分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用工具酶總結(jié)

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常用工具酶總 結(jié)作者:日期:現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)工具酶基因工程：在人工可以控制條件下，將基因剪切或重新組合，再導(dǎo)入另一生 物體內(nèi)，使這些基因在其中表達(dá)并遺傳下去的一門(mén)技術(shù)。核心:對(duì)基因進(jìn)行人工切割、連接和重新組合，構(gòu)建重組D NA。工具酶:在基因工程的重組DNA過(guò)程中，所需要用到的酶的統(tǒng)稱。一、限制性內(nèi)切酶（restri c t ion endonuclease）主要功能：對(duì)外源性的雙鏈D NA進(jìn)行切割、水解，不允許外源性D NA存在 于細(xì)菌自身細(xì)胞內(nèi)。 （這種酶能對(duì)在自身細(xì)胞內(nèi)存在的 DNA種類給予限制一 限制性內(nèi)切酶）限制-修飾系統(tǒng)：合成限制性內(nèi)切酶的細(xì)胞，其自身的D NA

2、不受酶的切割，這 是因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞還會(huì)合成一種修飾酶，可以對(duì)自身DNA進(jìn)行修飾，即改變D NA 原來(lái)具有的可以被限制性內(nèi)切酶識(shí)別的核酸順序結(jié)構(gòu)，從而不被限制性內(nèi)切酶識(shí)別及切割、水解。保護(hù)自身遺傳物質(zhì)穩(wěn)定的機(jī)制。限制性內(nèi)切酶：從原核生物中發(fā)現(xiàn)的，約60 0種，可識(shí)別108種不同的特定 DNA順序。以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產(chǎn)生DNA片段的5'端為 P,3端為-?OH。命名：獲得該酶的細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母（大寫(xiě) ）+該菌種名的前兩個(gè)字母 （小寫(xiě)）+株系的字母（小寫(xiě)）或數(shù)字+羅馬數(shù)字（同一株菌種不同內(nèi)切酶的編號(hào)） 例：細(xì)菌屬名細(xì)菌種名菌株名稱限制酶名稱Arthrob a cterl

3、u t eu sA 1 u IEsch erich i acoliRY13EcoR iB a c i 1 lusamy 1 o 1 iqu e f acie nsHH a mH IHaemop h ilusinflue n zaeRdHind III（一）三種常用內(nèi)切酶1. I型限制性內(nèi)切酶同時(shí)兼有切割DNA的功能和修飾酶的修飾功能。在酶的識(shí)別位點(diǎn)上，若DNA兩條鏈菌沒(méi)有發(fā)生甲基化，則行使內(nèi)切酶的功能 對(duì)DNA進(jìn)行切割，同時(shí)轉(zhuǎn)變成 ATP酶。若DNA雙鏈中有一條鏈已發(fā)生甲基 化，則此類酶顯示修飾酶的作用，對(duì)另一條 DNA進(jìn)行甲基化修飾，然后在行切割 功能。 （實(shí)際上，有內(nèi)切酶、修飾酶、ATP酶

4、及解旋酶四種功能）I型限制性內(nèi)切酶在DNA鏈上的識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，也不固定。 沒(méi)有時(shí)間應(yīng)用價(jià)值。【DNA甲基化：DN A化學(xué)修飾的一種形式，能在不改變 DNA序列的前提下，改 變遺傳表現(xiàn)（外遺傳機(jī)制）。多發(fā)生于CpG二核昔序列上（在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，DN A的CG兩個(gè)核甘酸中的胞喀呢被選擇性添加甲基 ，形成5-甲基胞喀 噬）。甲基化位點(diǎn)可隨DNA的復(fù)制而遺傳（D NA復(fù)制后，甲基化酶可將新和成的未甲基化的位點(diǎn)進(jìn)行甲基化）。 DNA甲基化可引起基因組中相應(yīng)區(qū)域染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，使DNA 失去限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)，以及DNA酶的 敏感位點(diǎn),使染色質(zhì)高度螺旋化，凝縮成團(tuán)，失去轉(zhuǎn)錄活性。】

