核磁共振波譜應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究進(jìn)展

1、生物物理學(xué)報(bào)第二十三卷第四期二!七年八月ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.23No.4Aug.2007收稿日期:2007-07-16基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30121001,30570361,30670426通訊作者:施蘊(yùn)渝,電話:(05513607464,E-mail :yyshi引言核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR 是指核磁矩不為零的原子核,在外磁場(chǎng)的作用下,核自旋能級(jí)發(fā)生塞曼分裂,共振吸收特定頻率的射頻輻射的物理過(guò)程。自上世紀(jì)40年代開(kāi)始,在過(guò)去的半個(gè)世紀(jì)里,核磁共振已經(jīng)獲得兩次諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)、兩次諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),以及一次諾

2、貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1938年,I.Rabi 用分子束實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在外磁場(chǎng)下的核磁共振現(xiàn)象,他獲得了1944年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。1946年,美國(guó)哈佛大學(xué)的Purcell 和史坦福大學(xué)的Bloch 各自獨(dú)立觀察到固體和液體狀態(tài)下的核磁共振信號(hào),他們獲得了1952年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。19451951年間,化學(xué)位移和自旋耦合相繼發(fā)現(xiàn),NMR 成為解決化學(xué)問(wèn)題的有力工具。1953年,Varian 公司研制成世界上第一臺(tái)商品化NMR 譜儀,1964年超導(dǎo)磁場(chǎng)脈沖傅立葉變換核磁共振譜儀問(wèn)世。為了解決生物大分子譜峰嚴(yán)重堆積的問(wèn)題,1976年,瑞士人R.R.Ernst 提出兩維核磁共振波譜的理論與實(shí)驗(yàn)方法。在此基礎(chǔ)上

3、,80年代初瑞士的K.W üthrich 開(kāi)始將該方法成功應(yīng)用于生物大分子結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)研究。兩人先后獲得1991年和2002年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2003年,Paul C.Lauterbur 和Peter Mansfield 由于核磁成像獲得諾貝爾生理學(xué)醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。X 射線晶體衍射、核磁共振波譜、電鏡三維重構(gòu)是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的三種主要研究方法。至今,核磁共振波譜技術(shù)是能夠在原子分辨率下測(cè)定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的唯一方法1,2。目前在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB 中,用核磁共振方法解出結(jié)構(gòu)的數(shù)目占15%左右。核磁共振波譜技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用,與方法技術(shù)的發(fā)展密不可分。與其它光譜學(xué)方法相比,

4、核磁共振的優(yōu)點(diǎn)是可以探測(cè)到每一個(gè)原子的共振頻率。但是隨著分子量的增大,共振峰數(shù)目增多,分子運(yùn)動(dòng)相關(guān)時(shí)間變長(zhǎng),橫向弛豫時(shí)間變短,由于線寬與橫向弛豫時(shí)間的倒數(shù)成正比,分子量增加,譜峰增寬。這給譜峰認(rèn)證帶來(lái)很大的困難。在過(guò)去的十多年中,核磁共振波譜技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中得到廣泛應(yīng)用,要?dú)w功于高場(chǎng)核磁共振譜儀的出現(xiàn)、各種新的核磁實(shí)驗(yàn)方法的應(yīng)用、分子生物學(xué)的進(jìn)步以及各種新的標(biāo)記方法的產(chǎn)生。上世紀(jì)80年代,使用500MHz 核磁共振譜儀,用同核二維核磁共振測(cè)定的蛋白質(zhì)分子,限于少于100個(gè)氨基酸殘基。80年代后期至90年代初期,使用600MHz 核磁共振譜儀,采取13C 和15N 標(biāo)記,使用異核三共振實(shí)驗(yàn),用

