中表達 , 并發(fā)生相互作用時 , 就會將 GAL42BD 和 GAL42AD 結(jié)合在一起 , 從而導致報告基因轉(zhuǎn)錄的增 加 。 通過培養(yǎng)基營養(yǎng)缺陷篩選法 , 可將沒發(fā)生相互 作用的酵母克隆篩選掉 , 而將發(fā)生相互作用的酵母 克隆保留下來 。 然后對發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)進行 分析 , 通過測序就可以鑒定 ORF 。因此 , 酵母雙雜 交系統(tǒng)對大規(guī)模篩選分析蛋白質(zhì)間的相互作用來說 是一項簡便易行的方法 。3 水稻蛋白質(zhì)組學研究應用進展3. 1 水稻組織的蛋白組分析3. 1. 1 水稻不同組織差異蛋白組

14、學 在植物發(fā)育 過程中 , 不同組織和器官功能上的分化 , 也表現(xiàn)在其 蛋白質(zhì)的差異上 , 蛋白質(zhì)組學研究將有助于對發(fā)育 機制的研究 。 由 K omat su 等 (1993 8構(gòu)建的 “水稻 蛋白組文庫”導 。 水稻種子胚 、 , 2PA 分離 , ,超過 600、 100和 。經(jīng)銀染 , 葉鞘中 檢測到 700個蛋白 。胚 、 胚乳 、 葉中挑選 85個蛋白 點經(jīng)氣相蛋白質(zhì)測序儀分析 。 85個點中 , 通過 N -端序列分析鑒定了 27個蛋白 , 剩下的 70%蛋白被認 為在 N -端有堆積集團 , 中間序列測序鑒定了 23個 蛋白 。 最后作者構(gòu)建了水稻胚 、 胚乳 、 葉片的蛋白數(shù)

15、 據(jù)庫 , 并提供了每個蛋白的分子量和等電點 。 Tsugita (1994 9分析了來自水稻 9種不同組織 (葉 , 莖 , 根 , 葉 , 愈傷組織 , 芽 , 種皮等 和葉綠體的蛋 白 。上 述 9種 組 織 的 蛋 白 中 , 經(jīng) 2D 2PA GE 檢 出 4616個蛋白點 , 并對 118個蛋白進行了分析 。因為 當時缺少水稻基因組和蛋白數(shù)據(jù)庫信息 , 在葉 、 愈傷 組織 、 種子 、 莖 、 根中分別只鑒定出 16,6,3,1,1個 蛋白 。Zhong 等 (1997 10分析了水稻根部總蛋白 , 考 馬斯亮藍染色后檢測到 292個蛋白點 。 N 2端和中間 氨基酸測序分析了

16、76個蛋白 。經(jīng)同源搜索鑒定了 42個蛋白 。同年 Hirano 通過 2D 2PA GE 技術研究 了水稻種子胚 、 胚乳和葉 、 根的蛋白 。總共分析了 278個蛋白 ,4個組織中的 121個蛋白的 N 2端和中間 氨基酸序列已測出 。 然而 , 只有 51個蛋白的序列和 數(shù)據(jù)庫中的蛋白相同 。Imin 等 (2001 11對水稻花粉囊進行了蛋白組 分析 。 花粉囊對于植物產(chǎn)能很重要 , 它對各種環(huán)境 脅迫相當敏感 。 2D 2PA GE 結(jié)合銀染檢測到 4000多 蛋白點 , 分布于 PI411、 分子量 6122kD 范圍 。 其中 273個蛋白經(jīng) N 2端測序和質(zhì)譜鑒定 , 通過數(shù)據(jù)

