全血pH環(huán)境對紅細(xì)胞膜流動(dòng)性和膜蛋白的影響

1、 論 著 5全血pH環(huán)境對紅細(xì)胞膜流動(dòng)性和膜蛋白的影響高美霞 吳敏慧 紀(jì)云鵬 蔡 莉 王泰瑞 楊 瑩 梁文飚*（江蘇省血液中心，江蘇 南京 210042）【摘要】目的 研究全血紅細(xì)胞胞外pH環(huán)境對紅細(xì)胞膜流動(dòng)性和膜蛋白的影響。方法 將全血紅細(xì)胞懸浮在不同pH值的ACD-B保養(yǎng)液中，分別在4、8和24h，利用熒光探針1，6-二苯基-1，3，5-己三烯（DPH）和SDS-PAGE電泳檢測紅細(xì)胞膜流動(dòng)性及紅細(xì)胞膜蛋白；利用透射電鏡觀察紅細(xì)胞形態(tài)；利用比色法檢測紅細(xì)胞上清中游離血紅蛋白（FHb）。結(jié)果 除了環(huán)境pH在6.8的實(shí)驗(yàn)組外，其余各組的紅細(xì)胞的偏振度、微黏度、Band3蛋白、紅細(xì)胞形態(tài)和FHb

2、與正常對照組存在差異性顯著。結(jié)論 全血pH環(huán)境可影響紅細(xì)胞膜流動(dòng)性和膜蛋白的表達(dá)，可對紅細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響?！娟P(guān)鍵詞】pH；紅細(xì)胞；膜流動(dòng)性；膜蛋白中圖分類號：R331 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1671-8194（2011）13-0005-03Effects of Suspension pH and Storage Time on the Erythrocyte Membrane Fluidity and Membrane ProteinGAO Mei-xia, WU Min-hui, JI Yun-peng, CAI Li, WANG Tai-rui, YANG Ying, LIANG W

3、en-biao(Jiangsu Province Blood Centre, Nanjing 210042, China)Abstract Objective To study the effects of suspension pH and storage time of whole blood on the erythrocyte membrane uidity and membrane protein. Methods Whole blood erythrocytes were suspended in different pH acid citrate dextrose B solut

4、ion and their membrane fluidity, membrane protein, morphology of erythrocyte membrane and concentration of free hemoglobin(FHb) were assessed at the time of 4h, 8h and 24h by means of 1, 6-diphenyl-1, 3, 5-hexatriene(DPH) uorescence probe, SDS-PAGE electrophoresis, transmissionel ectron microscope a

5、nd spectroscopy respectively. Results Except for pH 6.8 experimental group, there is a signi cant difference in uorescence polarization(P), mean microviscosity (), Band3 protein and FHb on comparaison with the control group. Conclusion Suspension pH and storage time of whole blood may in uence the e

6、rythrocyte membrane uidity, membrane protein expression and the morphology of erythrocyte membrane, may produce affects on the red blood cell function.Key words pH; Erythrocyte; Membrane uidity; Membrane protein紅細(xì)胞懸液由全血制備而來，是目前臨床輸血中使用最多的紅細(xì)胞類血液制劑。本研究探討了全血紅細(xì)胞用于MAP紅懸液制備前，其細(xì)胞外pH和作用時(shí)間對紅細(xì)胞膜流動(dòng)性、膜蛋白和形態(tài)的影響，為

7、探討某些特殊情況的血液（如不足量血）制備紅細(xì)胞懸液的應(yīng)用潛能提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 儀器及試劑HITACHI KY2000型半自動(dòng)生化分析儀、JEM-1010透射電鏡、島津RF-540型熒光分光光度計(jì)、NanoDrop ND-1000微量紫外可見分光光度計(jì)、Bio-Rad電泳儀及Quantity One分析軟件；ACD-B全血保養(yǎng)液為山東威高公司產(chǎn)品，1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（diphenyl-hexatriene，DPH）為Sigma公司產(chǎn)品,標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白由MBI公司生產(chǎn)，游離血紅蛋白測定試劑由南京生物建成公司提供。1.2 方法采用文獻(xiàn)1方法。采用熒光偏振法檢測熒光偏振度

8、并計(jì)算出紅細(xì)胞膜的微黏度。用四氫呋喃作溶劑配制2×10-3mol/L的熒光探針DPH儲存液，于棕色瓶中4保存。臨用前用等滲PBS稀釋為2×10-6mol/L的工作液，取2mL紅細(xì)胞膜蛋白（蛋白濃度0.03g/L），加入2mL DPH工作液，37溫育30min，用熒光分光光度計(jì)，測定其熒光偏振度P（激光波長362nm，發(fā)射波長432nm激發(fā)狹縫10nm，發(fā)射狹縫10nm）。利用P與微黏度（）的定量關(guān)系計(jì)算出紅細(xì)胞膜的微黏度。I=IVV+2 IVH；P=IVV-GIVH/IVV +GIVH；=2P/（0.46-P）其中IVV為起偏器與檢偏器光軸均在垂直方向時(shí)的熒光強(qiáng)度，IVH為

