阿維菌素高產(chǎn)菌株的選育I----------薄層分析+液相

1、維晉資訊 生物技術(shù)HlCrrECHNOUDGY¥oL12Z.4；l 百Aiig.XOZ中聞帯的易悅、小片段黑麥棗色庫易位尚無法鑒別。因此改進小 菱及近絳種屬的分帶技術(shù).権高小蚩一黑菱易也基鑒定的稍確 性'是士幷龍啜的。一種可能的方祛是對小疑一黑菱易位系進行 £7帶和GW處理、盡管小麥集色體上不屈示(；一分帶帶 紋，但黒麥染色佯卻顯示豐富的G帶國.這有可陡不助干識別愷 番燼津邑體上的黑麥架芭體片段口L JGlII B SfB Friebc, & T R.PEjido <andard Laracitypoe end nan&KlBiure ayid

2、rTn ftr doBCripticri of dnvnQKme hande and rtiudtuna) Mjmdikn in what ( THiicum.«5tMtfn)D J .GtfKHie. 1991 g 妙-抄.(2) H&fp W J,B FntLe aid Q S GH”悶彌沁di pnJc- linre <£ iht ncTdendaiim：rritfiqn </ lhed wheat r THajm astdjtvm L. “ itA vela-GmDi.WbAt Irf. S«w1995+Sl：5O-35,3 Sc, A

3、 G.C - LwlnJ diKTTKWTtKS m wiiert Ard tritjcale_ 一Thear *Appl. Genet.1«2, ©：, b阿少斌矗船轉(zhuǎn)建東.等一用O帶袪術(shù)識別小麥21對抵色體尺礙色 徐結(jié)構(gòu)變舁【“遽慢學(xué)報泗.16(6)訶154/余朗文.采運淳劉匪華，驕麥抉色體的ASGitC帶分帶兒麥推作 翰孝報.20003X 3* 17 -尬阿維菌素高產(chǎn)菌株的選育I聞渚林,何漢洲桀麗麗(沈陽藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院微生物我研室,遼寧沈陽H0016)搞養(yǎng)：目的全面了解阿維菌產(chǎn)牛菌S.侃E蟲的生氏特性并獲得阿維菌索的閒產(chǎn)菌株。方法:収& 5敕也為出發(fā)菌株

4、*考 察該菌株的苗落特征和發(fā)酵特性*分別利用齋外線UV、亞硝酸(HNQ)及亞硝勒11(盹)并結(jié)合L-異亮氨酸(L-De)誘導(dǎo)等手段對出 發(fā)菌株YM進獰誘變處理°結(jié)果:獲得髙產(chǎn)阿維菌素變異株曲，發(fā)酵單位達到852加弧 結(jié)論:與出發(fā)菌株相比.突變株阿維菌素的 產(chǎn)量穢定、發(fā)靜單悅提高了 10IWU上。關(guān)鏈詞:回維璉毒苗,阿堆菌素;發(fā)酵;誘變;鑿種選育宙曲井攤號：QM4丈耒搖號：KW-JnX(X(EXM-Q0l6-<J2Screen!昭 of high avermectin produdng strains from S * avermiiilis Y20YAN Hao - liiif

5、 HE Han - zhou, LIANG Lj - li(Brunch rf Micnxjfiiam,SdiincJ d FhAmuL'njbeal EnnccrinSwrv* Huanuceutkvl OivenMtj' h9iffjymg 110016) AbstractStudy the charnriEristics cf S. auerTniiUis Y20 and cbtain high as-Enwctui jmebcin strairesMethod:The lypw cf colony and 丘” mcmkn gpacn twjtc shufied wik

6、h usingS. auErmiaLs Y20 as orinal train,TVie nulxsus melhodB art ustr UV + HNQ)and NTG to trea S. aver- rrutilii Y2D und using L- Dt aj inducer. Rcsuttilhe high avermectin ynckjcing strain H336 wilh ttvameetin Ut«-呼 to 852 pg/niL was obtained. QwJu» dfio/nie imLant ffarrmtatitn jmiueb ace

