響應(yīng)面分析法優(yōu)化鹽酸丁螺環(huán)酮微球制備工藝研究

1、響應(yīng)面分析法優(yōu)化鹽酸丁螺環(huán)酮微球制備工藝研究                  作者：惠尉，陳國(guó)廣，唐俊，張東旭，齊鵬，韋萍【摘要】  目的用擬合響應(yīng)曲面法對(duì)鹽酸丁螺環(huán)酮的制備工藝進(jìn)行改良，并考察其體外釋放。方法聚乳酸羥基乙酸(PLGA)為載體，采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備鹽酸丁螺環(huán)酮PLGA微球。結(jié)果微球顆粒圓整，大小均勻，觀(guān)察其體外釋放，在211d之間，微球持續(xù)恒速釋放藥物。結(jié)論所制微球具有很好的緩釋作用，操作方便，工藝穩(wěn)定，

2、有利于工業(yè)化生產(chǎn)。 【關(guān)鍵詞】  擬合響應(yīng)曲面法 復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法 鹽酸丁螺環(huán)酮 微球Abstract：ObjectiveTo optimize the preparation of Buspirone Hydorchloride microspheres by response surface analysis， and investigate the in vitro release. MethodsUsing PLGA as carrier， we synthesized Buspirone Hydorchloride PLGA-microspheres with double

3、 emulsion/ solvent evaporation method. ResultsThe morphology of microspheres was spherical and well distributed. The release property of microspheres in vitro was stable between 2 to 11 days. ConclusionThe microspheres sustained released well in vitro and in vivo and its convenient preparation is su

4、itable for industrialization and production.Key words：Response Surface Analysis;  Double Emulsion/ solvent Evaporation Method;   BuspironeHydorchloride;   Microspheres   鹽酸丁螺環(huán)酮是美國(guó)用于臨床的第一個(gè)新型的抗焦慮藥物，它具有和BDZ類(lèi)藥物相當(dāng)?shù)目菇箲]作用，但無(wú)催眠、抗痙攣和肌松弛效應(yīng)，被稱(chēng)為“選擇性抗焦慮劑” 1，2。從鹽酸丁螺環(huán)酮的目前給藥劑型來(lái)看，長(zhǎng)

5、期以來(lái)一直只有普通的片劑，具有肝臟首過(guò)作用強(qiáng)，生物利用度低，血藥濃度波動(dòng)大，有峰谷現(xiàn)象3，4等普通片劑普遍存在的缺點(diǎn)，一定程度增加并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。此外，其給藥劑量之大，療程之長(zhǎng)和服藥次數(shù)之多，給患者帶來(lái)諸多不便，多數(shù)患者無(wú)法堅(jiān)持每天按時(shí)服藥。因此其緩釋制劑的開(kāi)發(fā)具有重要意義。   擬合響應(yīng)曲面法(Response Surface Analysis) 是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種分析方法， 其原理是通過(guò)一系列確定性試驗(yàn)擬合一個(gè)響應(yīng)面來(lái)模擬真實(shí)的極限狀態(tài)曲面， 從而很容易地進(jìn)行可靠性分析59。響應(yīng)面分析法采用多元二次回歸方法作為函數(shù)估計(jì)的工具， 將多因子試驗(yàn)中因子與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式

6、近擬， 研究因子與響應(yīng)面之間、因子與因子之間的相互關(guān)系， 并依此從響應(yīng)面的形狀上找到最佳控制點(diǎn)。響應(yīng)面分析法以最經(jīng)濟(jì)的方式、較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)和較短的時(shí)間對(duì)所選實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面分析， 以得出正確結(jié)論， 其優(yōu)越性已為越來(lái)越多的研究人員所關(guān)注并應(yīng)用于各種生物、化工處理過(guò)程。   本文以生物可降解材料制備長(zhǎng)效鹽酸丁螺環(huán)酮PLGA緩釋微球，采用擬合響應(yīng)曲面法優(yōu)化其制備工藝，并對(duì)其體外釋放的情況進(jìn)行研究。1  試劑與儀器   鹽酸丁螺環(huán)酮（恩華藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司）；聚乳酸羥基乙酸（PLGA7525HIGH，美國(guó)MEDSORB公司）；聚乙烯醇(PVA 150

