白血病融合基因檢測綜述

1、白血病相關融合基因的檢測及意義白血病是造血系統(tǒng)的惡性克隆性疾病，由于造血干細胞受損，導致克隆中 的白血病細胞失去進一步分化成熟的能力而停滯在細胞發(fā)育的不同階段。白血 病細胞具有自我更新增強、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等特點，患者會出 現(xiàn)不同程度的貧血、出血、感染和浸潤的臨床癥狀，嚴重危害生命健康。近年 來，隨著細胞生物學和分子生物學技術的發(fā)展，人們已經(jīng)認識到大部分的白血 病中都存在著包括缺失、重復、易位等染色體畸變，導致原癌基因或抑癌基因吉構變異，原癌基因激活或抑癌基因失活，產(chǎn)生新的融合基因，編碼融合蛋白?，F(xiàn)有報道的染色體畸變已有五十種以上，累及更多數(shù)目的融合基因，這些異常 已經(jīng)逐漸成為不同

2、類型白血病的分子生物學特異性標志。白血病相關融合基因的種類多樣，常見的融合基因有BCR-ABL、AML1-ETO、PML-RAR、 E2A-PBX1 MLL-AF4 TEL-AML1 SIL-TAL1、DEK-CAN CBFp -MYH11等。BCR( breakpoint cluster region)基因是BCR-AB融合基因的組成部分, 與費城染色體（Philadelphia Chromosome的形成有關，具有兩種轉(zhuǎn)錄異構體。正常的BCRS因編碼產(chǎn)物的功能還尚未清楚，它編碼的蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，是RAC和CDC4的GT酶激活蛋白。ABL1基因是編碼細胞質(zhì)和細胞核 蛋白酪氨酸

3、激酶的原癌基因，與細胞分化、細胞分裂、細胞粘附、應激反應等 生命活動相關。活化的ABL1蛋白通過SH3吉構域受到負調(diào)控，SH3吉構域的缺失 會導致ABL1基因轉(zhuǎn)化為癌基因。CDC介導的磷酸化能夠調(diào)節(jié)ABL1酪氨酸激酶的DNA吉合活化過程，表明ABL何能在細胞周期中發(fā)揮作用。Nowell及Hungerford于I960年發(fā)現(xiàn)在慢性粒細胞性白血病（CML患者外周血中有一個比G組染色體還小的近端著絲粒染色體，由于首先在美國費城（PhiladeIphia ）發(fā)現(xiàn)，故命名為費城染色體。1971年O'Riordon利用熒光顯帶法確認費城染色體是第22號染色體長臂缺失大段后剩余的部分。1973年Ro

4、wley發(fā)現(xiàn)缺失下來的那部分通常易位到 9號染色體長臂的末端，形成t（9； 22）（ q34;q11）o 1982年Deklein等在費城染色體上首次發(fā)現(xiàn)了原來位于9號染色體長臂末端（9q34）的癌基因ABL1,證明費城染色體上有來自9號染色體長臂末端的片端, 是22號染色體與9號染色體相互易位的產(chǎn)物。易位使 9號染色體長臂（9q34）上的原癌基因ABL1和22號染色體（22q11）上的BCF基因重新組合成融合基因，因 而稱為BCR-AB融合基因。BCR-AB融合基因編碼的融合蛋白具有很強的酪氨酸激酶活性，改變細胞多種蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化水平和細胞微絲機動蛋白的功能，擾亂細胞內(nèi)正常的信 號傳導途

5、徑，使細胞失去了對周圍環(huán)境的反應性，并抑制凋亡的發(fā)生，影響細胞周期調(diào)控，導致骨髓造血干細胞過度增殖。BCR-AB融合基因在病人中常見有四種剪接體mRNA編碼P210融合蛋白的b2a2和b3a2,編碼P190的e1a2,編碼P230 的e19a2。其中b3a2和b2a2主要存在于CML ela2主要在急性淋巴細胞性白血病 （ALL）中出現(xiàn)，而出現(xiàn)較少的e19a2根據(jù)2008年世界衛(wèi)生組織（WHO最新版的血液系統(tǒng)腫瘤分類標準，也應被診斷為 CML 90%上的CM患者血細胞中都發(fā)現(xiàn)有費城染色體的存在，主要為 P 210融合蛋白，因而費城染色體和 BCR-AB融合基因可以作為區(qū)分典型CM和非典型CM的

