CYP1B1免疫組化論文

1、細(xì)胞色素P450 1B1在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá) 朱壯彥 張慧娟 糜若然摘要 目的 檢測(cè)卵巢癌組織、卵巢良性上皮性腫瘤及正常卵巢組織中細(xì)胞色素P4501B1（cytochrome P450 1B1）的表達(dá)，為以CYP1B1為靶點(diǎn)進(jìn)行卵巢癌治療提供理論基礎(chǔ)。 方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)53例上皮性卵巢癌、30例卵巢良性上皮性腫瘤及19例正常卵巢組織中CYP1B1的表達(dá)。 結(jié)果 53例卵巢癌中CYP1B1陽性率92.45%，明顯高于卵巢良性腫瘤組織（13.33%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）。正常卵巢組織CYP1B1呈陰性表達(dá)。14例同時(shí)收集的卵巢癌轉(zhuǎn)移灶組織有13例CYP1B1陽性表達(dá)，

2、陽性率為92.86%。 結(jié)論 CYP1B1可作為一個(gè)抗癌藥開發(fā)及逆轉(zhuǎn)化療藥耐藥的新靶點(diǎn)。關(guān)鍵詞 卵巢腫瘤 細(xì)胞色素P450 1B1 抗癌治療 逆轉(zhuǎn)耐藥The expression of cytochrome P450 1B1 in Epithelial Ovarian Cancer Zhu ZhuangYan, Zhang HuiJuan， Mi RuoRan Abstract Objective This study investigated the expression of CYP1B1 in ovarian cancer ，benign tumour of ovary and norm

3、al ovarian tissue, aimed to identify the CYP1B1 to be a novel target for the development of anticancer therapies. Methods The immumohistochemical way SP was performed to estimate the expression of CYP1B1 in 53 cases of epithelial ovarian cancers , 30 cases of benign tumours of ovary, and 19 cases of

4、 normal ovarian tissue. Results The positive staining rate of CYP1B1 was 92.45% in epithelial ovarian cancers, which was significantly higher than that in benign tumours of ovary （13.33%）, there is no positive expression in normal ovarian tissue（p0.01）. In 14 cases of corresponding synchromous metas

5、tases，the positive staining rate of CYP1B1 was 92.86%(13/14). Conclusion The CYP1B1 is a novel target for the development of anticancer therapies and for Reversing the drug resistance. Key words Ovarian tumor CYP1B1 Anticancer therapies Reversing the drug resistance 卵巢癌占女性癌癥死亡的第4位，發(fā)達(dá)國家婦女生殖器官惡性腫瘤的第1位

6、致死原因。盡管已廣泛開展腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)以及術(shù)后聯(lián)合化療的方案，但卵巢癌患者的5年生存率仍徘徊在20%-30%1。因此，尋求新的治療及逆轉(zhuǎn)化療藥耐藥的方案顯得非常重要。有研究表明細(xì)胞色素P4501B1（CYP1B1）在人類多種上皮性惡性腫瘤組織中過表達(dá)，而在相應(yīng)的正常組織中不表達(dá)，且與多種化療藥的耐藥亦相關(guān)。因此，CYP1B1被認(rèn)為是一個(gè)抗癌治療的新靶點(diǎn)2。筆者研究了53例上皮性卵巢癌、30例良性卵巢上皮性腫瘤及19例正常卵巢組織的CYP1B1的表達(dá)，旨在為以CYP1B1為靶點(diǎn)的卵巢癌等婦科惡性腫瘤的治療提供理論基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 組織 卵巢癌石蠟包埋組織塊53例，來源于天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)

7、院2000年5月-2004年6月臨床確診為卵巢癌的手術(shù)患者。所有患者均為初治，且手術(shù)前未接受過化療。年齡2169歲，中位年齡52歲。腫瘤組織學(xué)類型為：漿液性囊腺癌23例、黏液性囊腺癌17例、子宮內(nèi)膜樣癌7例、其它上皮性癌6例（其中混合性上皮性癌1例、透明細(xì)胞癌1例、低分化腺癌4例）。按1988年FIGO（國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟）分期法：I期9例、期8例、期32例、期4例。病理分級(jí)：1-2級(jí)18例，3級(jí)35例。另收集30例良性卵巢上皮性腫瘤及19例因子宮肌瘤等原因而手術(shù)切除的正常卵巢組織。同時(shí)從53例卵巢癌中收集14例卵巢癌轉(zhuǎn)移灶組織。1.2 材料 兔抗人CYP1B1多克隆抗體（濃縮型）購自Alpha