5、三維、四維譜測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),分子量達(dá)到2.5kD ,精度相當(dāng)于2.5埃分辨率的晶體結(jié)構(gòu)。上世紀(jì)90年代末到本世紀(jì)初,高場(chǎng)核磁共振核磁共振波譜應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究進(jìn)展施蘊(yùn)渝,吳季輝(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室,合肥230026摘要:綜述了核磁共振波譜在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的進(jìn)展。在溶液中測(cè)定生物大分子的結(jié)構(gòu),分子大小的限制正被減少,盡管新結(jié)構(gòu)的測(cè)定仍然需要付出比較大的努力。核磁共振是一個(gè)有效的手段,可用于研究在許多細(xì)胞過(guò)程中存在的弱的或者瞬態(tài)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。結(jié)構(gòu)的柔性在蛋白質(zhì)分子功能中起了中心作用。由于最近方法學(xué)的發(fā)展,使NMR 可以表征蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué),從

6、而可以對(duì)分子機(jī)制有新的認(rèn)識(shí)。核磁共振波譜可以在原子分辨率下表征無(wú)序的蛋白質(zhì)系統(tǒng),可以研究折疊路徑。跨膜蛋白在細(xì)胞中起了關(guān)鍵作用,這使它們成為藥物的靶標(biāo)。應(yīng)用液體和固體核磁共振技術(shù)已經(jīng)成功測(cè)定了跨膜蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。關(guān)鍵詞:核磁共振;蛋白質(zhì);蛋白質(zhì)相互作用;蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué);無(wú)序蛋白;跨膜蛋白中圖分類號(hào):Q617第4期核磁共振波譜應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究進(jìn)展譜儀(800MHz、900MHz譜儀出現(xiàn),使用低溫探頭,對(duì)蛋白質(zhì)實(shí)行部分氘標(biāo),對(duì)氨基酸選擇性標(biāo)記(或者片段標(biāo)記,發(fā)展能夠提高分辨率和靈敏度的新的脈沖實(shí)驗(yàn)方法:如TROSY3、CRINEPT4等,另外還發(fā)展了將蛋白質(zhì)放在部分定向的介質(zhì)中從而測(cè)得殘存的偶極

7、-偶極耦合5的方法。這些方法的使用,使得可用核磁共振方法測(cè)定的蛋白質(zhì)的分子量,從理論上將不受限制。目前用核磁共振可以測(cè)量4050kD分子量的蛋白質(zhì),而且這個(gè)限制正被突破,用核磁共振波譜方法測(cè)定結(jié)構(gòu)的最大的單鏈蛋白質(zhì)的分子量已達(dá)到82kD6。2006年, Masatsune Kainosho研究組將每一個(gè)-13C(1H2-單元用-13C(1H,2H-替代,將每一個(gè)-13C(1H3單元用-13C(1H,2H,2H代替,此外將豐富的甲基基團(tuán)用-12C(2H3代替,對(duì)側(cè)鏈環(huán)也采取類似策略,這種優(yōu)化的同位素標(biāo)記方法,簡(jiǎn)化核與核的耦合,大大改進(jìn)了譜的質(zhì)量,使得譜上只保留少數(shù)線寬很窄的信號(hào),為測(cè)定大蛋白質(zhì)的

8、結(jié)構(gòu)開(kāi)辟了新的路徑7。此外,近年來(lái)用液體和固體核磁技術(shù)研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能方面也有不少進(jìn)展8。核磁共振波譜技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中有如下應(yīng)用:1研究生物高分子及其復(fù)合物在溶液中的三維結(jié)構(gòu)和功能;2研究動(dòng)態(tài)的生物大分子之間以及與配基的相互作用;3研究生物大分子的動(dòng)態(tài)行為;4用固體核磁共振或液體核磁共振技術(shù)研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能;5研究蛋白質(zhì)折疊、折疊動(dòng)力學(xué);6用于藥物篩選與設(shè)計(jì);7研究代謝組學(xué);8研究活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。我們將舉例說(shuō)明近年來(lái)核磁共振波譜技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的一些重要進(jìn)展。1用核磁技術(shù)研究大蛋白或復(fù)合物Wüthrich、Horwich及其合作者使用1H-15N