6、診斷指標。同時在費城染色體陽性的 ALL患者中，65%勺成人和80%勺兒童能夠檢測到P190融合蛋白陽性。由于BCR-AB融合蛋白能夠收到多種小分子化合物的抑制，臨床上第一代針對BCR-AB融合蛋白的酪氨酸激酶小分子抑制劑（TKI ）伊馬替尼就是是通過結合抑制 BCR-AB融合蛋白的酪氨酸激酶結構域來抑制其在細胞周期中的影響，從而發(fā)揮抗白血病作用的。第二代BCR-AB酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼和尼洛替尼也是在這個基礎上進行改進，以以減少因伊馬替尼使用而帶來的抗藥性。對費城染色體和BCR-AB 融合基因的檢測，對于正確區(qū)分 CM類型，指導臨床治療和判斷預后情況具有重要的指導作用。RUNX(1 Ru

7、nt-relatedtranscription factor 1)基因也被稱為 AML1(acutemyeloid leukemia 1) 基因或 CBFA2( core-b inding factor sub unit alp ha-2基因，RUNX基因編碼的RUNX蛋白是調(diào)控造血干細胞分化為成熟血細胞的轉(zhuǎn)錄因子，是 RUNXRunt-relatedtranscriptionfactor )家族或 CBFa (core bindingfactor- a）的成員，能夠與CBFB蛋白形成異質(zhì)二聚體復合物，增強DNA吉合和復合物的穩(wěn)定性。人的 RUNX基因全長260kb，在21號染色體（21q22

8、.12）上,有兩個選擇性轉(zhuǎn)錄啟動子，能夠通過選擇性剪接形成多種轉(zhuǎn)錄異構體。全長的RUNX蛋白由12個外顯子編碼形成，在這些外顯子中，包含有兩個結構域，分別被命名為 RHD( runt homology domain )和 TAD( transactivations domain），前者由2,、3、4號外顯子編碼形成，后者由 6號外顯子編碼形成。RUNX蛋白分別通過這些結構域來介導DNA吉合和蛋白間相互作用。RUNX的轉(zhuǎn)錄過程受兩個增強子的調(diào)節(jié)，這些組織特異性的增強子能夠結合淋系或紅系調(diào)控蛋白，促進RUNX基因在造血系統(tǒng)中的高度活化。RUNX在胚胎發(fā)育的造血過程中發(fā)揮著至關重要的作用，在所有的造

9、血部位都有表達，能促進造血干細胞和造血祖細胞的形成。在分子水平，RUNX基因通過結合血小板生成素 TPO（ thrombopoietin ）受體 c-Mpl 的啟動子，募集轉(zhuǎn)錄活RUNX1化子或抑制子，進而促進造血干細胞的生成或向其他造血細胞方向分化。還能夠通過上調(diào)Smad的表達來促進蛋白體降解。ETOS因又稱RUNX1T基因，編 碼的蛋白是一種鋅指結構轉(zhuǎn)錄因子和癌蛋白。AML1-ET（融合基因主要見于急性髓系白血病（AML患者中，t（ 8； 21） （q22;q22）染色體易位導致21號染色體的原癌基因AML基因和8號染色體的ETC基因融合，形成AML1-ET和ETO-AML融合基因。ETO

10、-AML不能通過聚合酶鏈式反應（PCR檢測到，一般被認為其表達量極低或由于降解導致表達不穩(wěn)定。AML1-ETO融合基因表達的蛋白全長含有 752個氨基酸，其N端為RUNX1（runt-relatedtran scri ptio n factor 1），也稱AML區(qū); C端是8號染色體編碼的RUNX1T1runt-related transcription factor 1; translocated to, 1 (cyclinD-related) ，也稱 ETO。AML1-ET（融合基因主要發(fā)生在 M2型AM患者中（約40%,在M2啲陽性率達 90%因而可以作為M2I分型診斷的重要分子標志，少