7、j Key 'wtmh： S.；avfiTnectin; fwTwntaticn: muLtacntsj i» Kmcnin阿維菌索(山g伽是由日舉北里研死所新黃閔Merk公 司井同研制開發(fā)的一種抗蟲抗生素"該抗生素廉于聚酮類化合 物共由8個繩分組咸分別被命名為Ala.Alb.AZa.A-,Bia.R2a. 臣虬這些化合物的斟結(jié)構(gòu)為16元大環(huán)內(nèi)酣。阿維兩素的產(chǎn)生 菌為軸如呻皿卻4該苗株是種從土壌分離得到的鏈霉 菌【 阿維窗素幾乎殺甬抗菌活性.但具備較強的抗蟲活性，由 于它能有效地跟斷腸逍寄主蟲、媾蟲和一些昆蟲的神經(jīng)帶導(dǎo)憶町 戡認為是種姐右應(yīng)用範途的衣用抗生素。特別屋

8、阿維萌素也 組分的無化還原產(chǎn)物一伊維菌素(iFeedn)貝備更高的殺蟲活 性，已經(jīng)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)殺蟲藥及動物健康保健藥物朗生產(chǎn)上。本 實臉申采用的菌株¥20蘿另一種從土壌申分離得到的橇酶菌、該 菌株產(chǎn)生阿維菌素的產(chǎn)量雖然不哥.但其發(fā)酵產(chǎn)物比敕單一，井 且發(fā)酵剛產(chǎn)物一寡祐索的產(chǎn)量很低，具有較大的幵發(fā)價位。因 此有必養(yǎng)對詼曲株進看全面考察以瓏定合適的發(fā)酵條件井通 過誘變殊選.荻鉗阿維素產(chǎn)最穩(wěn)定的爽變株,全血提高阿維藺索 的發(fā)酵單垃。and lhe dvrmectin jmduct h man than 10 timns compared with ongjt*il 4rt*irtT _ _

9、_上 MATOGRAFHtI£ -】OAT：檢測器為 ST) - 10A. UV - VIS DK11T- TO1L> IWJe I The pruneriiea 吃亍 owffiffitifo V20 coktics *血帥丄 _8m.l uBvij-. ,x »_ iTrt<Tj1 pxrh 嚴 I阿:皿匸冋 jmwfery Ijjx 叭"trty+ +whilK pxkiy type White and spst+ +tnpe二 m+ 二* -iT 7 S rvtnin the brodipH of 旺6- 77- S7-8F* L The It

10、diaL Ec id poiw Ee Y2D by 皿如ioR with HNC1材料與方法l.l菌株;阿維菌嘉產(chǎn)生菌S.歸0土壤分離得到*1.2培養(yǎng)基4斜面及平板固體培養(yǎng)基采用YMS培養(yǎng)基;種子及 發(fā)醉堵養(yǎng)基曠6淀粉50、玉米粉臥酵母粉黃豆講粉10>Ca- CQi2ACoCk00.0000,調(diào)節(jié) pH7.07.213 試刑:亞硝酸(NaNQP為分析純(含筑>沈陽市試劑一廠v亞硝 W(NIC)為分析純(含最>97伽)* Flu如OanJe AU CH -9470 Ruchs.1.4 執(zhí)器主高效液相色譜儀(HHE):為SHBIACZU LIQUID CHRO-收宿曰期誼皿-02

11、-26：修回日SU12002-W-303£全項目:遼寧省岌然科學(xué)博士啟動甚全(2001102010)作者藺介:間帶揪対-)男.遼寧義縣人II戟挖角士.從事故越苗次 級代謝產(chǎn)物生輸會戚的基因調(diào)控他屋 2 The 四utMis nsutts f、aw洶Ms 120 by (ftattm 戦tfi UV,tjns(rrin ,0-250,占-.D,頁 Idhal n*E(転)95<W .agpotato c(%)K46Ucolony hpg diffaftntiBtiorif 鴨. jggy(53)_ wki29) bakKjg) 1 5 誘變方法L5J 紫夕卜線誘變叭制備S.nwr