9、 cross-correlated relaxation-induced polarization transfer(CRIPT譜,研究900kDa分子伴侶GroES-GroEL復(fù)合物中二者的相互作用,看到由于結(jié)合GroEL而引起GroES的構(gòu)象變化9。他們還研究了GroEL與底物二氫葉酸還原酶的相互作用,首次觀察到分子伴侶結(jié)合的底物的中間態(tài)10。目前已用核磁共振波譜技術(shù)測(cè)定了723個(gè)殘基(分子量82kD的單鏈蛋白質(zhì)蘋(píng)果酸合成酶(MSG的溶液結(jié)構(gòu)。采用的方法是用15N、13C、2H-標(biāo)記MSG,同時(shí)選擇性質(zhì)子標(biāo)記含有甲基的氨基酸Ile、Leu以及Val,使得它們的甲基質(zhì)子化,作四維TROSY類

10、型的三共振實(shí)驗(yàn)11。盡管目前已經(jīng)用核磁共振方法測(cè)定了不少大的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),但是與X射線衍射相比,核磁共振不僅花費(fèi)更多的時(shí)間、更多的經(jīng)費(fèi),而且不是所有的樣品都適合,所以測(cè)定大的蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu),不是核磁共振波譜的優(yōu)勢(shì)所在。2研究動(dòng)態(tài)的生物大分子之間,以及蛋白質(zhì)與核酸,或與配基的相互作用研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)-核酸,蛋白質(zhì)-配基相互作用十分重要。盡管酵母雙雜交、GST-pull down、免疫共沉淀、表面等離子共振譜、等溫量熱計(jì)、熒光去偏振等實(shí)驗(yàn)可以在離體情況下研究蛋白質(zhì)相互作用,熒光共振能量轉(zhuǎn)移、激光共聚焦顯微鏡等方法可研究活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)相互作用,但是如果需要知道二者相互作用

11、的界面,結(jié)構(gòu)的信息是必不可少的。細(xì)胞中蛋白質(zhì)相互作用是動(dòng)態(tài)的、低親和力的(解離常數(shù)Kd常常大于10-4M,許多復(fù)合物瞬時(shí)存在,不穩(wěn)定。核磁共振波譜技術(shù)特別適合研究瞬時(shí)存在、不穩(wěn)定的復(fù)合物。通過(guò)滴定實(shí)驗(yàn),根據(jù)對(duì)1H-15N HSQC化學(xué)位移的擾動(dòng),可以在接近生理?xiàng)l件下確定蛋白質(zhì)相互作用界面。該方法十分靈敏,Kd為10-2M的非常弱的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用也能被檢測(cè)。兩維核歐沃豪斯效應(yīng)轉(zhuǎn)移譜(TRNOESY是另一種研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì),特別是蛋白質(zhì)與肽相互作用的方法。該方法的缺點(diǎn)是:為了實(shí)現(xiàn)核歐沃豪斯效應(yīng)的有效轉(zhuǎn)移,一般要求蛋白質(zhì)的分子量超過(guò)50kD。近年來(lái)采用融合蛋白的方法,如把麥芽糖結(jié)合蛋白(M

12、BP,42kD與整合素!亞基末端肽融合,用TRNOESY方法研究它與"亞基末端肽之間的弱相互作用。將蛋白質(zhì)放在定向介質(zhì)中,如噬菌體, bicelles,或者聚丙烯酰胺,蛋白質(zhì)會(huì)部分定向。殘存的偶極-偶極相互作用(RDC可以提供生物大分子中某些矢量,如HN-H、C-H,相對(duì)于外磁場(chǎng)的取向,從而可確定復(fù)合物中A、B兩個(gè)蛋白質(zhì)2412007年生物物理學(xué)報(bào)的相對(duì)取向。為結(jié)構(gòu)計(jì)算提供除核歐沃豪斯效應(yīng)增強(qiáng)(NOE外的另一種約束。化學(xué)位移擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)、RDC實(shí)驗(yàn),以及定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn),可以與計(jì)算方法結(jié)合起來(lái)獲得蛋白質(zhì)復(fù)合物的模型12。除上述方法外,為了研究蛋白質(zhì)的功能,人們希望獲得蛋白質(zhì)復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。