11、見于 M4和M1,極少數(shù)骨髓增生異常綜合癥(myelodysplastic syndrome, MDS )患者中也有 AML1-ETO4合基因的存在。臨床上將 AML1-ETO蟲合基因作為分子分型診斷和預后觀察的一個重要依據(jù)，AML1-ETO4合基因陽性的患者預后較好。AML1-ETO3性的白血病細胞有一定程度的分化能力，能分化為較成熟的嗜中性粒細胞核嗜酸性粒細胞， 對化療反應較為敏感，因而 AML1-ET（融合基因陽性的患者采用大劑量的阿糖胞苷治療，完全緩解率高達98% 5年存活率達到67%預后較除M3外的其他亞型好。因而對初診患者的AML1-ET（融合基因檢測，對預后判斷和治療方案的制定具

12、有 重要意義。PM(P romyelocytic leukemia )基因編碼的 PM 蛋白，屬于 TRIM( tri partitemotif )家族的成員，定位在核小體上，具有轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤抑制蛋白的功能。PM的表達與細胞周期有關，能夠調(diào)節(jié) p53對致癌信號的反應。RAFa( Retinoic acid receptor alpha，維甲酸 a 受體)也叫 NR1B1( nuclear receptor subfamily 1 ， group B ， member 1 )基因，能編碼細胞核受體蛋白。維甲酸信號由兩種細胞核受體家族轉(zhuǎn)導，分別是 RAR(retinoicacid recepto

13、r )和 RXR(retinoidX rece ptor)，兩者能夠結合形成RXR/RA異質(zhì)二聚體。在沒有配體存在的情況下，DNA吉合的RXR/RA復合物通過募集共阻遏物 NCOR、NC0R2(SMRT和組蛋白脫乙酰基酶來抑制轉(zhuǎn)錄過程的進行；當配體結合到復合物時，就能夠誘導構 像發(fā)生改變，允許募集共活化物、組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶，使轉(zhuǎn)錄過程進行下去。PML-RARt融合基因是急性早幼粒細胞白血病( acute promyelocytic leukemia , APL)的特異性分子標志，見于 98%的APL患者中。APL患者的特異性細胞遺傳學異常t (15; 17) (q22; q21)，導致15號

14、染色體上的早幼粒細胞白血病基因(PML和17號染色體上的維甲酸受體a( RARx)形成PML-RAR融合基因。正常的RARx等位基因編碼野生型維甲酸受體，與維甲酸結合可以調(diào)節(jié)多 個靶基因的轉(zhuǎn)錄。PM是POD(PML oncogenic domain )多蛋白復合體的核心組 分，通過轉(zhuǎn)錄共激活作用，可以抑制腫瘤生長，在多種凋亡途徑中起重要作用。形成PML-RAX融合基因后，維甲酸核受體基因表達受抑制，使維甲酸對靶基因 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能喪失；PML-RAR融合蛋白通過負顯性抑制作用抑制早幼粒細胞 分化成熟；PM去定位使POD勺結構破壞，形成上百個細小顆粒分布在核及胞質(zhì) 中，正常的抑制增殖和促凋亡功能

15、發(fā)生障礙，導致細胞大量增殖，凋亡減少， 這些導致了 APL的發(fā)生。形成PML-RAR融合基因的RARx部分斷裂位點位于2號內(nèi)含子上，而PM部分的斷裂位點有三種，因此將 PML-RAR融合基因分為三類:1） PM斷裂位點在6號內(nèi)含子上的BCR型（L型），占APL患者的55% 2） PM斷裂位點在6號外顯子上的BCR2（ V型）,占APL患者的5% 3） PM斷裂位點在3號內(nèi)含子上的BCR型（S型）,占APL患者的40%由于PML-RAa融合基因與APL發(fā)生的重要相關性，臨床上已經(jīng)將 PML-RAa融合基因作為動態(tài)評估患者病情及預后的重要依據(jù)。E2A基因編碼蛋白能夠與Neurol成二聚體復合物,調(diào)

