miRNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)及與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展

1、 miRNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)及與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展The Research Progress of miRNA experimental technique and carcinoma 摘要 miRNA是一類新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非蛋白編碼的單鏈小分子RNA，長(zhǎng)度約為20-25 nt，廣泛存在于真核生物中。在人類已發(fā)現(xiàn)的300多個(gè)miRNA中有許多與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系，研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段和生物信息學(xué)方法研究了一些miRNA與腫瘤的關(guān)系，以期望尋找到治療腫瘤的新方法。 關(guān)鍵詞：miRNA；腫瘤； miRNA抑制；miRNA過(guò)表達(dá)；生物信息學(xué)1.miRNA概述miRNA是一類新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非蛋白編碼的單

2、鏈小分子RNA，長(zhǎng)度約為20-25 nt，廣泛存在于真核生物中，進(jìn)化上相對(duì)保守，具有時(shí)序性和組織特異性。1993年 Lee等1在對(duì)秀麗新小桿線蟲(chóng)（C-elegans）進(jìn)行突變體的遺傳分析中首次發(fā)現(xiàn)非編碼蛋白質(zhì)能時(shí)序調(diào)控其胚胎后期發(fā)育基因表達(dá)的RNA：Lin-4。2000年Reinhart 2在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了另一種重要的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用的miRNA：let-7,從而拉開(kāi)了miRNA的研究序幕。成熟的miRNA在5端有-HP04基團(tuán)，3端具有-OH基團(tuán)，二者可以和上游或下游的序列不完全配對(duì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其轉(zhuǎn)錄獨(dú)立于其他基因，本身不具有開(kāi)放閱讀框架，不編碼任何蛋白質(zhì)。miRNA通常是由RNA聚合酶轉(zhuǎn)

3、錄，最初產(chǎn)物為前miRNA(pri-miRNA)的大前體分子，在胞核內(nèi)被處理成約70個(gè)核苷酸的前miRNA(pre-miRNA)，輸送到胞質(zhì)后被剪切產(chǎn)生2225個(gè)核苷酸的雙鏈miRNA，雙鏈miRNA很快被整合到miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體中，其中一條miRNA鏈被解旋酶所降解，另一條成熟miRNA以單鏈形式存在，保留下來(lái)的miRNA具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的功能。但現(xiàn)在有研究發(fā)現(xiàn)兩條miRNA均有可能保留下來(lái)，但作用點(diǎn)有區(qū)別3。就目前研究成果所知的miRNA作用機(jī)理主要是指miRNA的2-8nt的序列可與靶基因3UTR序列配對(duì)，從而抑制基因的表達(dá)，影響蛋白表達(dá)水平。據(jù)推測(cè)，miRNA可能調(diào)控著人體基因

4、組1/3以上基因表達(dá)。 2.miRNA功能研究方法研究表明，miRNA在發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡、脂類代謝、激素分泌及腫瘤發(fā)生等多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。針對(duì)miRNA的研究方法主要包括兩大類：一是以傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法為基礎(chǔ)建立起來(lái)的miRNA特有的技術(shù)方法，二是已成熟應(yīng)用的生物信息學(xué)技術(shù)。前者側(cè)重于miRNA表達(dá)的檢測(cè)和功能機(jī)制的闡明，后者則包括新miRNA基因及miRNA靶基因的預(yù)測(cè)。在miRNA研究的初期,生物信息學(xué)方法發(fā)揮了非常重要的作用,Ambros 等通過(guò)編寫(xiě)相關(guān)程序及同源比對(duì)從包括人和小鼠在內(nèi)的多種生物中，預(yù)測(cè)了大量miRNA分子，并在之后的實(shí)驗(yàn)研究中得到驗(yàn)證。從此，生物信息學(xué)

5、方法廣泛應(yīng)用于從線蟲(chóng)到果蠅、小鼠、大鼠、雞、人等多種動(dòng)物和植物的miRNA分子預(yù)測(cè)和鑒定4 。而由傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳Northern 雜交發(fā)展而來(lái)的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)Northern 雜交則是鑒定新miRNA分子和獲得miRNA表達(dá)證據(jù)的通用關(guān)鍵技術(shù)。2.1.miRNA的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法具體而言，無(wú)論miRNA在某種腫瘤細(xì)胞中起到何種作用，首先要探測(cè)到該miRNA的存在，傳統(tǒng)的方法是northern blot，隨后發(fā)展的有實(shí)時(shí)定量PCR等，確認(rèn)某種miRNA后，要研究其是扮演促進(jìn)或抑制的角色就需要運(yùn)用miRNA的抑制和過(guò)表達(dá)技術(shù)。2.1.1.miRNA抑制 目前,主要有兩種方法可以阻斷