13、即便對(duì)X射線晶體衍射而言,獲得弱相互作用的復(fù)合物的晶體也是十分困難的。PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中K d大于10-4M的復(fù)合物十分有限。過(guò)去幾年中,一些Kd為10-4M10-3M的蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)陸續(xù)用NMR方法解出,采用的是半濾波的核歐沃豪斯效應(yīng)譜(half-filtered NOESY。在這些實(shí)驗(yàn)中15N和13C標(biāo)記的蛋白質(zhì)A,與未標(biāo)記的蛋白質(zhì)B混合,或作相反的標(biāo)記。如果蛋白質(zhì)的濃度足夠高,具有高靈敏的核磁硬件條件(高場(chǎng)譜儀,低溫探頭,可以檢測(cè)到分子間的核歐沃豪斯效應(yīng)增強(qiáng)(NOE,從而得到復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。用上述方法近年來(lái)測(cè)定了一批弱相互作用復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)13,14。3蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)蛋白質(zhì)的柔性及運(yùn)動(dòng)性

14、與功能有密切關(guān)系。例如酶的動(dòng)力學(xué)對(duì)于其功能態(tài)的熱力學(xué)穩(wěn)定性及催化功能十分重要。由于蛋白質(zhì)是一個(gè)殘基間相互耦聯(lián)的動(dòng)力學(xué)系統(tǒng),配基結(jié)合將會(huì)引起信號(hào)在蛋白質(zhì)內(nèi)部的傳遞,引起別構(gòu)效應(yīng)。核磁共振特別適合研究蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)。核磁共振研究的時(shí)間尺度可以包括從皮秒到秒的范圍,得到的動(dòng)力學(xué)信息可以特別確定到所研究的基團(tuán)。通過(guò)自旋-晶格弛豫時(shí)間、自旋-自旋弛豫時(shí)間,及NOE的測(cè)量可以獲得皮秒-納秒的動(dòng)力學(xué)信息。近年來(lái)發(fā)展了測(cè)定微秒-毫秒的動(dòng)力學(xué)的方法relaxation dispersion ex-periment1517。所用的實(shí)驗(yàn)方法主要有兩類: Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMGr

15、elaxation dis-persion實(shí)驗(yàn),以及R1!實(shí)驗(yàn)。許多重要的生化事件都是在這一時(shí)間尺度下發(fā)生的。例如,蛋白質(zhì)常會(huì)在兩種構(gòu)象態(tài)A、B間轉(zhuǎn)換。蛋白質(zhì)內(nèi)部的運(yùn)動(dòng)性,對(duì)酶的催化功能具有重要作用。Peter.E. Wright等人研究了二氫葉酸還原酶、底物類似物葉酸,以及氧化態(tài)的NADP+形成的三元復(fù)合物。當(dāng)酶處于基態(tài)時(shí),活性中心loop采取關(guān)閉構(gòu)象;而處于低集居度(4.2%,溫度30的激發(fā)態(tài)時(shí),活性中心loop采取開(kāi)放構(gòu)象。兩態(tài)之間的交換,涉及輔因子尼克酰胺環(huán)進(jìn)出活性中心。該時(shí)間尺度正好與催化過(guò)程結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的時(shí)間過(guò)程一致,說(shuō)明酶的運(yùn)動(dòng)與它的催化功能密切相關(guān)18。最近Sprangers和Ka