16、控多種基因的轉(zhuǎn)錄過程。PBX1( Pre-B-cell leukemia transcription factor 1）基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子PBX能夠與HOXB1 MEIS1和HOXB等蛋白相互作用,形成復合物， 結合到 DNA上,促進轉(zhuǎn)錄過程的進行。 臨床中發(fā)現(xiàn)的E2A-PBX融合基因是由t （1; 19） （ q23;p13）易位形成的，編碼的融合蛋白中E2A氨基端轉(zhuǎn)錄活化域結合到PBX伺源結構域蛋白的DNA吉合域上，是急性淋巴細胞白血?。ˋLL）中常見的染色體畸變,見于3-5%的兒童ALL患者和3%fe右的成人前B-ALL患者中，在兒童前體B細胞ALL（Precursor-B ALL ）患

17、者中20-25%可以檢測到E2A-PBX融合基因陽性。E2AS因13號外顯子和PBX1的2號外顯子斷裂后相連接，形成 E2A-PBX融合基因，同時在5-10%的E2A-PBX融合基因陽性患者中發(fā)現(xiàn)連接點處有 27個核苷酸的突變，編碼出兩種不同的蛋白P85和fy77，兩者只在PBX1部分的羧基端存在差異，并都具有轉(zhuǎn)化特性，屬于癌蛋白。近年來隨著化療方案的改進，對于E2A- PBX融合基因陽性的ALL兒童采用更強烈的化療方案，可以改善其預后,5年無病生存率（EFS已達89.5%。E2A-PBX融合基因陽性和預后關系不明顯,但是可以作為ALL和微小殘留病變（MRD診斷分子標志。DEK癌基因編碼的蛋白

18、具有一個 SAP吉構域，該蛋白能夠結合到十字形和超螺旋DNAt，誘導閉環(huán)DNAb現(xiàn)超螺旋結構，并且與 mRN形成中剪接位點的選擇密切相關。該區(qū)域的染色體異常會增加 DEKS因的表達，產(chǎn)生針對DEKI白的抗體，引起多種疾病。 CANS因又稱為Nup 214 （Nuclear pore comp lex ，核孔復合 物）基因，它編碼的核孔復合物蛋白是延伸通過核膜的主要結構，形成一個能夠調(diào)節(jié)大分子在細胞核與細胞質(zhì)之間流通的通道。CANS因編碼的蛋白定位在核孔復合物的細胞質(zhì)一面，是細胞周期和核質(zhì)轉(zhuǎn)運正常運行的必要調(diào)節(jié)。DEK-CA融合基因是由VonLindern等人在1990年研究發(fā)現(xiàn)的t （6; 9

19、） （p23;q34）易位，導致6號染色體上的DEKS因和9號染色體上的CAI基因融合形成的。CAI基因的3'部分和DEKS因的5'部分發(fā)生融合，在6號染色體短臂上產(chǎn)生DEK-CA融合基因，轉(zhuǎn)錄形成一個異常的 5.5kb的mRNA DEK-CA融合基因主要見于急性髓系白血病（AML的M2型和M4型中，也見于M1型，且常常是唯一存在的 核型，發(fā)生率為0.5%4%這種異常也存在于MDS勺難治性貧血伴原始細胞增多 癥（RAEB中。伴有這種染色體異常的患者的年齡一般比較輕，且預后較差。對于DEK-CA融合基因的檢測，有助于輔助診斷分型和判斷預后。SIL-TAL1融合基因僅見于急性T淋巴

20、細胞白血病中（T-ALL ），約占26%由TALI®1p32的部分缺失形成，是T-ALL的特異性克隆標志，是兒童 T-ALL患者中最為常見的一類染色體異常，在兒童患者中出現(xiàn)的頻率要遠高于成人患者。由 因的5'端丟失，與SIL基因的5'端融合，形成SIL-TAL1融合基因，TAL1編碼序 列在SIL啟動子的調(diào)控下在T細胞中表達。SIL基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRN存在于整個細 胞周期中，其編碼的含有1283個氨基酸的胞質(zhì)蛋白，在細胞進入 G2期時積累,在細胞周期完成時降解。而 SIL-TAL1融合基因的形成，引起了細胞周期調(diào)控的異常，導致白血病的發(fā)生。臨床上SIL-TAL1融合基