6、miRNA的作用：一是敲除miRNA基因或其在靶基因上的結(jié)合位點(diǎn)；二是miRNA的序列特異性抑制。然而,由于分子大小的限制,miRNA基因直接敲除的方法并不實(shí)用。 所以,研究者多使用2-氧甲基化修飾的反義寡核苷酸抑制劑來(lái)阻斷miRNA的作用5。這種抑制劑是體外化學(xué)合成,能與特異性miRNA完全互補(bǔ)的反義RNA ,其核糖2-氧的甲基化修飾能保證反義RNA 分子在體內(nèi)的穩(wěn)定性，在借助轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)入目的細(xì)胞后,能快速并穩(wěn)定地與內(nèi)源性成熟miRNA分子互補(bǔ)結(jié)合,從而阻止了內(nèi)源性miRNA分子與靶基因配對(duì)。該類抑制劑的轉(zhuǎn)染試劑以Ambion 公司的NeoFXTM為代表。目前,這類抑制劑的應(yīng)用僅限于體外培養(yǎng)

7、的細(xì)胞,還不能在動(dòng)物體內(nèi)使用。現(xiàn)在,化學(xué)合成的2- 氧甲基化修飾的寡核苷酸分子可帶有一個(gè)3端的氨基接頭,用于與非核苷酸分子(例如:生物素等) 的連接。這種與標(biāo)記物相連的寡核苷酸也可用于miRNA的檢測(cè),并可用于與miRNA作用的細(xì)胞因子的分離。有研究表明，在黑色素細(xì)胞瘤中特異性miRNA-26a抑制劑能夠增加SODD的表達(dá)，miRNA-26a有可能成為轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療靶標(biāo)6。2.1.2. miRNA過(guò)表達(dá)與常規(guī)miRNA的功能研究相似，miRNA的過(guò)表達(dá)研究也是研究miRNA功能的一種主要方式?？梢酝ㄟ^(guò)構(gòu)建miRNA表達(dá)載體，或體外直接合成miRNA前體，轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞兩種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)7。前者

8、由于可獲得穩(wěn)定的過(guò)表達(dá)細(xì)胞株而應(yīng)用較為普遍。在前一種方式中，通常先從基因組中擴(kuò)增miRNA基因及其旁側(cè)序列，然后將其克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒載體，最后感染目的細(xì)胞觀察功能效應(yīng)。Bartel等通過(guò)該方法首次發(fā)現(xiàn)了miR-223、miR-181、miR-142 在小鼠造血分化過(guò)程中起重要調(diào)控作用，F(xiàn)azi 等也運(yùn)用該方法并結(jié)合其它技術(shù)深入地闡明了miR-223 如何通過(guò)抑制其靶基因NFI2A 來(lái)調(diào)控人粒細(xì)胞分化。這一方法也成功用于多個(gè)其它小RNA 功能的的研究。以上為最常見(jiàn)的研究miRNA的實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)，除此還有基因芯片、鎖定的核苷酸原位雜交等方法。不管是何種方法，都在miRNA的研究中發(fā)揮了重要

9、的作用。2.2.miRNA的生物信息學(xué)方法生物信息學(xué)為miRNA研究提供了有益的線索,可以指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。目前,生物信息學(xué)在miRNA研究中的應(yīng)用,主要集中在miRNA基因和miRNA靶基因的預(yù)測(cè)兩個(gè)方面。2.2.1.miRNA基因預(yù)測(cè) 雖然分子克隆仍是搜尋miRNA的有效方法，但由于miRNA自身的一些限制，如較短的序列結(jié)構(gòu)、某些miRNA只在特定組織和發(fā)育階段表達(dá)等，使這些miRNA很難通過(guò)傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法得到鑒定。隨著人們對(duì)miRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及進(jìn)化特征等有了越來(lái)越多的了解，通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)已成為尋找新的miRNA的重要手段。目前，已有很多專門(mén)的miRNA基因預(yù)測(cè)程序發(fā)布，大部分的軟件