16、y報(bào)道了他們用核磁共振技術(shù)研究670kDa的20S蛋白酶體的核心顆粒(CP與一個(gè)11S激活蛋白質(zhì)形成的分子機(jī)器的詳細(xì)的原子運(yùn)動(dòng),使人們了解了蛋白酶體如何將受損傷的、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)清除出去。CP的三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)用X 射線衍射測(cè)定,包括7個(gè)"亞基和7個(gè)#亞基以$7-%7-&7-7的方式堆積形成(桶狀結(jié)構(gòu)。他們使用甲基-TROSY方法,采用高度氘代的樣品,但是其中異亮氨酸、亮氨酸、Val被質(zhì)子化。他們研究了單獨(dú)的亞基、裝配成*環(huán)的+亞基,以及在完整的CP中的,亞基上的異亮氨酸、亮氨酸、Val中100個(gè)甲基的運(yùn)動(dòng),包括皮秒-納秒的側(cè)鏈運(yùn)動(dòng),以及微秒-毫秒的運(yùn)動(dòng),發(fā)現(xiàn)-亞基中有一個(gè)區(qū)域

17、有快速、大幅度的運(yùn)動(dòng),使得CP可以改變它的取向1個(gè)弧度,認(rèn)為這種運(yùn)動(dòng)與將底物輸送到催化的腔中有關(guān)。他們還研究了11S激活蛋白質(zhì)與20S的CP的結(jié)合,確定了結(jié)合界面19。4用固體核磁共振與液體核磁共振技術(shù)研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能膜蛋白在維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、發(fā)揮功能中具有十分重要的作用,許多人類的疾病來(lái)源于膜蛋白的缺失和結(jié)構(gòu)異常。人類基因組計(jì)劃結(jié)果表明翻譯膜蛋白的基因在人類總基因中占有18.3%(11000/ 60000。在制藥公司的藥物靶點(diǎn)蛋白中,超過(guò)60%的小分子藥物化合物的靶點(diǎn)蛋白是膜蛋白。但是,迄今為止,在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中,膜蛋白的結(jié)構(gòu)數(shù)目十分有限。這充分表明膜蛋白結(jié)構(gòu)研究的挑戰(zhàn)性和嚴(yán)峻現(xiàn)實(shí)。

18、核磁共振研究在micelles、bicelles,或者在脂雙層中的膜蛋白,所用的方法包括液體核磁共振方法和固體核磁共振方法8,20。目前已成功地解析了多個(gè)膜蛋白結(jié)構(gòu)。其中外膜蛋白質(zhì)(outer-membrane protein,OmpX;PDB code 1Q9F就是一例21。5蛋白質(zhì)折疊無(wú)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(disordered proteins,包括去折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)、熔融球蛋白、折疊中間態(tài)、變性蛋白質(zhì),還包括內(nèi)源的天然無(wú)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。242第4期核磁共振波譜應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究進(jìn)展這些無(wú)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)對(duì)于了解蛋白質(zhì)的折疊、蛋白質(zhì)的聚合、蛋白質(zhì)的纖維化十分重要。它們與淀粉狀纖維變性病(如Prio

19、n病、帕金森氏病、埃茨海默病等有關(guān)。目前估計(jì)有三分之一的真核生物蛋白質(zhì)含有超過(guò)連續(xù)30個(gè)殘基組成的無(wú)結(jié)構(gòu)的序列。與腫瘤相關(guān)的信號(hào)蛋白質(zhì)這個(gè)比例還要高。一些內(nèi)源性無(wú)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。在蛋白質(zhì)結(jié)合過(guò)程中會(huì)發(fā)生無(wú)序向有序結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換。NMR是少數(shù)幾種能提供無(wú)結(jié)構(gòu)或有部分結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),以及蛋白質(zhì)折疊過(guò)程的多方面信息的方法22。非天然態(tài)蛋白質(zhì)分子的NMR研究對(duì)科學(xué)家們來(lái)說(shuō)是個(gè)挑戰(zhàn)。去折疊和部分折疊的蛋白多肽鏈在多種構(gòu)象之間互相轉(zhuǎn)換,再加上其內(nèi)在的活動(dòng)性,使得化學(xué)位移分散度很差,共振峰的認(rèn)證非常困難。但是,最近在NMR技術(shù)上的進(jìn)展,使去折疊和部分折疊蛋白質(zhì)分子的主鏈共振