17、 庫匹配和 PM F 分析鑒定了 62個不同蛋白 。鑒定的 蛋白大部分是管家蛋白 、 熱休克蛋白以及很多未知 功能蛋白 。 據(jù)此構(gòu)建了水稻花粉囊蛋白組圖譜 , 提 供了花粉粒發(fā)育過程中的蛋白變化證據(jù) , 并對其它 植物的花粉囊研究提供了參考 。Shen 等 (2002 12通過 Edman 測序和 MALDI 2 TO F , 。 經(jīng)圖像分析檢測到 352, 挑選的 84個主要 31個蛋 2MS 分析 , 鑒定了 59。結(jié)果顯示 ,2D 2PA GE 、 Ed 2測序 、 MALDI 2TO F 2MS 和 MS/MS 的結(jié)合應 用對于水稻葉鞘蛋白的有效分析起了重要作用 。同 時 ,Woo 等

18、 (2002 13通過一種有效的多肽圖譜技術 鑒定水稻胚蛋白組 。 經(jīng) 2D 膠分離 , 考馬斯亮藍染色 檢測到 700個蛋白點 。 從中挑選 100個胚蛋白進行 分析 , 測出 31個蛋白的氨基酸序列 , 并對剩下的 69個蛋白進行了中間序列測序 , 但僅有 28個與數(shù)據(jù)庫 已知 功 能 的 蛋 白 序 列 相 似 。他 們 通 過 MALDI 2 TO F 2MS 的多肽質(zhì)量指紋圖譜分析了另外 150個蛋 白 , 僅鑒定出 46個已知功能蛋白 。剩下的蛋白由于 缺少水稻基因組的完整核酸序列和蛋白數(shù)據(jù)庫的信 息而難以鑒定 。3. 1. 2 水稻非生物脅迫下蛋白質(zhì)組學 一些非生 物因子脅迫 ,

19、 如干旱 、 鹽漬 、 寒害 、 臭氧 、 缺氧 、 機械損 傷等 , 對水稻的生長發(fā)育和生存產(chǎn)生嚴重影響 。這 些脅迫能引起大量蛋白質(zhì)在種類和表達量上的變 化 。 蛋白質(zhì)組學分析有助于詳細了解非生物脅迫的 傷害機制以及水稻的適應機制 。Ramani 和 Apte (1997 14用放射性同位素自顯 影雙向電泳法研究水稻幼苗鹽脅迫下多基因的瞬時 表達表明 , 至少有 35個蛋白質(zhì)被鹽脅迫誘導和 17個蛋白質(zhì)被抑制 , 包括 20個在這之前未曾報道的低 豐度蛋白 。 這些發(fā)現(xiàn)對尋找滲透壓應答新基因 , 尤 其是那些在水稻鹽耐性獲得中起瞬時調(diào)節(jié)作用的基 因十分重要 。Salekdeh (2002

20、15等研究兩個水稻品種 (Oryza sativa L. cv CT9993和 cv IR62266 干旱脅迫下以 及恢復灌溉后的蛋白質(zhì)組 。 分析葉提取物電泳膠上 的 1000多個蛋白點 , 發(fā)現(xiàn)有 42個蛋白點的豐度在 干旱脅迫狀態(tài)下變化明顯 , 其中 27個點在兩個品種 中顯示了不同的反應方式 。恢復正常灌溉 10d 后 , 所有蛋白的豐度完全或是在很大程度上恢復成與對 照一樣 。Agrawal 等 (2002 16用 2D 2PA GE 、 氨基酸測序 和免疫雜交法 , 首次檢測了臭氧對水稻幼苗蛋白的 影響 。 臭氧對水稻的影響表現(xiàn)在葉片強烈的可見壞 死傷害和隨之而來的抗壞血酸過氧化物

