植物的功能基因組學研究進展 Progress in Functional Genomics in Plants

1、收稿日期:1999-01-04;修回日期:1999-04-28作者簡介:李子銀(1971-,男,博士生,專業(yè)方向:植物分子遺傳。植物的功能基因組學研究進展李子銀,陳受宜(中國科學院遺傳研究所植物生物技術(shù)開放實驗室,北京100101摘要:基因組研究計劃包括以全基因組測序為目標的結(jié)構(gòu)基因組學和以基因功能鑒定為目標的功能基因組學兩方面的內(nèi)容。目前基因功能鑒定的方法主要有:基因表達的系統(tǒng)分析(SAGE 、cDNA 微陣列、DNA (基因芯片、蛋白組技術(shù)以及基于轉(zhuǎn)座子標簽和T -DNA 標簽的反求遺傳學技術(shù)等。本文對上述各種技術(shù)的優(yōu)缺點以及它們在植物基因功能鑒定中的應用進行了綜述。關(guān)鍵詞:功能基因組學;

2、SAGE;cDNA 微陣列;DNA 芯片;蛋白組;反求遺傳學中圖分類號:Q943文獻標識碼:A文章編號:0253-9772(200001-0057-60Pro g ress in Functional G enomics in PlantsLI Z i 2y in ,CHEN Shou 2y i(Institute o f G enetics ,Chinese Academ y o f Sciences ,Bei j in g ,100101China Abstract :T he g enom e p ro j ects com p rise the structural g enom ic

3、s focusin g on determ inin g the com p lete se q uences of the g enom e and the functional g enom ics focusin g on elucidatin g the biolo g ical function of g enes.T he ra p idl y e 2v olvin g tools for functional g enom ics research include S erial Anal y sis of G ene Ex p ression (SAGE ,cDNA m icr

4、oar 2ra y ,DNA (or g ene chi p s ,p roteom e p ro j ect and the reverse g enetics techni q ue based on the w ell 2established trans 2p oson ta gg in g and T2DNA ta gg in g s y stems.In this p a p er ,the advanta g es and disadvanta g es of such techni q ues and a pp lication of these techni q ues in

5、 p lant functional g enom ics research are review ed and future p ros p ective are also p resented.K e y w ords :Functional g enom ics ;SAGE;cDNA m icroarra y ;DNA chi p s ;Proteom e ;Reverse g enetics以擬南芥和水稻為代表的植物基因組研究已取得了迅速的進展,到目前為止,占擬南芥基因組(100M b 近三分之一的DNA 序列已被測定并在G enBank 數(shù)據(jù)庫中登記注冊,預期到2001年通過全球合作

6、將完成擬南芥全基因組的序列測定工作。隨著植物基因組計劃的實施和進展,G enBank 中累積了大量的未知功能的DNA 序列,如何鑒定出這些基因的功能將成為基因組研究的重點課題,因此,基因組研究應該包括兩方面的內(nèi)容:以全基因組測序為目標的結(jié)構(gòu)基因組學(structural g enom ics 和以基因功能鑒定為目標的功能基因組學(functional g enom ics 研究,后者往往又被稱為后基因組(p ost g enom e 研究。功能基因組研究的內(nèi)容是利用結(jié)構(gòu)基因組所提供的信息,發(fā)展和應用新的實驗手段系統(tǒng)地分析基因的功能1。目前人類和酵母的功能基因組研究已經(jīng)全面展開,尤其是對已完成全

7、基因組測序的酵母來說,其功能基因組研究任務更加緊迫。植物的基因組研究雖然起步較晚,但由于吸取了人類基因組研究中積累的一些經(jīng)驗,所以進展也相當迅速,對植物功能基因組學的研究目前也已經(jīng)受到重視,在1998年12月出版的最新一期P lant C ell (10:1771和P lant Ph y siol.(118:713上均編發(fā)了關(guān)于植物功能基因組學研究的編者按,并由Bouchez 和H ofte (19982綜述了植物尤其是擬南芥功能基因組學研究的現(xiàn)狀,本文在此基礎(chǔ)上綜述了目前植物功能基因組學研究中使用的主要技術(shù)手段以及最新的研究進展。1基因功能的含義基因的功能主要包括:生物化學功能,如作為蛋白質(zhì)