12、血血 raj菌株的胞子懸賊,用 性理鹽水稀釋至濃度約為1C?牛/mU取5mL于無菌平皿內(nèi)、程波 長勿叫功率30帝的紫外燈下照射。照射后的抱子懸液光培養(yǎng) 2h經(jīng)稀釋后涂于VMS平板*30花培養(yǎng)5d°1.5+2亞硝駿誘變*吸取2.5mL NaNQj于犬試管中，加人5mL抱 于懸戒(誑度約為 W 個/血人立即加人2.5n迅簡權(quán)緩沖粳 ftMnuJpH4.笳.充分混合后.置27*水浴作用到規(guī)定時間，從中 取出2mL,加人至lOnL NajHHX溶液中(0.7"、網(wǎng).於終止反應(yīng)& 終止液經(jīng)稀釋石涂于Y1VE耶板進行培養(yǎng)。1.5.3亞硝筆肌(毗)誘變:用CMrmUpHt的磷酸緩

13、沖蔽制備 抱子懸蔽，控制其誑度約為酹個/mL隨叩加人NTG溶液使 N2誡度達到1.5#汕、處理至規(guī)定時間后+他于用生理鹽水離 心杭様3次*經(jīng)稀端徐于¥MS平板進行培養(yǎng)。1.6站界及檢測方法】.氐1堵養(yǎng)方法I挑取誘變后長出的單繭落接種于YMS斜面. 30兀培養(yǎng)7出刮取抱產(chǎn)接種于K>nL種子培養(yǎng)甚中,30七震繭培養(yǎng) 砸,取】mL種子諸養(yǎng)液接種至50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中遠齪蕩培養(yǎng) 6-70,1.6.2珂維菌素的檢測方法：取SnL發(fā)酵液于離心管中皿/ 仙離心I5min后向菌殘休沉淀中加入2mL丙臨.農(nóng)跡】亦丫加入 3mL乙駿乙暗充分勰躅后3000"咼離心IGrimfK取上層清液進

14、 行薄層層折。ILC 在 DC- Ferbg Plalten Kiesdgel 60 J754 硅板上進 行，展幵刑為環(huán)已烷:舁丙醇= 85：15o層析結(jié)束后+紫外燈下觀與 結(jié)果。高效液桶HHQ分析釆用4反向柱，流動相為甲醇:水二 85：5流速控制在LOrnL/min,檢測波畏為246rnn,根據(jù)各組分的 峰面枳*對照標準曲線計算英含址各姐分之和即為總發(fā)醉氧位" 2結(jié)睪2A 苗落特恥與產(chǎn)抗Ifc力的才祺阿維菌素產(chǎn)主菌的菌落特征很不穗定*在平板培養(yǎng)基上常見 的形態(tài)主要有三種:灰色粉耒世“白色粉末世和光禿利。發(fā)酵站 杲左明:光禿型菌落產(chǎn)生阿維菌素的能力機低，晡體幾乎檢測不 到阿維翹素;庶

15、色粉末型和白色粉末型的菌搏都能產(chǎn)生阿維菊 素其中灰色粉末犁的菌落產(chǎn)阿維菌素的能力翌強于白色粉耒型維晉資訊 第12卷第4期：K72002年呂月Vd.12 .Nd.4J7Aug 2002生物技術(shù)BIOTECHNOUOGY井在含有0,1%L-畀亮-從曲士講變的決色粉末型韻 講突變棟的甫落特硅十分穩(wěn)定T阿 BSWmL.X中BI主盼為 辺卻mL*占總敷 髪耆霰相比，發(fā)酵單位提高了 100倍以上。葡落v在白燃條件下進行分離培養(yǎng)*都能出現(xiàn)這三種類型菊落， 井且它們之間町以相互貞化亠經(jīng)多次傳代培養(yǎng)觀嗾灰色粉末魁 菌蒔星它的主要形態(tài).諫類型的圍搭羽態(tài)相對穩(wěn)定-些。萌落恃 征與產(chǎn)抗關(guān)系見表k莊實驗中以灰色粉末型菌