5、2. III型限制性內(nèi)切酶具有內(nèi)切酶和甲基化修飾酶作用。具有專一的識(shí)別順序，其切割位點(diǎn)在識(shí)別順序旁邊的幾個(gè)核甘酸對(duì)的固定位 置上。（可識(shí)別短的不對(duì)稱序列，切割位點(diǎn)與識(shí)別序列約距2426bp） 3.II型限制性內(nèi)切酶也具有限制-修飾系統(tǒng)，但由限制酶和修飾酶這兩種不同的酶共同來(lái)執(zhí)行 這一系統(tǒng)的功能。即I I型限制性內(nèi)切酶有在識(shí)別位點(diǎn)的切割功能，而不具備甲基 化修飾活性，修飾作用由相應(yīng)的修飾酶完成。兩種酶識(shí)別同一DN A特定序列，卻發(fā)揮不同作用。能識(shí)別雙鏈D NA的特異順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上進(jìn)行切割，產(chǎn) 生特異的DNA片段。II型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)是專一和固定的，對(duì)相同的基因片

6、段的切割，總是得到同樣核甘酸順序的小 DNA片段。這些切割后的不同大小的 DNA片段，可以與統(tǒng)一內(nèi)切酶切割后的來(lái)源不同的其他DN A片段實(shí)行連接，而構(gòu)建重組DNA基因工程技術(shù)的核心II型限制性內(nèi)切酶識(shí)別的專一核甘酸順序，最常見(jiàn)的是4 6個(gè)堿基對(duì)。II型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序（反轉(zhuǎn)重復(fù)順序），具有1800的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性。識(shí)別順序有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝兩個(gè)方面讀序都是 相同的。這類酶切割DN A可有兩種形式。交錯(cuò)切割方式：如:5'YAATTC 3，31- CTCGA G- y3"G AGCTC*-5*每種酶切割后個(gè)產(chǎn)生兩個(gè)DNA片段，每一個(gè)片段個(gè)含有一個(gè)單鏈

7、末端， 單鏈末 端是互補(bǔ)的，可以通過(guò)形成“氫鍵”而黏合。不同來(lái)源的兩條DNA片段經(jīng)同一種酶切割后，產(chǎn)生互補(bǔ)的黏性末端，通過(guò)選 擇合適的DNA鏈接，可將兩條異源性 DNA片段組合在一起。 一一重組DNA 的最基本原理用選擇專一性不同而產(chǎn)生相同黏性末端的兩種酶切割兩條不同的- CTTAAG tEtoR. I |柱 爐鈣±i0t5T-G AATTC-35 CTTAA又如：i51- CTCGAG- 313、G4GCTC 5' DNA片的JI注 4個(gè)加醺蜩的3段,可使重組后的DNA片段不再被原來(lái)的酶所切割如：Sal I酶切割后產(chǎn)生的黏性末端3 cagct , X h oI酶切割后產(chǎn)生的

8、黏性TCGAG-313,YACCTCT» ,既不被S al I酶切割,末端 （:兩者經(jīng)連接酶連接產(chǎn)生的序列 也不被Xho I酶切割。在質(zhì)粒改造上很有用 在同一位置上切割DNW鏈，產(chǎn)生平頭末端。如：TG"C3 3n CCGG 5n,蜂IIW5- GG CC - X3n CC GG 5,（二）其他類型內(nèi)切酶1 .同工酶（B o s c h i zomer）:來(lái)源不同的兩種II型內(nèi)切酶，它們識(shí)別核甘酸 順序及切割位點(diǎn)都相同，差別只在于當(dāng)識(shí)別核甘酸序列中有甲基化的核甘酸時(shí) 一種內(nèi)切酶可以切割，而另一種不能。如：H pa II和Msp I識(shí)別順序者B是 5' -CCGG羽&#

9、39;,若其中有5 甲基胞喀咤，則只有 Msp酶可切割（GGmCC）。2 .Su bset酶： 識(shí)別順序及切割位點(diǎn)相互有關(guān)的酶，互稱 Subset酶。如:Sam I酶所識(shí)別的6個(gè)核甘酸順序中含有Hpa I I酶識(shí)別的4個(gè)核甘酸順序。 所以這兩個(gè)酶可以相互代替使用，它們所切割的DN A片段可以相互連接。3 .可變酶（特殊的）:識(shí)別核甘酸順序一般都大于 6個(gè)，但其中一個(gè)或幾個(gè)核甘酸 時(shí)可以變化的。4 .遠(yuǎn)距離切割酶：識(shí)別核甘酸順序的位置與切割的位點(diǎn)不一致，一般切割位點(diǎn)與指 標(biāo)核甘酸順序的位置之間有1 0個(gè)左右核甘酸的距離。 與I型內(nèi)切酶相似，不 過(guò)I型內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)的距離更遠(yuǎn)一些。（三）