21、酶蛋白的增 加 , 反映在 2D 電泳膠上蛋白質(zhì)點分布的變化 。檢測 的 56個蛋白中 ,6個蛋白是 N 2端阻斷 ,14個蛋白的 序列無法測定 ,36個蛋白的 N 2內(nèi)部序列被測定 。的劇烈減少 (/加氧 酶 和各種防御 、 。Shen (2003 17等應用蛋白質(zhì)組學方法研究水 稻葉鞘傷害反應相關蛋白 , 首次揭示了水稻葉鞘傷 害信號應答過程中蛋白質(zhì)的變化 。比較傷害前后蛋 白質(zhì)表達譜 , 發(fā)現(xiàn)傷害后至少有 10個蛋白被誘導或 上調(diào) ,19個蛋白被抑制或表達量下降 。通過 N 2端或 內(nèi)部氨基酸測序 , 分析了其中的 14個蛋白 , 鑒定了 9個蛋白的功能 , 其它蛋白由于 N 2端阻斷

22、, 無法得到 氨基酸序列信息 。此外 , 還通過 MALDI 2TOF 2MS 測定了 11種蛋白質(zhì) , 并與水稻數(shù)據(jù)庫相吻合 。在基 因功能被確認的蛋白質(zhì)中 , 表達量下降的蛋白有 2個鈣網(wǎng)蛋白 、 組蛋白 H1、 血紅蛋白及一種假定的過 氧化物酶 ; 表達量增加的蛋白包括胰蛋白酶抑制因 子 (BB TI 、 兩種蛋白激酶受體類似物 、 鈣調(diào)素相關 蛋白 、 核酮糖 21,52二磷酸羧化酶 /加氧酶小亞基 、 2個甘露糖結(jié)合外源凝集素 。 其中 ,4種蛋白質(zhì)已被證 實為與傷害反應直接作用的蛋白質(zhì) 。3. 1. 3 水稻激素誘導蛋白質(zhì)組學 植物體中 , 激素 起著重要的調(diào)控作用 , 水稻的蛋白

23、質(zhì)組學研究可以 為研究激素的信號傳導和作用機制打下基礎 。 Moons (1997 18等 鑒 定 了 水 稻 根 中 3個 受 ABA 誘導的蛋白質(zhì) , 其氨基酸序列測定確定其中 2 個屬于胚胎后期豐富蛋白 (L EA 的 2組和 3組 , 第 三個未知 。 用 ABA 處理水稻根并提取 mRNA , 構(gòu) 建 cDNA 文庫 , 然后用由氨基酸序列推導出的寡核 苷酸做探針進行篩選 , 分離到了相關的 cDNA , 但在 cDNA 數(shù)據(jù)庫中找不到與之相同的序列 。通過在基 因組 DNA 文庫中篩選及免疫雜交分析 , 表明這是一 個新的基因家族 , 編碼高度親水具有雙重結(jié)構(gòu)域的 蛋白質(zhì) , 沒有

24、已知的蛋白質(zhì)與之相同 。利用 N 2端序 列制備的血清在葉子 cDNA 表達文庫中篩選 , 分離 到了新的具有典型硫氧還蛋白特征的 cDNA 序列 , 并被硫氧還蛋白活性的生化實驗所證實 。Rakwal 和 K omat su (2000 19用外源茉莉酸處 理水稻的幼苗組織 , GE 分析發(fā)現(xiàn)在水稻 N 2 , 發(fā)現(xiàn)莖中有 28kD 蛋 (。 免疫雜交分析表明茉莉酸處理后 這些蛋白質(zhì)的表達具有組織特異性和發(fā)育階段特異 性 , 說明外源茉莉酸處理可以引起與植物自我防御 機制有關的基因在莖 、 葉組織中的特異性表達 。 Shen 和 K omat su (2003 20將 水 稻 葉 鞘 用 5

25、umol/L 赤 霉 素 處 理 不 同 時 間 后 的 蛋 白 經(jīng) 2D 2 PA GE 分離和計算機圖像分析 , 檢測到 33個蛋白發(fā) 生變化 , 其中 21個蛋白點表達增強 ,12個蛋白表達 減弱 , 說明赤霉素處理水稻葉鞘起碼有 30多個基因 的產(chǎn)物與之相關 。 對其中的鈣網(wǎng)蛋白 (Calreticulin 進行了深入分析 , 發(fā)現(xiàn)它有 2個不同等電點 (PI 蛋 白點 , 隨赤霉素處理時間增加 , PI4. 0的蛋白點逐漸 消失而 PI4. 1蛋白點濃度則逐漸增加 。由此說明鈣 網(wǎng)蛋白是在赤霉素信號傳遞調(diào)節(jié)葉鞘伸長中的一個 重要組分 。3. 1. 4 水稻的突變體蛋白質(zhì)組學研究 應用