16、落為主進行發(fā)酵.考察產(chǎn)抗悄況井在 平板培養(yǎng)基上反復(fù)傳代.挑取耶些特征相對穩(wěn)定的萌落作為出發(fā) 菌株迸行下一堆的誘變處理口2.2 誘交軒選高產(chǎn)藥株2 1 | 簫夕儆誘變選取吹色粉末型菌落進行紫外線誘變處理.實驗中發(fā)現(xiàn)諫 菌株對紫外線t分敏感'作用時間超過】曲“后致死率幾乎達到 18%*這與一般鏈超菌的藍貝較大。誘變結(jié)果見我乙斶機目嗦23U個經(jīng)UV誘變的灰色帕末型菌落笈酵側(cè)定阿 維菌索的產(chǎn)畐,發(fā)現(xiàn)這些菌株的產(chǎn)抗能力曾遍提髙亠從中選挑75 個產(chǎn)抗能力強的闊棟進一步發(fā)辱篩選*獲得一菌落特性及盹維菌 為產(chǎn)凰均較曹宦的變舁株HD6.其塩酵單位達加/mL,夕出發(fā) 菌株Y20槽比,產(chǎn)眞提高了 2,1,2

17、亞硝酸誘變出發(fā)菌株經(jīng)亞硝酸醸作用后，統(tǒng)計其致死率及正變率.結(jié)果 見圖LUV誘愛后茯得的變舁棟H136輕亞硝酸】*n誘變處理后. 挑取廉色粉未型苗落發(fā)酵檢測阿維歯素產(chǎn)從78個婕異揀中, 反垠篩選得到一穩(wěn)定的高產(chǎn)褰變棟也箔.阿維菌素總發(fā)酵熬位這 到412/mI,其中BI主榊產(chǎn)量較爲達ltJ7pg/mU 2.2.35E硝基孤（阿誘變將H236突變株用NTC牡理，二-:一匸一-%）的平板I決一步連城篩選。從100 T 落中最終篩選到叱突變酣 堆韻累發(fā)酵單位達列一-價的25%o與原始出發(fā)3討論3,1阿雉菌素產(chǎn)生菌的萌落特性不穩(wěn)定，無論是在自然條件下還 是在誘變處理后都會出現(xiàn)閑落形蠱的分化。從統(tǒng)計結(jié)杲看.

18、誘變 虻理后分化得吃明顯，井且英類電也世為毘雜*有些菌落的表血出現(xiàn)裂痕 血仍以荻色粉末型為主+該類型曲落的嚴抗能力最強。 囚此*要慰使阿維苗索的產(chǎn)量鶴定，必須獲得遺傳特性穩(wěn)毎的疑 色粉末型菊落a3.2誘變劑的種類對誘變結(jié)果的崟響租大°從致死率看 河鏈霉菌對蘇夕傲最敏感*其次是亞硝戲最厲是亞硝 基肌。從誘變后的正變率看;亞硝戲的效杲盤好*亞硝基皿和薪 外線次之。在以話對該菌株的誘變中*要盡量使用亞硝酸作為誘33卷對誘變后的高產(chǎn)菌落篩選中.使用了含有L異亮氮酸L -U吵的平板培養(yǎng)埜"因為阿維菌素e主份分子結(jié)枸中C25何的 空丁基來自h-異亮氨酸匕主份分子結(jié)構(gòu)申相應(yīng)部位的舁丙基

19、是來自L-嫌靈酸(L-W1)叫 因此"用L-嫌氨酸誘異可提高變 舁株產(chǎn)生有效主恃Bia的能力“參灣文獻：1 Tkb R Wh 師咗 B MP Ddwr E E. Awnnn4irw+ new ly t£ putflr* an- thelni時ic 硒pnibing opwiiwn aid fcxmMldtkn J I. AirtiiBiaTjbtal Afl OKfn)d»r J?79 %361 3%.2 Araia J PPtiii K 虬曲m P S- EkpfiMian irf « Mfjvaied chloridecurnr* in Xbijus