10、預(yù)測(cè)都主要依據(jù)miRNA在進(jìn)化過(guò)程中的保守性以及其莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體特征來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)?，F(xiàn)在常用的預(yù)測(cè)軟件包括miRscan，miRseeker，smaloop。Lai等使用miRseeker 軟件在果蠅中預(yù)測(cè)出48個(gè)候選miRNA 基因, 其中20個(gè)已被實(shí)驗(yàn)確證。 Lim等8使用miRscan 軟件，分別在線蟲(chóng)和人中鑒定了30個(gè)和38個(gè)新的miRNA 基因。MirScan 采用了一種獨(dú)特的算法，即首先通過(guò)RNAfold 軟件在廣闊的基因組范圍尋找保守的并且可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，這些搜尋結(jié)果均被作為候選miRNA前體，然后再根據(jù)與已知miRNA的相似性比較，在候選前體中進(jìn)行評(píng)分，得分超過(guò)某一設(shè)定域值

11、者就為候選的miRNA基因。利用miRscan推測(cè)在線蟲(chóng)基因組中miRNA的數(shù)目約為120個(gè)左右。miRscan也被用來(lái)推測(cè)其他一些物種，估計(jì)在不同物種中的miRNA約占基因總數(shù)的1%左右。2.2.2.miRNA靶基因預(yù)測(cè) 與新的miRNA的頻頻發(fā)現(xiàn)相比，miRNA的功能研究相對(duì)較緩慢。其中重要的原因是miRNA的作用靶標(biāo)難以確定。傳統(tǒng)方法尋找miRNA靶基因目標(biāo)不明確，效率低下，且非常耗時(shí)。而高通量篩選方法比較復(fù)雜，并且價(jià)格昂貴，因此利用生物信息學(xué)方法搜尋miRNA靶基因成為較理想的途徑。與miRNA 基因預(yù)測(cè)相比，靶基因的預(yù)測(cè)具有更大的難度。因?yàn)槟壳耙阎膍iRNA靶基因數(shù)量非常有限,不能

12、為預(yù)測(cè)提供充足的依據(jù),而且對(duì)預(yù)測(cè)的候選基因的鑒定步驟相對(duì)繁瑣，很難實(shí)現(xiàn)高通量和規(guī)?；Ｗ詮?003 年第1個(gè)miRNA 靶基因預(yù)測(cè)軟件問(wèn)世以來(lái)，至今已有數(shù)十種專業(yè)軟件被用來(lái)預(yù)測(cè)miRNA 靶基因。這些軟件的計(jì)算法則通常是：（1)種子序列(miRNA 5'端2 8nt) 和靶基因3 'UTR區(qū)之間的互補(bǔ)程度；（2)miRNA_靶基因二聚體的自由能大小, 即熱力學(xué)穩(wěn)定性；(3)靶基因非翻譯區(qū)序列跨物種的保守性等。目前常用的預(yù)測(cè)軟件有TargetScan、miRanda、DIANA-MicroT、PicTar、RNA22及FindTarr等，但是各種軟件均有其利弊，許多研究者綜合利用

13、以上軟件，將數(shù)據(jù)結(jié)果取并集或交集，從而獲得更精準(zhǔn)的數(shù)據(jù)。對(duì)于生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)的靶標(biāo)基因，需再借助熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)、miRNA獲得或缺失性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)。3.miRNA與腫瘤的關(guān)系 研究發(fā)現(xiàn)miRNA在細(xì)胞循環(huán)調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞增殖，有實(shí)驗(yàn)證明miRNA 是細(xì)胞分化作用的調(diào)節(jié)器。如在斑馬魚(yú)生長(zhǎng)初期，細(xì)胞未出現(xiàn)分化，大部分miRNA 不表達(dá),而到了生長(zhǎng)后期，大多數(shù)細(xì)胞種類都出現(xiàn)時(shí)，miRNA 會(huì)出現(xiàn)組織特異性表達(dá)9。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，miRNA 同樣發(fā)揮著重要作用。Liu 等10在對(duì)結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)在體外恢復(fù)結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR-195 的表達(dá)能促進(jìn)腫