10、甲基化酶（不屬于內(nèi)切酶）使識(shí)別順序中的某個(gè)核甘酸發(fā)生甲基化，保護(hù)DNA不被限制性內(nèi)切酶切:M5C（5-甲基胞喀噬）大多數(shù)以M5CpG的形式存在，即CpG島中的C最容易 是甲基化的底物，而甲基化又與受之調(diào)控的基因的表達(dá)程度有關(guān)。因此 ，研究C pG島的甲基化是研究基因調(diào)控的一個(gè)重要方向。當(dāng)甲基化酶和限制性內(nèi)切酶共同使用時(shí)，常?？梢允褂卸鄠€(gè)識(shí)別位點(diǎn)的內(nèi)切酶只 對(duì)其中一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)有切割效果，其他位點(diǎn)因被甲基化酶修飾而不能被切割。5, C P%CGPu_G3 .如：限制性內(nèi)切酶A v al的識(shí)別順序是'心Py可以是任何一種喀呢，pu可以是任何一種喋吟。因此可以有 4種識(shí)別順序。 如果同時(shí)使用甲

11、基化酶 Ta q I和甲基化酶HpaH,則A v a I的識(shí)別順序?qū)⒅皇?'CC CGAG3'o-AGCTCtLtC AGATTTTtl CUbt A<r*l'2 - TL&AuLTLCCOC?心口.亡了C-4RAtLZL- -43 As I，屬H那步6C5GY WK方FTOG1L0丁中子E司缸由癡¥ r- -Cc-cg i(i*GC TC«K；CGG*C tC&AGATTTTC CCGGCAG-T I-TCCXGCT CCGCCTCWCT CTA.fAGMQC CTC'VCH,附.'"*CCTFGKC

12、CCGC*Ct Cli AG ATI TTCCCGCG AGh -1'1.h-TG*3TCmCr TG"TC T 4"R AGGGCCC TX>，TECH>如上圖，一個(gè)基因片段被 Ava I酶切割時(shí)，片段中有三個(gè) Ava I酶識(shí)別順序，該片段被 切割成4個(gè)片段。 但若先用Ta q I甲基化酶和H paII甲基化酶作用該片段時(shí)，片段中某些核甘酸發(fā)生甲基化修飾而不能被切割，再用Ava I酶切割時(shí)，只能被切割成兩個(gè)片段?！疽患谆笇?duì) DN A的某位點(diǎn)進(jìn)行甲基化修飾 ，進(jìn)而抵御內(nèi)切酶的切割一一構(gòu)建重組質(zhì)?！浚ㄋ模┡c 內(nèi)切酶相關(guān)的幾個(gè)概念1 .酶活性單位及標(biāo)準(zhǔn)反

13、應(yīng)體系酶活性單位：在一定溫度、PH及離子強(qiáng)度下，1h內(nèi)完全酶解（切割）特定 底物DNA,所需限制內(nèi)切酶的量。（底物DNA:多用人噬菌體DNA。又是可以用某一種酶在入噬菌體D NA上的切割位點(diǎn)，來(lái)推算用這種酶切割這種 DNA寸 所需的活性單位。）標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：在5 0 （J反應(yīng)體系及指定溫度下，使用特定的緩沖體系，用1個(gè)活性單位的限制內(nèi)切酶，酶解1解底物DNA反應(yīng)1個(gè)小時(shí)。（若底物比1四多或少，可參照標(biāo)準(zhǔn)體系比例增加或減少酶用量。但增加酶用量時(shí) ，需注 進(jìn)不可加量過(guò)多一一內(nèi)切酶中通常含有甘油防凍劑，加入酶量過(guò)多 ，其中的甘油 會(huì)降低內(nèi)切酶識(shí)別順序的特異性。 也可通過(guò)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間來(lái)保證完全的酶切。

14、） 2.星號(hào)活力限制性內(nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，切割一些與特異性識(shí)別順序相類似的順 序活性（該酶的第二活性）。（產(chǎn)生許多不想得到的片段；內(nèi)切酶的識(shí)別切割能力下降，識(shí)別特異性下降。）引起星號(hào)活力的因素：過(guò)高的甘油含量（ 5%）;低鹽離子強(qiáng)度（25 mmol/L）;高PH伯：（8.0）;含有有機(jī)溶劑；含有非 Mg二價(jià)離子；酶量 過(guò)大（酶解1閨底物D NA用的內(nèi)切酶大于1 00個(gè)活性單位）。3 .限制性內(nèi)切酶底物位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)效應(yīng)限制性內(nèi)切酶對(duì)同一 DN四段切割時(shí)，在對(duì)其可以識(shí)別的位點(diǎn)上表現(xiàn)出不同 的切割速率的現(xiàn)象。4 .限制性內(nèi)切酶質(zhì)量有良好的酶活性；不存在任何其他核酸內(nèi)切酶和外切酶的污染；長(zhǎng)時(shí)間的酶切