8、激酶對特異的蛋白質(zhì)進行磷酸化修飾;細胞學功能,如參與細胞間和細胞內(nèi)的信號傳遞途徑;發(fā)育上的功能,如參與形態(tài)建成等。目前,獲得一段DNA 序列的功能信息的最簡單的方法是將該DNA 序列與G enBank 中公布的基因序列進行同源性比較,如利用BLAST n 和BLAST x 兩種軟件分別進行核苷酸和氨基酸序列同源性比較等。同源性比較的結(jié)果大體可以分為如下類型:與生化和生理功能均已知的基因具同源性;與遺傳HER ED I TAS (Bei j in g 22(1:57602000綜述58遺傳HER ED I TAS(Bei j in g200022卷生化功能已知的基因具同源性,但該基因的生理功能未

9、知;與其它物種中生化和生理功能均未知的基因具同源性;雖與生化和生理功能均已知的基因具同源性,但對該基因功能的了解尚不深入,仍停留在表觀現(xiàn)象上。上述同源性檢索分析方法僅僅為該DNA片段的功能提供了間接的證據(jù),對基因功能的直接證據(jù)還需要實驗上的數(shù)據(jù)。Bouchez和H ofte(19982將所需要的實驗證據(jù)歸納如下:(1通過研究基因的時空表達模式確定其在細胞學或發(fā)育上的功能,如在不同細胞類型、不同發(fā)育階段、不同環(huán)境條件下以及病原菌侵染過程中mRNA和/或蛋白質(zhì)的表達的差異等。(2研究基因在亞細胞內(nèi)的定位和蛋白質(zhì)的翻譯后調(diào)控等。(3利用基因敲除(knock-out技術(shù)進行功能喪失(loss2of2f

10、unction分析或通過基因的過量表達(轉(zhuǎn)基因進行功能獲得(g ain2of2function分析,進而研究目的基因與表型性狀間的關(guān)系。(4通過比較研究自發(fā)或誘發(fā)突變體與其野生型植株在特定環(huán)境條件下基因表達的差異來獲取基因功能的可能信息。2植物的表達序列標記(ex p ressed se q uence ta g,EST與基因組大規(guī)模測序通過從cDNA文庫中隨機挑取的克隆進行測序所獲得的部分cDNA的5或3端序列稱為表達序列標記(EST,一般長300500b p左右,利用EST作為標記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜被稱為轉(zhuǎn)錄圖譜。目前植物EST計劃主要集中在擬南芥35和水稻6上,其他植物的EST相對較少

11、,截止到1998年12月底,在美國國家生物技術(shù)信息中心(NC BI數(shù)據(jù)庫中公布的各種植物EST的數(shù)目總和已達幾萬條(見表1。這些EST不僅為植物基因組遺傳圖譜的構(gòu)建提供了大量的分子標記,而且來自不同組織和器官的EST也為基因的功能研究提供了有價值的信息,此外,EST計劃還為基因的鑒定提供了候選基因(candidates。EST計劃的一個不足之處在于通過隨機測序有時難以獲得那些低豐度表達的基因和那些在特殊環(huán)境條件下(如生物脅迫和非生物脅迫誘導表達的基因,因此為了彌補EST計劃的不足,必須開展基因組測序計劃。通過分析基因組序列能夠獲得基因組結(jié)構(gòu)的完整信息,如基因在染色體上的排列順序,基因間的間隔區(qū)

12、結(jié)構(gòu),啟動子的結(jié)構(gòu)以及內(nèi)含子的分布等。3植物基因的功能分析方法基因的時空差異表達是植物發(fā)育、分化、衰老和抗逆等生命現(xiàn)象的分子基礎(chǔ)?；蛟诓煌M織、不同器官以及不同環(huán)境條件下的差異表達特征,為基因的功能提供了重要的信息。Velculescu等(199712將在特定組織或細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的所有基因及其表達豐度稱為轉(zhuǎn)錄組(transcri p tom e,因此在轉(zhuǎn)錄水平上進行的基因表達差異分析實際上就是進行轉(zhuǎn)錄組研究。經(jīng)典的減法雜交(subtractive h y bridization,差示篩選(differential screenin g,cDNA代表差異分析(re p resentative di

13、fference anal y2 sis,RDA以及mRNA差異顯示(differential dis p la y等技術(shù)已被廣泛用于鑒定和克隆差異表達的基因,但是這些技術(shù)不能勝任對大量的植物基因進行全面、系統(tǒng)的分析,于是,基因表達的系統(tǒng)分析(serial anal y sis of g ene ex p ression,SAGE、cDNA微陣列(cDNA m icroarra y和DNA芯片(DNA chi p等能夠大規(guī)模地進行基因差異表達分析的技術(shù)應運而生。3.1基因表達的系統(tǒng)分析(SAGESAGE技術(shù)的主要理論依據(jù)是:來自cDNA3端特定位置的一段911b p長的序列能夠區(qū)分基因組中95