21、因的檢測可以輔助分型診斷和MR的監(jiān)測。CBFp( Core-b inding factor sub unit beta)基因編碼的蛋白是二聚體核結合轉(zhuǎn)錄因子的beta亞基，屬于PEBP2/CBF專錄因子家族，基因特異性的調(diào)控造 血過程和成骨作用的進行。CBF3蛋白亞基是一個非DNA吉合亞基，它通過別構 作用增強DNA和alpha亞基的結合，并使結合后的復合物結合到多種增強子和啟 動子的核心區(qū)。CBF3基因能夠選擇性剪接形成兩種 mRN,每種編碼不同的羧基末端。MYH1基因編碼的myosin-11蛋白是一種平滑肌肌球蛋白，屬于肌球蛋白 重鏈家族，是一個包含 2條重鏈亞基和 2對輕鏈亞基的六聚體蛋

22、白亞基，能夠通過ATP的水解來將化學能量轉(zhuǎn)換為動能。CBF3 -MYH1融合基因是在多為AML-M伴嗜酸性細胞增多癥，但亦可見于其他類型，如M1、M2 M4 M5 M7和慢性髓系白血病(CML)急變，是由inv (16) (p 13;q22)導致16號染色體長臂的核心結合因子(CBF P鏈基因和短臂的MYH1基因發(fā)生融合形成的，見于8-9%的初診AMI患者中。它具有CBF3 -MYH11和MYH11-CBF兩種形式的融合基因，其中前者對 M4E的致病可能具有重要作用。研究顯示CBF3基因的斷裂位點靠近3'端編碼區(qū)的17個氨基酸處，而MYH1基因 的斷裂點存在著至少 3種不同的方式，能形

23、成 10種以上的不同剪接體重排，同時這些重排仍然保持著融合基因轉(zhuǎn)錄本的開放閱讀框，常見的三種剪接體為D型和E型。85%勺CBF3 -MYH1融合基因陽性患者為 A型, D型和E型各占5%CBF3 -MYH1融合基因的產(chǎn)生能夠促進白血病的發(fā)生，但是含有CBF3 -MYH1融合基因的M4E(白血病患者預后較好。研究表明 CBF3 -MYH1融合基因在患者治療緩解后可以消失，所以該基因可以用于 MR的檢測和預后判斷。MLL( Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia)基因編碼轉(zhuǎn)錄共激活物，是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠正調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程，對早期發(fā)育過程的基因

24、表達和造血功能具有不可缺少的作用。雖然M啲功能仍有很多未能研究清楚，但是已有報道表明MLL在發(fā)育過程的細胞分裂中起著核心作用。同時MLL還是HO基因上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，HO基因在造血生成中發(fā)揮關鍵的作用，當MLL蛋白功能異常時，HO基因表達下調(diào)，進而影響正常造血功能?；旌献V系白血病(Mixed Lin eage Leukemia , MLL基因重排發(fā)生在11號染色體2區(qū)3帶，MLL!白包括三個功能區(qū)，分別是轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和DNA結合區(qū)。MLLS因重排使得AT鉤區(qū)和鋅指結構之間的序列發(fā)生斷裂，在 DN/修復時與其他基因發(fā)生融合。mLLS因重排涉及五十余種染色體易位，產(chǎn)生不同的融 合基因，常

25、見的MLLS排形成的融合基因有 MLL-AF4 MLL-AF6 MLL-AF9 MLL-F10MLL-ENL MLL-ELL等。MLL-AF4融合基因由t (4; 11) (q21; q23)易位形成，是前 B-ALL中最為常見的11q23易位，由MLLffiAF4基因融合形成，具有6種不同的剪接體，分別為e9e5、e9e4、e10e5、e10e4、e11e5、e11e4。MLL-AF4融合基因在不同年齡段的發(fā)生率不同，嬰兒ALL中最多見，發(fā)生率為40-60%，在兒童和成人中較低，約為 5%在嬰兒ALL中檢測出MLL-AF4提示預后良好，而相反若在成人 ALL中檢測出MLL-AF4則提示預后較