15、反應(yīng)不發(fā)生識(shí)別順序特異性的降低；被某一酶切割后的DNA經(jīng)重新連接后，仍能被同一酶再次識(shí)別并再次切割。 內(nèi)切酶質(zhì)量的鑒定：5 0 d反應(yīng)體系中以等量?jī)?nèi)切酶分別以 1h和12h（過(guò)夜）時(shí)間來(lái)切割底物D NA,用凝膠電泳檢查酶切結(jié)果。若不出現(xiàn)條帶數(shù)目的差別，則內(nèi)切酶質(zhì)量好。在T4DNA連接酶作用下，重新連接被內(nèi)切酶切割后的 DNA片段，再用同一 酶切割，若所產(chǎn)生的DNA片段的大小和數(shù)目和第一次切割的結(jié)果完全一樣，則說(shuō)明酶的質(zhì)量好?？设b定是否混有其他內(nèi)切酶和磷酸脂酶（D NA被內(nèi)切酶切割后，只有各個(gè)片段的3OH和5 'P基團(tuán)完好才能再次連接，連接的D NA仍能提供同一酶的相同切割位點(diǎn)，才會(huì)出現(xiàn)

16、上面所說(shuō)的兩個(gè)完全相同的結(jié) 果。）二、DNA重組常用的其他酶類（一）D NA 聚合酶（DN A pol y m era s e）將一個(gè)脫氧三磷酸核甘酸加到引物（primer）的3-OH上，再釋放出一個(gè)焦 磷酸分子（pp i ）。1 . 大腸桿菌 DNA 聚合酶（E c ol i DNApolym c rase ） 聚合酶 I、II > I I i聚合酶I、II主要參與DNA修復(fù)，I II主要參與DNA復(fù)制。三種都有沿模 板按5'令方向合成互補(bǔ)D N A鏈的活性和按3 ' 5'向的外切酶活性。聚合酶I 還有5'令'向的外切酶活性。5' 一 3

17、'聚合酶活性：填補(bǔ) DNA鏈上的缺口，或參與修復(fù)DNA合成過(guò)程中切 除RN用|物后留下的空缺部分。3' -5'外切酶活性：消除在聚合作用中摻入的錯(cuò)誤核甘酸。dANIP dTRIP 心工 Mg'451- CGCAICI5T -CGC5' 一3'外切酶活性：切除受損的DNAB分Mg*5T- CGCATCTAG5， CATCTAG T . dOdP里GCGTAGATt寸- GCGTAGATC -5T 搬照聚合豳IK 1 6 now酶：大腸桿菌DNA聚合酶I（10900O Da）經(jīng)舒替蘭酶（枯草桿菌 蛋白酶）水解獲得的76O00Da片段。具有5'

18、 3 '聚合酶活性和3'5'外切酶活 性?？捎糜谔钛a(bǔ) DNA單鏈末端成為雙鏈?？捎糜诤铣蒫 DNA第二鏈。（若將單核甘酸標(biāo)記放射性核素，則可是合成的DNA雙鏈上帶上放射性核素標(biāo)記?？捎么嗣竿ㄟ^(guò)切口平移來(lái)進(jìn)行探針的放射性核素標(biāo)記 >【切口平移：切口產(chǎn)生3 '羥基和5'磷酸基團(tuán)，DNA延伸合成3 '端，5'端被 小片段降解 缺口位點(diǎn)沿著雙鏈向3 '端移動(dòng)，是在體外向DNA分子引入放射性 標(biāo)記核甘酸的技術(shù)?！慨?dāng)雙鏈DNA分 子的一條鏈上 產(chǎn)生切口時(shí)， E.coli 聚合酶 I就可以將核昔 酸連接到切口 的3' -OH末2