20、峰能得到完全的認(rèn)證,進(jìn)而使細(xì)致地了解這些構(gòu)象狀態(tài)的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特征成為可能?？梢愿鶕?jù)所謂的secondary chemical shifts,得到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息。脈沖場(chǎng)梯度核磁擴(kuò)散實(shí)驗(yàn),可以得到平移擴(kuò)散系數(shù),并由此計(jì)算蛋白質(zhì)的流體力學(xué)半徑。由于尋常的NOE效應(yīng)限于5埃范圍,所以在無(wú)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中NOE常常只在殘基內(nèi)部被觀察到。用順磁探針對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記,通過(guò)順磁馳豫增強(qiáng)效應(yīng),可以得到2025!長(zhǎng)程信息。殘存的偶極-偶極相互作用,原理上也可以用于無(wú)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或者部分非折疊態(tài)的蛋白質(zhì),給出主鏈拓?fù)溆杏玫男畔?。運(yùn)用上述方法可以獲得折疊中間態(tài)或熔融球蛋白的結(jié)構(gòu)信息。Peter E.Wright

21、等人最近用多維核磁共振波譜實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的人的CBP的NCBD結(jié)構(gòu)域,盡管含有螺旋但是沒(méi)有穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu),更像熔融球蛋白狀態(tài);單獨(dú)的P160的ACTR結(jié)構(gòu)域也是如此。但是當(dāng)兩者在一起時(shí)可以互相協(xié)同,形成穩(wěn)定的復(fù)合物。說(shuō)明了內(nèi)源無(wú)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)識(shí)別過(guò)程中的功能意義23。將核磁共振方法與快速混合裝置結(jié)合可以研究蛋白質(zhì)折疊路徑。這種實(shí)驗(yàn)被稱為流動(dòng)-淬滅脈沖標(biāo)記的H/D交換實(shí)驗(yàn)(Quench-flow hydrogen-exchange pulse labeling。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí),非折疊蛋白質(zhì)主鏈上所有氨基都被氘代,然后被重溶在復(fù)性緩沖溶液中。蛋白質(zhì)開(kāi)始折疊。處于非折疊狀態(tài)或暴露在溶劑中的氨基質(zhì)

22、子,可以和溶劑質(zhì)子快速地交換;而那些由于形成結(jié)構(gòu)而被保護(hù)起來(lái)的氨基仍處于氘代狀態(tài)。在復(fù)性反應(yīng)開(kāi)始的不同時(shí)間點(diǎn),通過(guò)改變pH值而停止H/D交換,直到蛋白質(zhì)達(dá)到完全復(fù)性。在不同時(shí)間點(diǎn)改變pH值就可以獲得不同部位氨基質(zhì)子氘代的信息,從而可以知道蛋白質(zhì)的折疊路徑24。按照統(tǒng)計(jì)物理學(xué)的觀點(diǎn),處于自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)溶液中,雖然絕大部分蛋白質(zhì)以自然折疊狀態(tài)存在,仍然有很少量的部分折疊狀態(tài)和完全非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)存在。尋常實(shí)驗(yàn)方法難以檢測(cè)到這些部分折疊狀態(tài)和完全非折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)。在遠(yuǎn)低于變性轉(zhuǎn)換區(qū)的溫度或變性劑濃度下進(jìn)行的H/D 交換實(shí)驗(yàn)被稱為自然態(tài)H/D交換實(shí)驗(yàn)(NHX。實(shí)驗(yàn)中以蛋白結(jié)構(gòu)中氨基質(zhì)子和溶劑質(zhì)