26、差。在小兒 ALL中出現(xiàn)MLL-AF4時，年齡的不同預后并不一致。MLL-AF6融合基因由t(6;11)(q27;q23)易位形成，主要發(fā)生在 AM的M4和M5s分型中，在兒童AML!者中的比例為2-5%，成人患者中較少出現(xiàn)。 MLL-AF9融合基因由t(9;11)( p22;q23)易位形成，是11q23異常中最常見的易位形式，主要出現(xiàn) 在AM的M5a患者中，在兒童 AML!者中發(fā)生率為8-10%,在成人中為1-2%，總的預后良好，但是患者的年齡等各種指標的差別也決定預后的差異。根據(jù)報道， 含有MLL-AF9的小鼠能夠?qū)е翧M的發(fā)生，但單純的MLLS因異常不會導致白血病發(fā)生，表明ML重排形成

27、融合基因或有伙伴染色體基因的參與是白血病發(fā)生的必需條件。MLL-AF1(融合基因由t(10;11)(p13;q23)易位形成，主要見于兒童AML-M患者中，預后不良，且變異復雜易位更常見。MLL-ELL融合基因由t(11;19)(q23;p13.1)易位形成，在AML患者中的發(fā)生率較低，已有報道顯示其 主要在M5a分型中出現(xiàn)，以成年人為主，預后不良，2年無病生存率50% MLL-ENL融合基因由t(11;19)(q23;p13.3)易位形成的，可見于前 B-ALL、前T-ALL、M4M5 M1 M2多種白血病中，以嬰幼兒患者為主，發(fā)生率較低。因此對ML重排形成的這些融合基因的檢測，對臨床的分型

28、診斷、治療及預后判斷都具有重要價 值。PNT吉構域TEL基因又稱為ETV基因，定位在12號染色體短臂上，能夠編碼 ETS家族轉(zhuǎn)錄因子，編碼的蛋白包含兩個功能結構域：能夠與其他蛋白相結合的 和C末端DNA吉合結構域。對小鼠的TEL基因進行Knockout實驗，研究結果發(fā)現(xiàn)該基因?qū)υ煅芰脱芫W(wǎng)絡發(fā)生的維持必不可少。TEL-AML融合基因是兒童白血病常見的融合基因，由t (12; 21)(P13; q22)易位，導致12號染色體上的TEL基因與21號染色體上的AML基因融合形成，見于25%勺前體B細胞ALL，在兒童的普通ALL中也有較高的表達(1020%，未見于成熟的B-ALL和T-ALL中。T

29、EL 和AML編碼對正常造血功能具有關鍵作用的核酸轉(zhuǎn)錄因子，融合基因的形成擾亂了 TEL的正常功能，并形成轉(zhuǎn)錄抑制子抑制 AML章巴基因的表達，最終導致白血病的發(fā)生。目前已報道的轉(zhuǎn)錄亞型有兩種：較多的是TEL的5號外顯子與 AML的 2號外顯子結合(90%，較少的是TEL的5號外顯子與AML的3號外顯子結合(10%。對于TEL-AML陽性的ALL患者的預后情況現(xiàn)在仍然存有爭議，但是有報道認為TEL-AML融合基因?qū)颊叩?年無病生存率相關，是預后良好的重要指標。因而 臨床中對TEL-AML的檢測，主要用于對輔助 ALL分型，監(jiān)測MR和預后情況。目前，臨床或?qū)嶒炇矣糜诎籽∠嚓P融合基因檢測的方法

30、有多種，常見的 包括如熒光原位雜交（FISH）、巢式RT-PCR實時定量RT-PCR多重RT-PCR寡 核苷酸芯片等。熒光原位雜交（FISH）技術是通過標記熒光素的單鏈 DNA（特異性探針）和與其互補的DNA（標本）雜交，通過熒光信號的數(shù)量和位置反應標本相應特異性基因的情況。用于白血病相關融合基因的檢測中，F(xiàn)ISH定量準確、形象直觀、特異性較強，但是對操作要求較高，成本較高，靈敏度最高達 10-2 ，不能滿足 臨床對于白血病和MR檢測水平的要求，應用受到限制。實時定量 RT-PCR( Real-time reverse transcription quantitative polymerase