19、.噬菌體DN咪合酶T4 DNA聚合酶，也具有5' -3'聚合酶活性和外挪I活性。外切酶活性比大腸桿菌DN4聚合酶外切酶活性強(qiáng)2 00倍?？捎糜谔结樀姆派湫院怂貥?biāo)記。3 .噬熱水生菌DN A聚合酶從噬熱水生菌Th emus a q u a ti c us YT-1菌株中分離得到。耐熱其中T a q D NA聚合酶使用最多。7075 C生物活性最高。在7 5 80C條件下，每個(gè)酶蛋白分子每秒可以延長(zhǎng)15 0個(gè)核甘酸一一被廣泛應(yīng)用于體外擴(kuò)增特異性DNAt段的技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PCR（二）RN咪合酶能利用DNA乍為模板，催化四種核糖核甘三磷酸（NTP底物合成RNAI I:核仁中，轉(zhuǎn)

20、錄r RNA順序II：細(xì)胞質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄大多數(shù)基因（蛋白質(zhì)基因和部分核內(nèi)小RRANA 因），轉(zhuǎn)錄是需要“TATA框（酶開(kāi)始結(jié)合的位置，啟動(dòng)子， 聚合II型轉(zhuǎn)錄單位特有的）。III：細(xì)胞核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄tRNA 5SrRNAS因等少數(shù)幾個(gè)基因。（核質(zhì)：由單一密閉環(huán)狀D NA分子反復(fù)回旋卷曲盤(pán)繞組成的 松散網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。無(wú)核膜、核仁）（三）DN A連接酶一一基因工程比用的工具酶T4 DN A連接酶（T 4 DNA ligas e ）M g 2+依賴性酶催化雙鏈DNA±具有相鄰的3'羥基和5'磷酸末端單鏈缺口的修復(fù)，以 及具有黏性末端或平端的DN4片段的端端連接的酶。DNA1接既可發(fā)生

21、在D NA分子之間，也可發(fā)生在分子內(nèi)部。高濃度的DNA末端有利于分子間連接，低濃度則有利于環(huán)狀DN A分子的形成。DN4連接酶只能連接雙鏈 DNAW不能連接單鏈D NA（四）反轉(zhuǎn)錄酶（逆轉(zhuǎn)錄酶，reve r se tr a n scr i pt a s e）以RNA模板指導(dǎo)三磷酸脫氧核甘酸合成互補(bǔ) DNA（cDNA的酶 需要Mg +、Mn2 +作為輔助因子。1反轉(zhuǎn)果誨S5 CDNA 1反轉(zhuǎn)錄誨、也聚合Bl以RNA為模板時(shí)，在反轉(zhuǎn)錄酶作 用下，先合成單鏈 DNA（ss DNA。再在反轉(zhuǎn)錄酶和DN咪合酶I作 用下，以單鏈DN,模板合成“發(fā) 夾”型的雙鏈DNA（ds DNA）ods eDMA y*V

22、AAA. AVWvMW jF1核酸-sidsDNAVUA.最后在核酸酶S1作用下，切割成 兩條單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶可用來(lái)把任何基因的 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA拷貝，然后可大量擴(kuò) 增插入載體后的DNA。 可用來(lái)標(biāo)記cDNA作為放射性的分子探針。（五）核糖核甘酸A （R Nase A,ri b nucleas e A）核酸內(nèi)切酶。 特異的攻擊RNA上喀呢殘基的3'端，切割與相鄰核甘酸 形成的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生3'-磷酸喀噬核甘酸和以3'磷酸愚'核甘酸結(jié)尾的寡核 甘酸（一類只有2 0個(gè)以下堿基的短鏈核甘酸的總稱。寡核甘酸可以很容易地與它們的互補(bǔ)對(duì)鏈接，所以常用作探針確定

23、DNA或RNA的結(jié)構(gòu)）。高濃度時(shí)，可對(duì)單鏈RNA的任何位點(diǎn)進(jìn)行切割；低濃度時(shí),只切割C和U的位 。一一檢測(cè)寡核甘酸片段中是否含有 C和U。有顯著的細(xì)胞毒性。RNase A可用于檢測(cè)基因突變：利用R NA探針與突變基因形成 RNA-DNA雜 交體時(shí)，突變點(diǎn)處不能產(chǎn)生堿基互補(bǔ)（局部單鏈）這一特點(diǎn)，用RNase A進(jìn)行切割， 切割產(chǎn)物可通過(guò)跑變性膠得到分離，可用放射自顯影等其他方法檢查片段數(shù)目及 大小,從而推知發(fā)生突變的位點(diǎn)。RNA探針可通過(guò)將相應(yīng)的DNA片段克隆至含有S P6或T7啟動(dòng)子的載體中得到。在操作RNA的實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要戴口罩和手套（RNase A存在非常廣泛，人 唾液、汗液中均含有），以避