14、瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生長(zhǎng)，可以將miR-195 作為結(jié)直腸癌的腫瘤抑制基因。在miRNA與細(xì)胞增殖的關(guān)系中，Lee 等11發(fā)現(xiàn)miR-373 在食管癌病理組織中過(guò)量表達(dá)促進(jìn)食管癌細(xì)胞增殖。miR-373 表達(dá)的靶向蛋白為L(zhǎng)ATS2，它們之間為負(fù)向調(diào)節(jié)關(guān)系。失調(diào)的miR-373 表達(dá)導(dǎo)致LATS2 蛋白的表達(dá)失調(diào)，進(jìn)而出現(xiàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)失調(diào)，最終導(dǎo)致食管腫瘤的發(fā)生。目前已經(jīng)識(shí)別和鑒定的人類miRNA序列有321個(gè)，其中234個(gè)被實(shí)驗(yàn)證實(shí)12。研究表明多數(shù)miRNA定位在與腫瘤相關(guān)的染色體部位，miRNA的異常表達(dá)與特定腫瘤有關(guān)，可以調(diào)控重要的腫瘤相關(guān)基因，參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲或血管形成等過(guò)程

15、。這些跡象表明，miRNA在人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。Calin等13對(duì)已知和預(yù)測(cè)的186個(gè)人類miRNA在染色體上的定位與腫瘤的關(guān)系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上的miRNAs定位于與腫瘤發(fā)生相關(guān)的染色體區(qū)域和脆性位點(diǎn)，如雜合性缺失區(qū)(LOH)、純合性缺失區(qū)(HD)、擴(kuò)增區(qū)、斷裂點(diǎn)區(qū)、靠近癌基因或抑癌基因的部位。以下為幾種常見(jiàn)的miRNA與腫瘤的關(guān)系進(jìn)行講述。3.1.miR-15和miR-16與腫瘤 Calin14等用定位克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)這兩種miRNA定位于染色體13q14的LEU2區(qū)域內(nèi)。在65的慢性淋巴細(xì)胞白血病(cLL)患者中表達(dá)下降或缺失。miR一15a和miR-16a與Bcl-2

16、含有9bp互補(bǔ)序列，可以抑制BcL-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。miR-15和miR-16丟失導(dǎo)致BcL-2過(guò)表達(dá)是人類cLL發(fā)生的重要機(jī)制。人們推測(cè)，miR-15和miR-16可能成為過(guò)表達(dá)BcL-2腫瘤的一種行之有效的“治療藥劑”15。Fabbri 等16更深層次地揭露了miR-15a、miR-16-1 基因簇在cLL中的作用機(jī)制，研究顯示miR-15a、miR-16-1 基因簇的缺失不僅活化了抗凋亡基因Bcl-2 的表達(dá)，而且也上調(diào)了抑癌因子TP53 的表達(dá)，因此在一定程度上減緩了腫瘤生長(zhǎng)。3.2.miR-21與腫瘤 研究表明miR-21定位于染色體17q23.2。miR-21在膠

17、質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平是正常細(xì)胞的5-100倍。早期已有實(shí)驗(yàn)證明miR-21能夠抑制凋亡而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，Corsten MF 等17 發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-21 的表達(dá)升高, 敲除miR-21 能促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 聯(lián)合抑制miR-21 與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體, 可導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白半胱天冬酶活性的提高及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生存能力的顯著降低, 動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該觀點(diǎn), 提示miR-21可作為介入治療的靶標(biāo)。也有研究證明，下調(diào)miR-21抑制EGFR途徑和抑制惡性腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)而不依賴于PTEN基因，提示miR-21可能作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的一種治療靶標(biāo)18。miR-21并不是腦組織特

18、異性的基因，在乳腺癌中也發(fā)現(xiàn)其表達(dá)上調(diào)19,提示miR-21的過(guò)度表達(dá)與乳腺癌患者病情的嚴(yán)重程度及腫瘤的淋巴結(jié)早期轉(zhuǎn)移相關(guān)。Hatley等20進(jìn)一步研究表明，miR-21可不僅通過(guò)抑制程序性細(xì)胞死亡因子4 這一凋亡因子的表達(dá)，也可通過(guò)下調(diào)SPRY2進(jìn)而激活原癌基因Ras下游的MEK/ERK，最終引起miR-21自身轉(zhuǎn)錄從而抑制凋亡，促進(jìn)增殖。3.3.miR-92b與腫瘤 有研究者發(fā)現(xiàn)miR-92b定位于染色體13q31.3。miR-92b能夠抑制PRMT的表達(dá)，一種甲基化轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)而導(dǎo)致一些抗腫瘤基因表觀遺傳學(xué)的改變，從而有利于腫瘤發(fā)生，同時(shí)其在腦腫瘤中的高表達(dá)也暗示其有利于腫瘤的發(fā)生21。N