26、蛋白 質(zhì)組學方法對基因突變引起的蛋白質(zhì)表達變化進行 研究可以揭示植物生理生態(tài)過程 , 得到植物遺傳學 的重要數(shù)據(jù) , 對表型突變的內(nèi)在生化過程進行研究 。 K omat su (1999a 21等比較了水稻綠苗和白化 苗的蛋白質(zhì) 2D 2PA GE 圖譜 , 發(fā)現(xiàn)了在綠苗中參與 光合作用的蛋白質(zhì) , 而白化苗中僅有此蛋白質(zhì)前體 。 而抗壞血酸過氧化物酶只在白化苗中存在 , 說明抗 氧化酶在白化苗中起細胞保護功能 。同年 , K omat su (1999b 22對水稻懸浮培養(yǎng)細胞 進行了蛋白組分析 , 分析了細胞中 103個主要的蛋 白點 , 并測定了 20個蛋白的氨基酸序列 , 分別用 N

27、2端和中間氨基酸測序分析了 32個蛋白 。搜索已鑒 定蛋白的功能類別 , 發(fā)現(xiàn)它們涉及水稻細胞懸浮培 養(yǎng)的生長發(fā)育 。3. 1. 5 水稻 2D 2PA GE 與其它新技術聯(lián)用的蛋白質(zhì) 組學 K im 等 (2001 23在水稻葉片蛋白分析中使 用一種分級方法大大推動了此領域的研究 。水稻葉 片高豐度的 RuBisCO 限制了對其它低豐度蛋白的 研究 。 他們通過簡單的抽提和 PEG 分級技術解決 了分析水稻葉片蛋白的缺點 。 這樣就能夠分析單步 22D E 分離的 2. 7倍的蛋白 , 至少可以分析葉片的 2 600個良好分離的蛋白 。 PEG 分級技術推動了復雜 組織蛋白組的分析 。K o

28、ller 等 (2002 24進行了系統(tǒng)的水稻組織蛋白 組學研究工作 。水稻葉 、 根 、PA GE 和 MudPIT (共 2528 2251 ; 其它 277個蛋 白其多肽匹配多于一個蛋白而不能鑒定 。已鑒定的 蛋白根據(jù)它們功能分為 16組 。最大組 (32. 8% 的 蛋白包括未鑒定功能的蛋白以及與數(shù)據(jù)庫的蛋白低 或無同源性的蛋白 ; 其次是代謝相關蛋白 20. 8%, 細 胞救助 、 防御 、 細胞死亡和老化 (6% , 蛋白合 成 (5% , 能量 (5% , 細胞組織 (5% , 反轉(zhuǎn)座子和質(zhì)粒 蛋白 (5% , 發(fā)育 (1% , 細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運 (5% 等等 。結(jié) 果顯示大多數(shù)已鑒定

29、的蛋白有組織特異性表達模 式 ; 而 189個蛋白 (7. 5% 在 3個組織中均有表達 。 同時代謝途徑也顯示組織特異表達 。這些結(jié)果表明 多向蛋白組技術和定量方法的結(jié)合使得 mRNA 和 蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)整合 , 并有助于理解植物的復雜代 謝網(wǎng)絡 。Tanaka 等 (2004a 25通過 2D 2PA GE 、 Edman 測序 、 MS 以及數(shù)據(jù)庫搜索 , 構(gòu)建了水稻葉鞘 、 根 、 懸 浮培養(yǎng)細胞的系統(tǒng)蛋白組 。 他們還研究了這些組織 中的赤霉素 (GA 調(diào)控蛋白 。鑒定的蛋白包括葉鞘 中 2D 膠考馬斯亮藍染色檢測的 431個點中的 79個 , 根 508個點中的 73個 , 懸浮培