23、子的交換為探針,通過(guò)改變?nèi)芤旱沫h(huán)境,如加入少量的變性劑、改變溫度等,非自然態(tài)折疊構(gòu)象的組成比例可以改變。單個(gè)殘基的穩(wěn)定性可以通過(guò)各自氨基質(zhì)子交換的速率以及質(zhì)子交換對(duì)變性劑的敏感程度檢測(cè)出來(lái)。通過(guò)氫鍵打開(kāi)方式以及交換所伴隨的能量變化的不同,也可以得到蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性高低的信息25。除此之外,前述的CPMG實(shí)驗(yàn)也可以檢測(cè)到表觀兩態(tài)折疊的蛋白質(zhì)溶液中,集居度低至1%的非折疊態(tài)26。6結(jié)語(yǔ)綜上所述,核磁共振波譜技術(shù)在生物學(xué)中,特別在結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白質(zhì)科學(xué)研究中有廣泛應(yīng)用。在某些研究領(lǐng)域,它可以起到其它技術(shù)所不可替代的作用。生物核磁共振波譜技術(shù)是交叉學(xué)科,涉及磁共振波譜學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、計(jì)算

24、生物學(xué)等學(xué)科,需要多學(xué)科科研人員的廣泛合作。隨著技術(shù)的發(fā)展,核磁共振波譜技術(shù)在生物學(xué)中的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛。參考文獻(xiàn):1Cavanagh J.Protein NMR spectroscopy:principles and prac-tice.2nd ed.Academic Press,Amsterdam;Boston,2007.pp.,8852Downing AK.Protein NMR techniques.2nd ed.Totowa,NJ:Humana Press,20043Pervushin K,Riek R,Wider G,Wuthrich K.Attenuated T2relaxati

25、on by mutual cancellation of dipole-dipole couplingand chemical shift anisotropy indicates an avenue to NMRstructures of very large biological macromolecules in solu-tion.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:12366123714Riek R,Wider G.,Pervushin K,Wuthrich K.Polarizationtransfer by cross-correlated relaxat

26、ion in solution NMR with2432007年生物物理學(xué)報(bào)very large molecules.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96: 491849235Tjandra N,Bax A.Direct measurement of distances andangles in biomolecules by NMR in a dilute liquid crystalline medium.Science,1997,278:111111146Kay LE.NMR studies of protein structure and dynamics.J

27、Magn Reson,2005,173:1932077Kainosho M,Torizawa T,Iwashita Y,Terauchi T,Mei OnoA,Guntert P.Optimal isotope labelling for NMR protein structure determinations.Nature,2006,440:52578Fiaux J,Bertelsen EB,Horwich AL,Wuthrich K.NMR ana-lysis of a900K GroEL GroES complex.Nature,2002,418: 2072119Opella SJ,Ma

28、rassi FM.Structure determination of membraneproteins by NMR spectroscopy.Chem Rev,2004,104:3587360610Horst R,Bertelsen EB,Fiaux J,Wider G,Horwich AL,Wuthrich K.Direct NMR observation of a substrate protein bound to the chaperonin GroEL.Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102:127481275311Tugarinov V,Choy WY

29、,Orekhov VY,Kay LE.SolutionNMR-derived global fold of a monomeric82-kDa enzyme.Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:62262712Dominguez C,Boelens R,Bonvin AM.HADDOCK:aprotein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information.J Am Chem Soc,2003,125:1731173713Takeuchi K,Wagner G.NMR st

30、udies of protein interactions.Curr Opin Struct Biol,2006,16:10911714Vaynberg J,Qin J.Weak protein-protein interactions asprobed by NMR spectroscopy.Trends Biotechnol,2006,24: 222715Mittermaier A,Kay LE.New tools provide new insights inNMR studies of protein dynamics.Science,2006,312:22422816Palmer A

31、G3rd.NMR characterization of the dynamics ofbiomacromolecules.Chem Rev,2004,104:3623364017Palmer AG3rd,Massi F.Characterization of the dynamics ofbiomacromolecules using rotating-frame spin relaxation NMR spectroscopy.Chem Rev,2006,106:1700171918McElheny D,Schnell JR,Lansing JC,Dyson HJ,Wright PE.De

32、fining the role of active-site loop fluctuations in dihydro-folate reductase catalysis.Proc Natl Acad Sci USA,2005,102: 5032503719Sprangers R,Kay LE.Quantitative dynamics and bindingstudies of the20S proteasome by NMR.Nature,2007,445: 61862220Liang LKTaB.NMR of membrane proteins in solution.Progress in Nucle