19、ass等22發(fā)現(xiàn)miRNA-92b在原發(fā)性腦部腫瘤中表達(dá)較高，可以用來(lái)區(qū)分轉(zhuǎn)移性腦腫瘤和原發(fā)灶。Haug等23使用miRNA的靶基因預(yù)測(cè)軟件，發(fā)現(xiàn)一些MYCN基因調(diào)控miRNA可能的靶標(biāo)是miRNA-92b。3.4.miR-155與腫瘤 人們最初發(fā)現(xiàn)，BIC基因與淋巴瘤發(fā)生有關(guān)，之后發(fā)現(xiàn)在C基因保守區(qū)域內(nèi)包含miR-155的miRNA前體。miR-155的表達(dá)水平在Burkitt淋巴瘤中增高約100倍，在霍杰金淋巴瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)水平也顯著增高24。miR-155 由BIC基因編碼，是最早發(fā)現(xiàn)的致癌miRNA之一，最初發(fā)現(xiàn)其在兒童Burkitt' s( 伯基特)淋巴瘤中表

20、達(dá)上調(diào)，在進(jìn)行了miR-155轉(zhuǎn)基因培育的小鼠中miR-155 可以誘導(dǎo)B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生25，目前眾多研究表明其在霍奇金病、cLL、急性髓性白血病、肺癌、乳腺癌以及胰腺癌等腫瘤中均高表達(dá)，且起著致癌基因的作用。機(jī)制研究表明，miR-155 通過(guò)下調(diào)Ship和c/EBP的表達(dá)導(dǎo)致一系列連鎖反應(yīng)，最終導(dǎo)致前B細(xì)胞的蓄積以及急性淋巴細(xì)胞性白血病的形成26 。Rai等27也發(fā)現(xiàn)在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中42種基因的下調(diào)都與miR-155的高表達(dá)相關(guān)，預(yù)測(cè)其中的9個(gè)基因?yàn)閙iR-155的靶基因，這些靶基因中一些涉及到免疫系統(tǒng)和致癌作用。SHIP1就是其中的一個(gè)靶基因，TNF-拮抗劑可以有效的降低miR-

21、155 的表達(dá)，恢復(fù)SHIP1表達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞增殖28。3.5.miR-224與腫瘤有研究對(duì)肝細(xì)胞癌組織和正常組織miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-224在肝癌組織中較正常組織表達(dá)明顯升高。參與調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡、遷移與侵襲等生物學(xué)過(guò)程，對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲力有明顯的促進(jìn)作用，并且發(fā)現(xiàn)miR-224與PAK4和MMP-9等腫瘤遷移侵襲相關(guān)分子的表達(dá)具有明顯的相關(guān)性29。Lee等30發(fā)現(xiàn)miR-224通過(guò)負(fù)性調(diào)控靶基因凋亡抑制劑-5(API-5)的表達(dá)，參與肝癌細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。以上研究表明異常表達(dá)的miR-224可能參與肝癌細(xì)胞的凋亡、增殖等生物學(xué)過(guò)程。從miRNA與腫瘤的關(guān)系

22、中可以看出，miRNA主要扮演了兩種角色：腫瘤促進(jìn)因子和腫瘤抑制因子。目前已知的人類的miRNA有300多條，隨著對(duì)miRNA研究的深入將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的與腫瘤相關(guān)的miRNA，并以此為基礎(chǔ)研究治療腫瘤的新方法。4.總結(jié)與展望隨著對(duì)miRNA實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，會(huì)有越來(lái)越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)，miRNA與腫瘤之間的關(guān)系也會(huì)被進(jìn)一步揭示。miRNA的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和生物信息學(xué)研究將在腫瘤的治療中發(fā)揮不可估量的作用。但是已被證實(shí)的和已明確功能的miRNA 的數(shù)量還是很少。由于miRNA靶基因的多樣性以及研究手段的限制，對(duì)于miRNA作用于腫瘤細(xì)胞的機(jī)制還尚未清楚，還有待進(jìn)一步的研究，但從目前的研究成

23、果來(lái)看，運(yùn)用miRNA治療腫瘤并非是天方夜譚。 參考文獻(xiàn)1.Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encods small RNAs with antisense complementarity to lin-4J.Cell,1993,75:843-854. 2.Reinhart BJ,Slack BJ,Basson M,et a1.The 21 nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans

24、J.Nature,2000,403(6772):901-906.3.Yi R,Poy MN,Stoffel M, et al. A skin microRNA promotes differentiation byrepressing 'stemness'J. Nature,2008,452:225-229.4.Ambros V , Lee R C , Lavanway A , et al . MicroRNAs and other tiny endogenous RNAs in C. elegans J.Curr Biol,2003,13(10):807-818.5. Mei

25、ster G, Landthaler M, Dorsett Y, et al . Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencingJ.RNA,2004,10: 544-550.6.Reuland SN,Smith SM,Bemis LT,et al.MicroRNA-26a Is Strongly Downregulated in Melanoma and Induces Cell Death through Repression of Silencer of Death Domains (SOD

26、D)J.Journal of Investigative Dermatology,2012,doi:10.1038/jid.2012.400.7.Zeng Y, Cai X, Cullen BR,et al.Use of RNA polymerase to transcribe artificial microRNAs J.Methods Enzymol,2005,392:371-380.8.Lim LP , Glasner ME , Yekta S , et al . Vertebrate microRNA genesJ.Science, 2003, 299(5612) :1540。9.Wi

27、enholds E, Kloosterman WP, Miska E,et al.MicroRNA expression in zebrafish embryonic developmentJ.Science, 2005,309(5732):310-311.10.Lin L, Chen L, Xu YX, et al.MicroRNA-195 promotes apoptosis and suppresses tumorigenicity of human colorectal cancer cells J. Biochemical and Biophysical Research Commu

28、nications,2010,400(2): 236-240.11.Lee KH,Goan YG, Hsiao M,et al. MicroRNA-373(miR-373) post-transcriptionally regulates large tumor suppressor,homolog 2 (LATS2) and stimulates proliferation in human esophageal cancerJ. Experimental cell research, 2009,315(15): 2529-2538.12.Cummins JM, He Y, Leary RJ

29、,et al. The colorectal microRNAome J.Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(10):3687-3692.13.Calin GA, Sevignani C, Dumitru CD, et al. Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancersJ. Proc Natl Acad Sci,2004,101(9):2999-3004.14.Calin GA,Dutimru CD,Shmiz

30、iu M,el at.Frequent deletions and down-regulation of micro-RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemiaJ.Proc Natl Acad Sci,2002,99(24):15524-15529.15. Cimmino A,Calin GA，F(xiàn)abbri M，et almiR-15 and miR-16 induce apotosis by targeting BCL2J.Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(39):1394

31、4-13949.16.Fabbri M，Bottoni A，Shimizu M， et al Association of a microRNA/TP53 feedback circuitry with pathogenesis and outcome of B-cell chronic lymphocytic leukemiaJJAMA,2011,305(1):59-6717.Corsten MF,Miranda R, Kasmieh R, et al. MicroRNA-21 Knockdown Disrupts Glioma Growth In vivo and Displays Syn

32、ergistic Cytotoxicity with Neural Precursor CellDelivered S-TRAIL in Human Gliomas J.Can cer Res,2007,67(19) :8994- 9000.18.Zhou X, Ren Y, Moore L, et al.Downregulation of miR-21 inhibits EGFR pathway and suppresses the growth of human glioblastoma cellsindependent of PTEN statusJ.Laboratory Investi

33、gation,2010,90:144155.19.Gee HE,Camps C,Buffa FM,et al. MicroRNA-10b and breast cancer metastasisJ. Nature,2008,455: E8-E9.20.Hatley ME，Patrick DM，Garcia MR,et al Modulation of K-Ras-dependent lung tumorigenesis by MicroRNA-21J.Cancer Cell,2010,18(3):282-29321.Pal S,Baiocchi RA,Byrd JC,et al.Low lev

34、els of miR-92b/96 induce PRMT5 translation and H3R8/H4R3 methylation in mantle cell lymphomaJ.The EMBO Journal ,2007, 26(15):35583569.22.Nass D,Meiri E,Gilad S,et al.MiR-92b and miR-9/9* are specifically expressed in brain primary tumors and can be used to differentiate primary from metastatic brain tumorsJ.Brain Pathol,2009,19(3):375-383. 23.Haug BH,Henriksen JR,Buechner J,et al.MYCN-regulated miRNA-92 inhibits secretion of the tumor suppressor DICKKOPF-3 (DKK3) in neuroblastoma J.Carcinogenesis,2011,32(7):1005-1012.24.Metzler M,Wilda M,Busch K,et al.High ex