24、免有RNase的污染，所用的容器及蒸儲(chǔ)水也都必須 經(jīng)去RNase處理?！居肈 E PC處理：0.1?100比例加DEP C ,3 7c 12h,高溫5min 除去DE PC殘留。含Tr i s的溶液不能用0 . 1%DEPC理（DEPC會(huì)和Tri s的氨 基反應(yīng)而降解，失去滅活 RNase的能力），通?？筛挠肈 EP C處理過(guò)的水來(lái)配 DEPC已配好的可用1%DEPCb理（不過(guò)會(huì)有DEPC1留）?！浚┖颂呛怂崦窽1 （RNase T1）核酸內(nèi)切酶。特異地攻擊鳥(niǎo)甘酸 3'側(cè)的磷酸基團(tuán)，切割與其相鄰核甘酸的5' 磷酯鍵，產(chǎn)生3'-磷酸鳥(niǎo)音和以3'磷酸鳥(niǎo)喋吟核甘酸

25、結(jié)尾的寡核甘酸。主要用于RNA測(cè)序和指紋圖譜分析/也可和RNase合用，以除去樣品中RN A;除去DN A-RNA雜交體中雜交體的 RNA區(qū)。（七）核糖核酸酶 H（RNa s e H）核酸內(nèi)切酶。 水解RNA DN A雜交體中的 RNA鏈,產(chǎn)生5'-磷酸寡核 甘酸和5'磷酸核糖核甘。J使RNA被切割后成為DNA聚合酶合成第二條cD NA的引物，形成cDN A。（八）脫氧核糖核酸酶 I （ DNase I,de oxyribo n u c 1 ea se I）核酸內(nèi)切酶。M g 2+條件下,隨機(jī)切割單、雙鏈DNA,產(chǎn)生5'磷酸末端的單脫氧核甘酸和 寡脫氧核甘酸。Mn2+存

26、在下能將雙鏈DNA同時(shí)切斷，是DNA片段化。其活性依賴于Ca2+ （輔因子），活化劑：Mg2+,抑制劑:螯合劑（EDTA等）DNas e污染：用具要高溫處理，樣品中加 EDTA,抑制酶活性；或冰水中滅 活。、用途：除去RNA樣品中污染的基因組 DNA;轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后DNA模板的降 解。（九）核酸酶 S1（nuclease S1）內(nèi)切酶（高度單鏈特異）。酶解單鏈D NA、單鏈RNA,產(chǎn)生5'-磷酸的單核 甘酸或寡核甘酸。對(duì)雙鏈 DNA、雙鏈RN A和DN A-RNA雜交體相對(duì)不敏感。需要低水平的Z n 2 +激活，PH4. 0 4. 3 ,抑制劑:螯合劑（EDT A、檸檬酸等卜 磷酸緩沖液、

27、和0.6%左右的SDS溶液。S1核酸酶的水解功能可以作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)，并從單戀部分切 斷核酸分子，且這種單鏈區(qū)可以小刀只有一個(gè)堿基對(duì)的程度。一一去除DNA片段中突出的單鏈末端；切開(kāi)合成 d s DNA時(shí)形成的“發(fā)火”結(jié)構(gòu)。（十）核酸酶Bal 31水解超螺旋DN A成開(kāi)環(huán)狀，進(jìn)而成為線狀DNA。有外切酶活性，在Mg2+、C a2+參與下，能從DN A雙鏈兩端連續(xù)向中間切割水可用于DNA鏈的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)分析（繪制DNA限制圖譜）；縮短 D NA片段。（H一）核酸外切酶（exonuc lease）是具有從DNA分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核甘酸作用的兩種：水解磷酸二酯鍵的5'端生成3'-單核甘酸的酶；水解磷酸二酯 鍵的3'端生成5'-單核甘酸的酶（大腸桿菌核酸外切酶 I、II和I I I）。核酸外切酶II I :從雙鏈DNA3 ' O H逐一降解切除5'單核甘酸。不降解單鏈DW或3'突出的雙鏈DNA具有多種酶活性：對(duì)無(wú)喋吟DNA特異的 核酸內(nèi)切酶活性、3'磷酸酶活性、3'外切酶活性、RNase H活性。核酸