7、S ，韓國(guó)進(jìn)口；二氯甲烷（天津市化學(xué)試劑一廠(chǎng)）；乙醇（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）；色譜甲醇（天津市四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；磷酸二氫鉀（上海試劑總廠(chǎng)）；氫氧化鈉（濟(jì)南化學(xué)試劑廠(chǎng)）；透析袋（截流分子量10 000）；其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。數(shù)顯恒速攪拌器（S312-250，上海申生科技公司）；循環(huán)水式真空泵SHZ-D（），鞏義市予華儀器廠(chǎng)；電子天平（AG135  METTLER TOLEDO公司）；紫外-分光光度計(jì)(UV-2450，SHIMADZU)；光學(xué)顯微鏡；WH2型微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠(chǎng)）；KQ-250E醫(yī)用超聲儀（昆山超聲儀器有限公司）；TGL-16B

8、型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；氣浴恒穩(wěn)震蕩器（江蘇省宏華儀器廠(chǎng)）；高效液相色譜（Waters 515 pump ，2487紫外檢測(cè)器）。2  方法2.1  鹽酸丁螺環(huán)酮微球的制備精密稱(chēng)取聚乳酸羥基乙酸(PLGA)溶解于二氯甲烷及乙醇中10，溶解后加入鹽酸丁螺環(huán)酮溶液，超聲乳化均勻;室溫條件下將初乳緩慢注射進(jìn)高速攪拌的一定濃度的聚乙烯醇（PVA）外水相中，采用層流剪切乳化法乳化，控制乳化時(shí)間;將乳狀液傾入到蒸餾水中，繼續(xù)攪拌，使有機(jī)溶劑揮發(fā)固化完全，所得微球經(jīng)過(guò)濾器抽濾收集，用乙醇或水溶液清洗，真空干燥若干小時(shí)。2.2  鹽酸丁螺環(huán)酮微球制備工藝的考

9、察 用中心組合設(shè)計(jì)法(Central composite design， CCD)進(jìn)行各影響因素的分析。   考察因素（自變量）：   X1-油/水體積比(v/v)；X2-油相中聚合物（PLGA）濃度(mg·ml-1)；X3-PVA濃度(g·ml-1)；X4-乳化轉(zhuǎn)速(r·min-1)；X5-投藥比(g/g)   考察指標(biāo)（因變量）Y1-平均粒徑（m）；Y2-收率(%)；Y3-包封率(%)；Y4-載藥率(%)。2.3  考察指標(biāo)的測(cè)定方法表1  考察因素及水平（略）2.4 

10、鹽酸丁螺環(huán)酮微球體外釋放的研究通過(guò)鹽酸丁螺環(huán)酮微球體外釋放行為的研究，能夠預(yù)測(cè)其在體內(nèi)的釋藥情況，了解其釋藥的機(jī)理，指導(dǎo)微球制備的處方和工藝，對(duì)于鹽酸丁螺環(huán)酮微球質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定其濃度。微球制劑體外釋放實(shí)驗(yàn)?zāi)壳俺Ｓ玫尼尫沤橘|(zhì)為pH=7.4的磷酸緩沖溶液，采用pH=7.0的緩沖液作為微球的體外釋放介質(zhì)亦有報(bào)道。3  結(jié)果與討論3.1  各因素對(duì)粒徑（Y1）的影響分析 方差分析結(jié)果如表2。   方差分析表明：聚合物濃度X2（P=0.001 000），轉(zhuǎn)速X4（P=0.000 027）對(duì)粒徑影響顯著；同時(shí)，聚合