14、%的基表1N CBI數(shù)據(jù)庫dbEST中公布的植物EST的數(shù)目植物EST數(shù)目植物EST數(shù)目擬南芥37618白菜536水稻35192番茄346大豆320400高粱107玉米2752馬鈴薯85油菜1434大麥75棉花1327煙草62芥菜966小麥4 (截止至1998年12月底,31999年12月59 1期因。這一段基因特異的序列被稱為SAGE標簽(SAGE ta g。通過對cDNA制備SAGE標簽并將這些標簽串聯(lián)起來,然后對上述串聯(lián)起來的SAGE標簽進行測序不僅可以顯示各SAGE 標簽所代表的基因在特定組織中是否表達,還可以根據(jù)各SAGE標簽所出現(xiàn)的頻率作為其所代表的基因表達豐度的指標13。應用SA

15、GE技術(shù)的一個必要前提是G enBank中必須有足夠的某一物種的DNA序列資料,尤其是EST序列資料。目前該技術(shù)在人類14和酵母12基因組研究中已得以應用,但是尚未用于植物基因組研究。SAGE技術(shù)的不足是不能夠檢測出稀有轉(zhuǎn)錄物。3.2cD NA微陣列和D NA芯片技術(shù)cDNA微陣列和DNA芯片都是基于reverse N orthern雜交以檢測基因表達差異的技術(shù)。二者的基本思路都是首先把cDNA,或EST,或基因特異的寡聚核苷酸固定在固相支持物上,并與來自不同細胞、組織或整個器官的mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的第一鏈cDNA探針進行雜交,然后用特殊的檢測系統(tǒng)對每個雜交點進行定量分析,理論上雜交點的強度基

16、本上反映了其所代表的基因在不同細胞、組織或器官中的相對表達豐度。這兩項技術(shù)的優(yōu)點是可以同時對大量基因,甚至整個基因組的基因的表達差異進行對比分析。cDNA微陣列技術(shù)是S chena等(199515發(fā)展起來的,其主要優(yōu)點是:靈敏度極高, mRNA豐度低至10萬分之一仍能被檢測出;使用幾種不同顏色的熒光染料標記探針,這樣在同一張陣列膜上進行一次雜交實驗就可以同時分析不同細胞間或不同環(huán)境脅迫下基因表達的差異。cDNA微陣列技術(shù)的主要不足是成本非常高,如需要機器人點膜和特殊的信號檢測分析系統(tǒng),點在玻璃片上的arra y不能重復使用等。最近,Des p rez等(199816和胡玉欣等(中科院遺傳所,私

17、人交流分別獨立發(fā)展了利用尼龍膜作固相支持物和使用同位素標記探針進行雜交的cDNA表達陣列技術(shù),從而降低了成本,但檢測的靈敏度卻降低了(萬分之一。DNA芯片技術(shù)是A ff y m etrix公司率先研制出來的,該技術(shù)利用結(jié)合化學手段在玻璃固相支持物上原位合成大量的基因特異的寡聚核苷酸,并與熒光標記的探針進行雜交,再利用特殊的檢測系統(tǒng)進行信號分析,就可以獲得基因的時空差異表達譜,最近Ramsa y(199817對DNA芯片技術(shù)的原理和應用進行了較全面的介紹,這里不再贅述。3.3蛋白組(p roteome研究轉(zhuǎn)錄不是基因表達的最終結(jié)果,基因功能的實現(xiàn)最終是以蛋白質(zhì)的形式體現(xiàn)的,因此,在轉(zhuǎn)錄水平上所獲

18、取的基因表達的信息有時并不足以揭示該基因在細胞內(nèi)的確切功能。蛋白組指的是由基因組表達產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱,由英文單詞p rotein的前半部加上單詞g enom e的后半部組合而成。蛋白質(zhì)雙向電泳是目前蛋白組研究的首選技術(shù)18,但是該技術(shù)在以下方面尚需改進:分辨率和可重復性;蛋白質(zhì)斑點的自動定量檢測系統(tǒng),以及蛋白質(zhì)N端和內(nèi)部氨基酸序列測定技術(shù)等。利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)對基因敲除(knock-out突變體或轉(zhuǎn)基因重組體與野生型個體間雙向電泳蛋白圖譜的差異進行對比分析就可以對目的基因的功能進行分析。在植物上該技術(shù)已被用來分離新的基因,Dam erval等(199819分析了玉米O p a q ue