9、起偏器光軸在垂直方向，檢偏器光軸在水平方向時(shí)的熒光強(qiáng)度IVV為二者光軸均在水平方向的熒光強(qiáng)度，IHV為起偏器光軸在水平方向、檢偏6 論 著 圖1 不同pH值儲存環(huán)境和保存時(shí)間圖2 不同Ph值儲存環(huán)境及保存時(shí)間圖3 不同Ph值環(huán)境和儲存時(shí)間對游圖4 紅細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE電泳分析對紅細(xì)胞膜熒光偏振度的影響對紅細(xì)胞膜微黏度的影響離血紅蛋白的影響數(shù)據(jù)采用SPSS15.0進(jìn)行重復(fù)測量數(shù)據(jù)分析。2 結(jié) 果2.1 不同pH值處理后，紅細(xì)胞膜熒光偏振度、微黏度和紅細(xì)胞上清中FHb濃度見圖13。圖3中，0h與4h、0h與8h、0h與24h、4h與8h、4h與24h和8h與24h處理組中，除pH=6.8組

10、外，各組的游離血紅蛋白有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。2.2 紅細(xì)胞膜蛋白SDS-PAGE電泳分析見圖4。圖4中，C為正常對照組，1和2為分別在pH 5.0保養(yǎng)液中處理8h和4h的實(shí)驗(yàn)組；3和4為分別在pH 6.2保養(yǎng)液中處理8h和4h的實(shí)驗(yàn)組；5和6為分別在pH 6.8保養(yǎng)液中處理8h和4h的實(shí)驗(yàn)組。2.3 全血紅細(xì)胞胞外pH環(huán)境對細(xì)胞膜形態(tài)學(xué)的影響顯微鏡下觀察的正常紅細(xì)胞，表面光滑，邊緣整齊。當(dāng)紅細(xì)胞胞外pH6.8后，紅細(xì)胞膜形態(tài)發(fā)生改變，大部分表面棘狀突起有伸出，并伴隨有細(xì)胞的聚集，見圖5。3 討 論紅細(xì)胞周圍環(huán)境pH值的變化可影響脂雙層的穩(wěn)定性和磷脂在細(xì)胞膜上的分布，可改變細(xì)胞膜的力學(xué)特性

11、、細(xì)胞形態(tài)大小以及細(xì)胞內(nèi)Hb分子的結(jié)構(gòu)與濃度而影響紅細(xì)胞的功能和存活2-4。研究證實(shí)，紅細(xì)胞胞外酸堿度與細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、膜的變形能力和流動(dòng)特性以及血紅蛋白的攜氧能力相互密切關(guān)聯(lián)；Gedde報(bào)道5紅細(xì)胞在胞外pH值低于6.3時(shí)，紅細(xì)胞膜曲率為負(fù)數(shù)，可對胞膜的力學(xué)特性及細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響。DPH被認(rèn)為是一種比較敏感的熒光探針，通過測定反映膜脂區(qū)紅細(xì)胞正常形態(tài)的維持依賴于細(xì)胞膜及膜骨架的支持，因此細(xì)胞形態(tài)可以反映細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的變化。當(dāng)紅細(xì)胞經(jīng)不同pH值環(huán)境和儲存時(shí)間處理后，部分紅細(xì)胞發(fā)生棘突和形態(tài)改變，聚集程度增加，而膜上的自聚集作用可能導(dǎo)致膜融合和形成非專一性離子通道，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。另外

12、，紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的降低，也可造成細(xì)胞膜的損害甚至溶血。紅細(xì)胞在不同pH值保養(yǎng)液中的儲存時(shí)間對其微黏度和流動(dòng)性的影響是顯著的，通過研究與紅細(xì)胞膜的彈性特性相關(guān)的內(nèi)在性膜蛋白Band3的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)在低于pH 6.8的儲存環(huán)境中，Band3的表達(dá)量隨著環(huán)境pH的降低和儲存時(shí)間的延長而顯著減少；而在pH 6.8的保養(yǎng)液中，Band3在4h內(nèi)的表達(dá)量與正常對照組基本相同。Band3為多次跨膜蛋白，具有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，Band3和血型糖蛋白分別通過Band 2.1和Band 4.1與收縮蛋白結(jié)合，使骨架網(wǎng)絡(luò)附著于膜脂雙層上形成膜骨架6，低pH環(huán)境和保存時(shí)問的延長，導(dǎo)致Band3蛋白圖5 紅細(xì)胞膜受pH

13、值環(huán)境和儲存時(shí)間影響而發(fā)生形態(tài)學(xué)的改變（A 20000×的正常紅細(xì)胞形態(tài)；B 20000×的異常紅細(xì)胞形態(tài)；C 60000×的正常紅細(xì)胞形態(tài)；D 60000×的異常紅細(xì)胞形態(tài)）1978,515(4):367-394. 論 著 7數(shù)量減少或被氧化、降解，與其他蛋白或自身交聯(lián)、構(gòu)型改變，骨架蛋白失去與膜內(nèi)表面的連接，紅細(xì)胞膜上的脂蛋白及脂質(zhì)逐漸喪失，使紅細(xì)胞膜的微黏度升高，膜流動(dòng)性降低，紅細(xì)胞逐漸變形，脆性增加。因此，初步的研究結(jié)果表明，盡早將紅細(xì)胞從異常pH環(huán)境中分離出來，對于保證紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能是非常必要的。目前國內(nèi)外采供血機(jī)構(gòu)普遍使用ACD（pH 5