11、物濃度X2及轉(zhuǎn)速X4相互作用對(duì)粒徑影響也是統(tǒng)計(jì)顯著的（P=0.036 421）。   Pareto 圖也可看出同樣結(jié)果，見(jiàn)圖1。   以聚合物濃度X2（P=0.001 000）和轉(zhuǎn)速X4（P=0.000 027）為因素，擬合響應(yīng)曲面如下，考察其對(duì)粒徑的影響。   由響應(yīng)面可得隨著聚合物濃度（X2）的增加，粒徑（Y1）顯著增加，在聚合物濃度達(dá)到最值的時(shí)候可得到粒徑的最值。當(dāng)乳化轉(zhuǎn)速增大的時(shí)候，粒徑顯著減小。聚合物濃度的增大，液滴表層的粘度強(qiáng)度增大，對(duì)剪切力的耐受力也增強(qiáng)，在外界輸入能量相當(dāng)?shù)那闆r下，乳化形成的穩(wěn)態(tài)液滴粒徑也相應(yīng)增大，最終

12、形成的微球的粒經(jīng)也增大。乳化轉(zhuǎn)速的增大，機(jī)械攪拌對(duì)乳化體系輸入的能量也就增加，液滴受到的剪切力的作用也增大，在此情況下，液滴將以分裂減小的乳滴粒徑的方式，增大其液滴表面張力及其他內(nèi)聚力與外界流體的作用力抗?fàn)?，最終維持體系的平衡形成穩(wěn)態(tài)，這直接導(dǎo)致了該狀況下制備的微球粒徑的減小。在對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化的過(guò)程中，粒徑大小的調(diào)節(jié)可以響應(yīng)面擬合出來(lái)的規(guī)律，對(duì)處方，工藝進(jìn)行調(diào)整，以獲得最佳的方案。表2  粒徑的方差分析結(jié)果（略）圖1  各因素對(duì)粒徑的Pareto圖（略）3.2  各因素對(duì)收率（Y2）的影響分析方差分析結(jié)果如表3及圖2。   X5（投藥比）對(duì)收率

13、Y2影響顯著（P=0.000 004），其他因素對(duì)其影響不大。   由相應(yīng)曲面可以看出，隨著投藥比的增大，收率明顯增加，當(dāng)投藥比增大到一定程度時(shí)，收率取得最大值，之后再增加投藥比，收率反而有所下降。PVA濃度的增加對(duì)投藥比的影響不大，PVA濃度為11.75 g/ml之間時(shí)，收率取得最大值。因此，收率的增加，需要適當(dāng)調(diào)節(jié)處方工藝，以取得最佳效果。         3.3  各因素對(duì)包封率Y3的影響分析 方差分析結(jié)果如表4。表3  各因素對(duì)收率的方差分析（略）圖2  各

14、因素對(duì)收率的Pareto圖（略）表4  各因素對(duì)包封率的方差分析（略）Pareto圖如下，分析結(jié)果與方差分析結(jié)果相一致，見(jiàn)圖3。圖3  各因素對(duì)包封率的Pareto圖（略）   分析顯示聚合物濃度X2(P=0.033 963)、轉(zhuǎn)速X4（P=0.032 354）還有投藥比X5（P=0.000 060）對(duì)包封率影響顯著，對(duì)轉(zhuǎn)速X4及投藥比X5對(duì)包封率作響應(yīng)面。   由響應(yīng)面可以看出，隨著在轉(zhuǎn)速及投藥比的變化，包封率也有顯著變化，在投藥比最高值區(qū)域及轉(zhuǎn)速最小值時(shí)可獲得最高的包封率。   對(duì)油水相比X1和PVA濃度X3對(duì)

15、包封率作響應(yīng)面。3.4  各因素對(duì)載藥率Y4的影響分析 方差分析結(jié)果如表5。表5  各因素對(duì)載藥量的方差分析（略）Pareto圖如下，分析結(jié)果與方差分析結(jié)果均顯示聚合物濃度X2（P=0.015750）及投藥比X5（P=0.024501）對(duì)載藥量Y4影響顯著，見(jiàn)圖4。圖4  各因素對(duì)在藥量的Pareto圖（略）   響應(yīng)曲面顯示投藥比（X5）對(duì)微球載藥率的影響極顯著，在X5為1:4時(shí)載藥率達(dá)到最高。聚合物濃度（X2）的變化對(duì)載藥率的影響也相當(dāng)明顯，當(dāng)X2在62.590之間時(shí)，Y4取得最大值。在處方優(yōu)化過(guò)程中，提高載藥量的最有效直接的方法可選擇改變