19、2基因的近等基因系之間的雙向電泳蛋白圖譜的差異,結(jié)果鑒定克隆了一個新的轉(zhuǎn)錄激活因子基因。對水稻鹽脅迫處理和ABA處理前后的雙向電泳蛋白圖譜進行的對比分析同樣克隆了幾個與水稻耐鹽性相關(guān)的胚胎晚期豐富蛋白(lea基因20,21。3.4反求遺傳學研究傳統(tǒng)的遺傳學或稱為正向遺傳學(forw ard g enetics主要研究自發(fā)或誘發(fā)突變體中某一突變性狀的遺傳行為,如控制突變性狀的基因的數(shù)目及其在染色體上的位置、突變性狀在后代中的傳遞規(guī)律等。反求遺傳學(reverse g enetics是在已知基因序列的基礎(chǔ)上研究基因的生物學功能,一般通過創(chuàng)造功能喪失(loss-of-function突變體并研究突變

20、所造成的表型效應。在微生物和小鼠中可以通過同源重組的方法用突變的基因取代野生型基因創(chuàng)造功能喪失突變體進行反向遺傳學研究,但在植物中很難進行同源重組試驗22,不過植物中有成熟的轉(zhuǎn)座子標簽(trans p oson ta gg in g系統(tǒng)和T-DNA標簽系統(tǒng),而且目前已經(jīng)獲得了擬南芥、金魚草、番茄、玉米和水稻等植物的轉(zhuǎn)座子插入誘變的突變體群體,以及T-DNA插入誘變了的擬南芥突變體群體。從這些突變體群體中篩選出特異基因被突變了的植株,并對突變株進行表型分析將有助于揭示目的基因的生物學功能。篩選突變體的常用方法是利用PCR技術(shù),這是在果蠅23和線蟲(C.ele g ans24中發(fā)展起來的比較成熟的

21、方法,其基本思路是根據(jù)目的基因的序列設計一個引物,再根據(jù)插入元件(轉(zhuǎn)座子或T-DNA的序列設計第二個引物,用上述引物對突變體群體進行PCR擴增,由于只有目的基因插入轉(zhuǎn)座子或T-DNA的突變體才有PCR擴增產(chǎn)物,這樣根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無就可以很容易地從數(shù)以千計的突變體群體中篩選出所需要的突變體。該技術(shù)已經(jīng)在矮牽牛25、玉米26,27和擬南芥2835等植物中得以成功應用。但是對數(shù)以千計的材料進行PCR反應工作量十分巨大,為克服這一困難,W inkler等(199833設計了利用DNA混合池(p oolin g進行突變體篩選的實驗程序,結(jié)果只需要進行36個PCR反應就可以從由6000個突變體組成的群體

22、中篩選出單個的突變株,大大減輕了篩選的工作量,同時這些突變體的DNA樣品及構(gòu)建的DNA池也可以向其他研究者免費提供。當然,要對基因組中所有的基因進行功能分析所需要的突變體的數(shù)目也是十分可觀的,理論上,要達到95%的概率使基因組中每一個基因均因插入元件而致突變,則所構(gòu)建的突變體群體中個體的數(shù)量至少應為該植物基因總數(shù)的5倍左右。在進行反求遺傳學研究時,有時篩選出來的突變體在正常生長條件下并不表現(xiàn)出突變的表型效應,這種情況一方面可能是由于突變的表型效應需要在特定的生長環(huán)境中才能得以表現(xiàn)出來,如擬南芥的鉀離子通道基因突變體Akt1只有在缺鉀的培養(yǎng)條件下才表現(xiàn)出突變的表型效應35。另一方李子銀等:植物的

23、功能基因組學研究進展60遺傳HER ED I TAS(Bei j in g200022卷面,植物基因組中有些基因是以基因家族的形式存在的,即存在基因冗余,這樣只要基因家族中有一個成員未發(fā)生插入突變,該基因的表達就能夠補償其他家族成員由于發(fā)生突變所造成的功能喪失效應。因此,對植物的家族基因的功能進行反求遺傳學研究時必須對該基因家族中的各個成員均已發(fā)生插入突變的突變株進行表型分析,才能揭示該基因家族的生物學功能。植物的功能基因組學研究才剛剛開始,上述的各種技術(shù)手段都各有優(yōu)缺點,隨著植物基因組研究的進展和深入,在完善現(xiàn)有的研究手段的同時,還必須發(fā)展一些新的基因功能的研究技術(shù),同時加強國際間的學術(shù)和材

24、料交流,建立全球共享的植物基因組數(shù)據(jù)庫系統(tǒng),以最終闡明植物基因組的結(jié)構(gòu)與功能。另外,進一步的研究應從模式植物擬南芥的基因組研究轉(zhuǎn)向作物的基因組研究,為作物的遺傳改良作出貢獻。參考文獻:1H ieter P,Bo g uski M.Functional g enom ics:its all how y ou read it J.S cience,1997,278:601602.2Bouchez D,H ofte H.Functional g enom ics in p lantsJ.P lant Ph y si2 ol.,1998,118:725732.3H ofte H,et al.An in