14、.03），CPD（pH 5.60）和CPDA（pH 5.60）保養(yǎng)液采集全血，由于不足量血的紅細(xì)胞與保養(yǎng)液的比例失調(diào)，導(dǎo)致紅細(xì)胞的胞外pH值低于正常標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而影響紅細(xì)胞的能量代謝和生理功能。本研究的意義在于為進(jìn)一步探討不足量血紅細(xì)胞的百分比含量以及全血分離時(shí)間與紅細(xì)胞懸液質(zhì)量的關(guān)系，為不足量血潛在的綜合利用提供依據(jù)，不僅可進(jìn)一步節(jié)約寶貴的血液資源，也體現(xiàn)了對無償獻(xiàn)血者的尊重，在目前血液供應(yīng)緊張的情況下，不失為一種開源節(jié)流、合理用血的應(yīng)對策略之一。參考文獻(xiàn)1 Shinitzky M,Barenholz Y.Fluidity parameters of lipid regionsdetermine

15、d by fluorescence polarizationJ.Biochim Biophys Acta,2 Libera J,Pomorski T,Muller P,et al.Influence of pH on phospholipidredistribution in human erythrocyte membraneJ.Blood,1997,90(4):1684-1693.3 Ivanov IT.Low pH-induced hemolysis of erythrocytes is relatedto the entry of the acid into cytosole and

16、oxidative stress on cellularmembranesJ.Biochim Biophys Acta,1999,1415(2):349-360.4 Crandall ED,Critz AM,Osher AS,et al.Influence of pH on elasticdeformability of the human erythrocyte membraneJ.Am J Physiol,1978,235(5): C269-278.5 Gedde MM,Davis DK,Huestis WH.Cytoplasmic pH and humanerythrocyte shap

17、eJ.Biophys J,1997,72(3):1234-1246.6 Salhany JM,Cordes KA,Sloan RL.Characterization of the pHdependence of hemoglobin binding to band 3: evidence for a pHdependent conformational change within the hemoglobin-band 3 complexJ.Biochim Biophys Acta,1998,1371(1): 107-113.細(xì)胞膜穿透肽在腫瘤治療中的應(yīng)用策略徐雅君1 曾慶友1,2* 許瑞安1

18、*（1 教育部分子藥物工程研究中心、華僑大學(xué)分子藥物學(xué)研究所，福建 泉州 362021；2 華僑大學(xué)化工學(xué)院，福建 泉州 362021）【摘要】目的 探討細(xì)胞膜穿透肽（CPP）作為載體在生物大分子藥物給藥過程中存在的不足，對其解決的方法進(jìn)行總結(jié)。方法 分析細(xì)胞膜穿透肽的體內(nèi)給藥過程，總結(jié)在各個(gè)階段中細(xì)胞膜穿透肽的狀態(tài)、功能及存在的問題。結(jié)果 將細(xì)胞膜穿透肽的給藥過程分為3個(gè)階段：體內(nèi)循環(huán)階段、跨膜階段及胞內(nèi)階段，細(xì)胞膜穿透肽要在體內(nèi)循環(huán)階段保持被掩蓋狀態(tài)，到靶組織細(xì)胞附近釋放進(jìn)行跨膜，而在進(jìn)入細(xì)胞后要逃脫溶酶體的降解。結(jié)論 細(xì)胞膜穿透肽能夠有效地將生物大分子導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞，使生物大分子在腫瘤治療

19、中的應(yīng)用更具潛力，但仍存在很多的不足之處，需進(jìn)一步改進(jìn)?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)胞膜穿透肽；腫瘤治療；跨膜機(jī)制中圖分類號：R73-36 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-8194（2011）13-0007-04The Strategies for Cell Penetrating Peptides Used in Tumor TherapyXU Ya-jun1, ZENG Qing-you1,2, XU Rui-an1(1 Engineering Research Center of Molecular Medicine, Ministry of Education & Institute of

20、 Molecular Medicine, HaoqiaoUniversity, Quanzhou 362021, China;2 College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China)Abstract Objectine To study the shortages of cell penetrating peptide (CPP) applied in biomacromolecules delivery, and show some methods used to solve the prob

21、lems occurred in studies. Methods Show the process of CPP as a vector delivered in vivo, and analyze states, roles and the shortages of CPP worked in different stages to get the strategies to optimize CPP. Results The process of CPP circulated in vivo can be divided into three stages: blood circulation stage, transmembrane stage and intracellular stage, CPP has to be masked in blood and released near target cells to enhance the transmembrane ef ciency, then to escape from endosome with som