16、投藥比。3.5  工藝優(yōu)選 根據(jù)上述響應(yīng)面分析對(duì)鹽酸丁螺環(huán)酮各項(xiàng)指標(biāo)的考察，得到最佳的工藝條件和制備處方如表6，所得微球質(zhì)量指標(biāo)如表7。表6  鹽酸丁螺環(huán)酮微球最佳工藝參數(shù)表（略）表7  鹽酸丁螺環(huán)酮微球質(zhì)量指標(biāo)表（略）3.6  鹽酸丁螺環(huán)酮微球體外釋放的研究 用所得的最優(yōu)化工藝制備鹽酸丁螺環(huán)酮微球，該微球在介質(zhì)為pH7.4 PBS長(zhǎng)期體外實(shí)驗(yàn)的釋放結(jié)果如表8，累積釋放曲線(xiàn)如圖5，微球略有突釋?zhuān)?11 d之間，微球持續(xù)恒速釋放藥物。表8  體外長(zhǎng)期釋放結(jié)果（略）圖5  鹽酸丁螺環(huán)酮微球在Ph7.4磷酸鹽緩沖液中的釋放（略） 

17、;  生物降解型微球的釋藥過(guò)程與聚合物的降解方式以及藥物在聚合物中的擴(kuò)散行為有關(guān)，其釋藥曲線(xiàn)通常呈零級(jí)（ Q=kt）、一級(jí)（ q=100-100e-1kt）、Higuchi（Q=kt1/2 ）、Ritger-Peppas（ Q=ktm）、擴(kuò)散-松弛（ Q=k1t1/2+k2t）、Hixson-Crowell（Q=k1t +k2t2+k3t3）及擴(kuò)散-溶蝕（ Q=K1t1/2+k2t+k3t2+k4t3）模型。Q為t時(shí)間的釋藥百分率，k為釋藥速度常數(shù)，m為擴(kuò)散指數(shù)。   用Statistica6.0軟件分別對(duì)幾種釋藥模式進(jìn)行擬合，結(jié)果如表9，以相關(guān)系數(shù)R愈大愈好、殘

18、差平方和(SUM)愈小愈好為判斷標(biāo)準(zhǔn)。   由上述擬合結(jié)果可以看出，擴(kuò)散-溶蝕模型擬合后的殘差平方和為170，相關(guān)系數(shù)為0.997 3。因此，鹽酸丁螺環(huán)酮微球的主要釋藥方式可能為擴(kuò)散和融蝕相結(jié)合模型。表9  體外釋藥擬合方程（略）4  討論   制備微球的過(guò)程中，處方和工藝參數(shù)都會(huì)影響到微球的質(zhì)量。本文以微球的粒徑、載藥量、包封率和產(chǎn)率等為指標(biāo)，對(duì)含藥微球質(zhì)量的影響因素進(jìn)行了考察。油/水比例對(duì)載藥量、包封率和產(chǎn)率的影響均不明顯；隨著油相中PLGA比例的下降，載藥量、包封率、產(chǎn)率均有所降低；水相中PVA的濃度決定了乳化能力的高低，其濃度

19、較高時(shí)乳化能力較強(qiáng)，溶液體系穩(wěn)定。當(dāng)濃度過(guò)低時(shí)，產(chǎn)生的微球數(shù)量較少，但成球性較好，而濃度過(guò)高，形成的微球較易粘連，水洗時(shí)不易洗凈；隨著攪拌速度的增大，載藥量略有減小，包封率和產(chǎn)率均有所降低；投藥比增加可以顯著提高載藥量，但包封率明顯降低，產(chǎn)率在投藥比為1:1時(shí)明顯降低。   體外長(zhǎng)期釋放的結(jié)果表明，采用優(yōu)選的體外加速釋放條件可以在較短的時(shí)間內(nèi)對(duì)微球的體內(nèi)釋放行為進(jìn)行模擬，便于快速對(duì)微球的釋放行為進(jìn)行考察，控制微球的質(zhì)量，這對(duì)微球處方及制備條件的篩選具有重要意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 馬云峰，李身錄.抗焦慮新藥-丁螺環(huán)酮的臨床研究J.中國(guó)藥物濫用防治雜志，2001，3

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