25、ventor y of1151ex p ressed se q uence ta g s obtainedb y p artial se q uencin g of cDNAs from Arabido p sis thalianaJ.P lantJ,1993,4:10511061.4Newm an T,et al.G enes g alore:a summ ar y of m ethods for accessin g results from lar g e2scale p artial se q uencin g of anon y m ous Arabido p sis cDNA cl

26、onesJ.P lant Ph y siol,1994,106:12411255.5C ooke R,et al.Further p ro g ress tow ards a catalo g ue of all Arabido p2s2 is g enes:anal y sis of a set of5000non2redundent EST sJ.P lant J,1996,9:101124.6Y am am oto K,S asaki T.Lar g e2scale EST se q uencin g in riceJ.P lant M ol Biol,1997,35:135144.7B

27、evan M,et al.Anal y sis of1.9M b of conti g uous se q uence from chro2 m osom e4of Arabido p sis thalianaJ.Nature,1998,391:485488.8Uberbacher E C,et al.Locatin g p rotein codin g re g ions in hum an DNA se q uences usin g a multi p le sensor2neural net2w ork a pp roachJ.ProcNatl Acad S ci USA,1991,8

28、8:1126111265.9H ebs g aard S M,et al.S p lice site p rediction in Arabido p sis thaliana DNA b y combinin g local and g lobal se q uence inform ationJ.NucleicAcids Res,1996,24:34393452.10T olstru p N,et al.A branch p oint consensus from Arabido p sis found b y non2circular anal y sis allows for bett

29、er p rediction of the acce p tor sitesJ.Nucleic Acids Res,1997,25:31593163.11Brown J W S.Arabido p sis intron mutations and p re2mRNA s p licin g J.P lant J,1996,10:771780.12Velculescu V E,et al.Characterization of the y east transcri p tom e J.Cell,1997,88:243251.13Velculescu V E,et al.S erial anal

30、 y sis of g ene ex p ressionJ.S cien2 ce,1995,270:484487.14P ol y ak K,et al.A m odel for p532induced a p o p tosisJ.Nature, 1997,389:300305.15S chena M,et al.Quantitative m onitorin g of g ene ex p ression p atternsw ith a com p lem entar y DNA m icroarra y sJ.S cience,1995,270:467470.16Des p rez T

31、,et al.Differential g ene ex p ression in Arabido p sis seedlin g s m onitored usin g cDNA arra y sJ.P lant J,1998,14:643652.17Ramsa y G,et al.DNA chi p s:state2of the artJ.Nature Biotechnol2 o gy,1998,16:4044.18Hum p her y2Sm ith I,et al.Proteom e anal y sis:g enom ics via the out p ut rather than

32、the in p ut codeJ.J Protein Chem,1997,16:537544.19Dam erval C,et al.Characterization of novel p roteins affected b y the o2mutation and ex p ressed durin g m aize endos p erm develo p m entJ.M ol G en G enet,1998,257:354361.20M oons A,et al.M olecular and p h y siolo g ical res p onses to abscisic a

33、cid and salts in roots of salt2sensitive and salt2tolerant indica ricevarietiesJ.P lant Ph y siol,1995,107:177186.21M oons A,et al.Anta g onistic effects of abscisic acid and j asm onates on salt stress2inducible transcri p ts in rice rootsJ.P lant Cell,1997,9:22432259.22Puchta H,et al.From centim o

34、r g ans to base p airs:hom olo g ous re2 combination in p lantsJ.T rends P lant S ci,1996,1:340348.23Ballin g er D G,et al.T ar g eted g ene mutation in Droso p hilaJ.Proc Natl Acad S ci USA,1989,86:94029406.24Z w aal R R,et al.T ar g et2selected g ene interaction in Caenorhabditis ele g ans b y usi

35、n g a frozen trans p oson insertion bankJ.Proc NatlAcad S ci USA,1993,90:74317435.25K oes R,et al.T ar g eted g ene inactivation in p entunia b y PCR2based selection of trans p oson insertion mutantsJ.Proc Natl Acad S ciUSA,1995,92:81498153.26Bensen R T,et al.C lonin g and characterization of the m aize An1g eneJ.P lant Cell,1995,7:7584.27M ena M,et al.Diversification of C2function activit y in m aize flow er develo p m entJ.S cience,1996,274:15371540.28K r y san P J,et al.Identification of transferred DNA insertions w ith