30、養(yǎng)細胞 962個點 中的 140個 。通過蛋白數(shù)據(jù)構(gòu)建并功能分類 , 從數(shù) 據(jù)庫中也鑒定了 GA 調(diào)控蛋白 , 并發(fā)現(xiàn)在葉鞘 、 根 、 懸浮培養(yǎng)細胞中分別有 8、 20、 15個蛋白由 GA 調(diào) 節(jié) 。 以此構(gòu)建的水稻組織蛋白組 , 并能對 GA 引起 變化的蛋白快速評估 。 K omat su 等 (2004 26建立 了水稻蛋白組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站 (http :/gene64. dna. af 2 f rc. go. jp/RPD/main. ht ml , 提供水稻 15個不同組 織器官的蛋白組學分析的大量信息 。3. 2 水稻器官蛋白組分析水稻亞細胞組分分析提供了功能基因組學的有 用信息

31、, 包括基因組序列開放閱讀框 、 亞細胞組分功 能蛋白的鑒定 , 以及這些組分生物發(fā)生相關的新組 分的鑒定 。 目前 , 各種水稻細胞器的蛋白組研究有 所進展 。 研究比較多的細胞器是葉綠體 。據(jù)估計高 等植物大約共有約 21000個蛋白質(zhì) , 葉綠, 關于線粒體與細胞。Tsugita 等 (1994 28首先對水稻葉綠體進行了 蛋白組分析 。經(jīng) 2D 膠分離檢測出 276蛋白點 , 對 16個蛋白進行了 N 2端序列分析 , 并對 13個蛋白測 序分析 。這是首次對水稻葉綠體蛋白組分析的報 道 , 提供了水稻葉綠體蛋白的概況 。Mikami 等 (2001 29分離了水稻高爾基體 。高 爾基

32、體是水稻重要的多功能器官 , 是重要生化過程 進行的場所 , 特別是復雜細胞表層多聚糖的生物合 成以及糖蛋白加工修飾的場所 。 水稻中至少報道了 4種高爾基體組分 。并通過植物凝集素和一些特異 抗體分析 , 鑒定了水稻高爾基體組織特異性蛋白 。 Mikami 等 (2002 30用 2D E 技術來分離水稻細胞器 官的膜蛋白 。 Cytosolic (胞質(zhì) 和膜結(jié)合蛋白經(jīng) 2D 2 PA GE 和 N EP H GE 2PA GE (非平衡 P H 梯度 電泳 兩種技術分離比較 , 結(jié)果顯示 N EP H GE 2PA GE 對 于水稻膜結(jié)合蛋白的蛋白組分析相當有效 , 而 2D 2 PA G

33、E 對于水稻胞質(zhì)成分的分辯率更高 。Heazlewood (2003 31等用 2D 2PA GE 、 Blue 2n 2 ative PA GE 和反相高效液相質(zhì)譜 (L C/MS 的方法 對純化的水稻線粒體蛋白進行分離 , 再用胰蛋白酶 消化 , 然后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析 (MS/MS 。通過查找 水稻基因組的開放閱讀框架譯碼和表達序列標簽 (EST ,Exp ressing sequence tags 譯碼 , 與質(zhì)譜分析 6 2005 年第 6 期 生物技術通報 Biotechnolog y B ulleti n 所得數(shù)據(jù)進行比對 ,鑒定了其中 149 個蛋白點 ( 91 個 非冗余基因的