20、 axytfi injected with CaaKrhaMitis 呦賈vu RNA： widwer fcr nudulfiikH by HMermectijil J. Vfal Hr*n Resf L9®+15:339-34fi.3J Aw* J P, Iju K K, Pamss P 5,He nsdiMitKnJ *v«ftieciuiH itiCnmirhabliilii fgrms : CtBiHMian btfVffiffi activOtkn M gfilVTiflle - wroitivE chloride curmn hTTrrdjrin bindir*

21、Z Hnlnpcsl ACttvity. J xj Ihkndbai , 19581:236 2>-Der4e GpAwdzi K. Itarm: J .A oimunity Irul r£ iznectui in the cniMxxf” 如 Z d feubaYkJ /lhM)kd Medkne nl檔,140:375 -3£.jjlkuk Hh ElouJU Ht Onita S. n*dvmo« <j fucose gahnliva in *vctnxxin piududtkn by StrtpKtncs, AcWiiiJviuUllI A4

22、OmmlSia' 1988b32；2K2-2M金志華金T宋友禮Alumin產(chǎn)生鑿異亮槪Itt誘導(dǎo)變種的送育 中國抗生素奈志,197.22(2)；84-86宋淵曹貴明'陳芝.阿維苗烹商產(chǎn)菌株的選育及阿堆菌索Al的鑒定.生物工程學(xué)報,200046(1):31-35,OcclIb HtQnjia S Awntnctin biwynihoi*Jj. Cbcndcaf ftwiews. LW7,77 (7)i2Sl-2&»內(nèi)切0 - 1 *3 -葡聚糖酶產(chǎn)生菌的分離篩選與鑒定張作明，張瀬，陳衛(wèi)為蒙翳礬器豔嚮豔貯£蠶(江南大學(xué)食品學(xué)院.江蘇無214006)摘要:

23、以茯苓多糖為碳源*以藍色茯苓多糖為內(nèi)m-i(3-葡聚糖酶活力働定底物. 糖酶活力粒高的菌株，經(jīng)TIjC分折酶解產(chǎn)物表明玻中二株的酶解產(chǎn)物主要為二輔、三糖 申 擁內(nèi)切酶活力最高0.73 gml)的菌株經(jīng)鑒宦為生抱噬胞菌(沖如曾人關(guān)鍵詞;內(nèi)切 吐1-葡聚潮齡篩選;藍色橫苓累糖;生翹糜菌扁；鑒圮中圖分矣Q656 2 文宦標課碼：乳 丈章騙號：10311X(3032)01-0017-OflIsolation t screening and identification of mkroorgnismsproducing endo - 1 山一卩一毋ucanaseZHANG Zuo - ruing, ZH

24、ANG Mao, CHEN Wei妙Z & Food. SdenoE mi Ihimdqgy. Scufhexn Yar護e Utivmity Wd 214Q36rOima)Abstractpachyman 豳 carbon soume and blue - pachinan os siibstrate & saying the mdb 一 owftte activity, jbur HMOwrganism producing Entk- jS - L3 - glucanafie wre iwlaied &om cvmd Msnplw-llJC un曲為 of hydr

25、oly produds uxlicaied thai thw of them pnidiLe Ianumrib«jBe + LarmHBritrkjge ard lamlnariietra»e. and the other pcudkice LaminaribkMsCr The strain« i*iddh hffi«xfo - erayme activityOTS Uml whs id«ti-fied as a. msihfr of lhe 護ms of 傘勸巧"tq丹摩i«Kfy wwxls ：end-卩-1*3 g ucimtiw; wnri; blue pEtdiymaruIW對集色底物的作用.而不影響內(nèi)切酶的活力.因此可處用探合 酶液與染色底物進行反應(yīng)，根據(jù)水解岀的除料濃度璉量測宦內(nèi)切 胸的活力。本拭驗采用藍色茯苓多橢作為內(nèi)切稱活力分析底物. 從無痢地區(qū)采集的35亍土樣或水樣中篩選到幾採產(chǎn)內(nèi)切胸的細 菌*并對其中內(nèi)切酶活力最高的一株細葡進行了初涉鑒定。1材料與方法1J 材料:茯苓遛糖，從茯苓菌檯中提