31、 chain reaction ）技術檢測白血病融合基因的方法，是在實時定量PCR勺基礎上，增加逆轉(zhuǎn)錄過程，可用來檢測融合基因的mRN水平。實時定量PCR技術是在普通PC反應中加入能與PCF產(chǎn)物結合的熒光探針或 熒光染料，并使它們發(fā)出的熒光信號隨著擴增產(chǎn)物的增加而成比例增長，通過 熒光探測儀實時檢測每一個循環(huán)結束后的熒光強度，通過與標準曲線對比得出定量結果，可以直接檢測目的基因的起始數(shù)量。實時定量PC技術中SYBR Green法和Taqmar探針法兩種最為常用：前者采用 SY BR Green染料來監(jiān)測擴增過程,隨著擴增反應的進行，游離狀態(tài)不發(fā)熒光的SYBR Green染料非特異性結合到DNA

32、雙鏈中產(chǎn)生熒光；后者米用 Taqma探針，該探針能被Taq酶水解，探針的5'端帶有熒光報告基團， 3'端帶有熒光淬滅基團，當兩個基團靠近的時候報告基團不發(fā)出熒光，隨著擴增反應的進行， 5'端的報告基因由于探針被水解而脫離下來而產(chǎn)生熒光。SYBR Greer法價格便宜，能夠和任意的模板引物搭配，但容易受到非特異性擴增的影響；Taqma探針法更為準確，但是必須設計特異性的探 針與引物模板配合，價格較貴。實時定量RT-PCR技術將逆轉(zhuǎn)錄過程和PCRi程結合起來，無需幵蓋，一步法 操作，減少污染機會；操作簡便、特異性強、靈敏度高；擴增過程中閉管操作， 實時數(shù)據(jù)監(jiān)測，降低了污染機

33、會，減少假陽性結果；無需電泳，大大縮短了操 作時間，減少了操作的繁瑣；通過定量內(nèi)參基因來評價操作質(zhì)量，減少了假陰 性結果。該方法成本也較低，適合在臨床應用中開展。巢式RT-PCR!種變異PCR使用兩對PCRH物擴增同一個片段。第一對 PCR引物擴增和普通PCF相似，第二對引物稱為巢式引物，引物它們結合在第一次PCR 產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCRT增片段短于第一次擴增片段。巢式 PCF特異性強,如果第一次擴增出錯，則第二次繼續(xù)進行擴增的概率極低，但是最后的結果需 要用電泳實驗觀察，總體流程繁瑣，無法準確定量檢測白血病融合基因。多重巢式RT-PCR寡核苷酸芯片檢測方法，是在巢式 RT-PCR勺基礎上

34、，在兩輪PCP中都平行設置針對多組融合基因的引物，同時檢測多種融合基因的剪接體，所有基因的第二輪上游引物在合成時用熒光素在5'端進行熒光標記，所有分型探針再3'端進行氨基修士。這樣經(jīng)過多重巢式 PCR 次可以擴增出多種 可能存在的融合基因，再與所有分型探針在芯片上雜交，鑒定具體的融合基因 類型。該方法靈敏度較高，能夠同時檢測多種融合基因，但成本較高，操作較 為復雜。2008年WH關于白血病分型的標準中將 BCR-ABL PML-RARL、AML1-ET融合基因等一些常見的染色體異常歸納入白血病基本診斷標準，更說明了對這些融 合基因的檢測，對于白血病的診斷和治療具有重要的意義：檢

35、測結果不僅可以為白血病診斷分型和預后判斷提供重要依據(jù)，減少人為主觀的判斷，使白血病的診斷分型更加科學化和規(guī)范化，同時也是白血病微小殘留病變（MRD檢測的基礎，對白血病的臨床個性化治療的開展具有重要的推動作用。參考文獻1.J Gabert, E Beillard, VHJ van der Velden, et al. Standardization andquality control studies ofreal -time ' quantitative reversetranscriptase polymerase chain reaction of fusion gene tran

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