34、產(chǎn)物 , 包括親水/ 疏水蛋白 、 強酸/ 堿 性蛋白和大分子蛋白 ( 分子量為 6. 7 2. 52kD 的序 列 。確定了 85 個蛋白的功能 ,包括線粒體的許多主 要的功能蛋白 。 3. 3 水稻核蛋白組分析 Mo nowar 等 ( 2004 27 通過 2D2PA GE 分離核 蛋白 ,采用 Image2Master 2D Elite 軟件分析考馬斯 亮藍染色的 p H4 10 的膠條 , 有 549 個蛋白點 , 挑 選 257 個豐度較高蛋白點 ,再 Edman 測序和 MS 分 析 。分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至 PVD F 膜上 , 選擇 100 個 清晰可見的蛋白點進行 Edman

35、測序 , 鑒定出 17 個 N2端氨基酸序列 ,剩下 83 個蛋白 N2端集團堆積 , 再 經(jīng)多肽圖譜分析鑒定了 22 個蛋白的中間氨基酸序 列 。在這鑒定的 39 個蛋白里 ,9 個蛋白序列不能匹 配數(shù)據(jù) 庫 的 已 知 蛋 白/ 基 因 。然 后 178 個 蛋 白 經(jīng) MALD I2 TO F2MA SS 系統(tǒng)分析 , 鑒定了其中 160 個 蛋白 ,其余的 18 個與已有數(shù)據(jù)庫的水稻蛋白/ 基因 沒有同源性 。詳細的水稻核蛋白的數(shù)據(jù)提供在 ht 2 tp :/ / gene64. dna. aff rc. go . jp/ RPD/ main. ht ml . 鑒 隨著蛋白質(zhì)組研究的深

36、入 , 在闡明諸如生長 、 發(fā)育 、 進化及代謝調(diào)控等生命活動的規(guī)律等方面會有重大 突破 ?？梢灶A期 , 所有的植物科學領域?qū)⒌靡嬗诟?通量技術和生物信息學的發(fā)展 , 朝著一個現(xiàn)代的植 物系統(tǒng)生物學發(fā)展 。 參考文獻 1 G Paul Bolwell , Antoni R Slabas ,J ulian P Whitelgge. Phyto2 chemist ry , 2004 , 65 (12 : 16651669. 2 Wasinger VC , SJ . Cordwell , A. Cerpa2Poljak ,et al . Elect rop ho2 resis , 1995 , 16

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43、和蛋白折疊 ( 3 % 。以及其它分類功能如防 御、 產(chǎn)能 、 細胞死亡等等 。 4 前景和展望 近年來 ,水稻蛋白質(zhì)組學在蛋白鑒定和功能分 析方面有了巨大進展 , 本文分類概述水稻蛋白組所 取得的主要成就 。 蛋白質(zhì)組學是一門新興的學科 , 目前仍然存在 著一些技術上的挑戰(zhàn) : 如蛋白質(zhì)的動態(tài)分辨率問題 、 蛋白質(zhì)組的純化技術 、 蛋白質(zhì)組定量技術以及疏水 性膜蛋白的分離 、 顯形及鑒定的問題等等 。 蛋白質(zhì)組學的規(guī)模和研究關注的焦點在不斷改 變 , 它從最初只是鑒定一個生物樣品盡可能多的單 個蛋白已發(fā)展到用高通量 、 相關定量技術來分析蛋 白質(zhì)組動力學 , 同時需要發(fā)展生物計算機技術來整

44、合蛋白質(zhì)組的巨大數(shù)據(jù)并用以描述復雜生物系統(tǒng) 。 ( 下轉(zhuǎn)第 11 頁 2005 年第 6 期 吳利民等 : 植物錨蛋白研究進展 18 Li H Y ,Chye ML . Plant Mol Biol ,2004 ,54 (2 :23343. 11 10 L u H ,Rate DN , Song J T , Greenberg J T. The Plant Cell ,2003 , 15 (10 :24082420. 11 Dong X. Sci S T KE ,2004 , (221 :pe6. 12 Dong X ,Li X ,Zhang Y ,et al . Novartis Found

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