8、Diagnostic International（ADI公司）。SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中山公司。1.3 方法 （1）卵巢癌石蠟包埋組織切片，厚度約5m。（2）SP法免疫組化染色 二甲苯脫蠟3次，10min/次；梯度酒精脫苯各10 min。3%的雙氧水孵育10 min，蒸餾水沖洗，PBS洗3次。浸入枸櫞酸鈉緩沖液中微波爐抗原修復(fù)1020 min，自然冷卻，滴加1：200稀釋的兔抗人CYP1B1抗體（一抗），完全覆蓋組織，4C過夜。加山羊血清封閉10 min，傾去封閉液，滴加二抗工作液，37C水浴床孵育30 min。滴加高敏過氧化物酶，37C水浴床孵育30 min。滴加新鮮配制的DA

9、B溶液，顯色510 min，顯微鏡下控制顯色程度，適時(shí)終止顯色，自來水沖洗，蘇木素輕度復(fù)染1分鐘，鹽酸酒精分化，淡氨水返藍(lán)，脫水，中性樹膠封固。每次染色均以已知陽性的乳腺癌切片作為CYP1B1陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。（3）診斷標(biāo)準(zhǔn) CYP1B1著色部位在細(xì)胞漿，胞漿有棕黃色顆粒即判斷為CYP1B1表達(dá)陽性。綜合考慮陽性細(xì)胞的比例及強(qiáng)度，分別記為陰性（-）（50%）。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。率的比較采用2檢驗(yàn)。2 結(jié)果 CYP1B1主要在卵巢上皮性腫瘤細(xì)胞胞漿著色,呈棕黃色，片狀或彌漫狀分布，表達(dá)較為均一，胞核未表達(dá)。53例卵巢癌有49例CYP

10、1B1陽性，陽性率為92.45%，30例卵巢良性上皮性腫瘤陽性率為13.33%（4/30），兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=51.96, p0.05）。I、期CYP1B1陽性表達(dá)15例（88. 24%）, 、期陽性表達(dá)34例(94.44%)，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=4.40, p0.05）。此外，在卵巢癌及良性卵巢腫瘤組織的血管壁有CYP1B1表達(dá) (圖5、6)。3 討論 細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP)是一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的超家族基因編碼的同工酶，可氧化代謝許多外源性化合物包括多種致癌物。近年來，CYP1B1受到眾多學(xué)者的關(guān)注, CYP1B1能氧化代謝多種前致癌

11、物（如催化多環(huán)芳香烴和芳香胺的活化）和體內(nèi)的甾類激素（如介導(dǎo)17-雌二醇羥化，形成4-兒茶酚雌激素）。與其它P450酶不同，CYP1B1在人類肝臟中不表達(dá)，但在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如乳腺、腎、卵巢及結(jié)腸癌。幾種CYP酶通過激活或失活多種化療藥如環(huán)磷酰胺、紫杉醇、多西紫杉醇，而影響腫瘤對(duì)抗癌藥的反應(yīng)3。本研究表明，CYP1B1在卵巢癌組織中高表達(dá)，在正常卵巢組織中為陰性表達(dá)，與Murray4等的研究結(jié)論一致。同時(shí)本研究首次報(bào)道了CYP1B1在卵巢良性上皮性腫瘤組織中亦有表達(dá)，但表達(dá)率（13.33%）及表達(dá)強(qiáng)度明顯低于卵巢癌組織。Murray對(duì)不同組織（包括結(jié)腸、乳腺、食管、卵巢、子宮、淋巴結(jié)等

12、）來源的腫瘤進(jìn)行的體外研究表明CYP1B1特異性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，而在正常組織不表達(dá)。McFadyen5在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，77%的乳腺癌組織表達(dá)CYP1B1，且僅存在于腫瘤細(xì)胞。但Gibson6對(duì)61例石蠟包埋的結(jié)直腸腺癌及14例正常結(jié)腸組織進(jìn)行免疫組化研究CYP1B1的表達(dá)，結(jié)果表明CYP1B1在結(jié)、直腸上皮性腫瘤中高表達(dá)，而在正常結(jié)腸上皮的表達(dá)率極低，且CYP1B1在腫瘤血管的表達(dá)同樣高于正常結(jié)腸組織血管。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)CYP1B1在卵巢癌不同組織學(xué)類型、不同分級(jí)的表達(dá)無顯著性差異，但其在、期的表達(dá)率高于I、期，提示CYP1B1可能為判定卵巢癌預(yù)后的指標(biāo)。在卵巢癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶CYP1B

13、1均有較高水平的表達(dá)。與Gibson研究結(jié)果相類似的是，CYP1B1在卵巢腫瘤的血管有表達(dá)，在卵巢癌血管的表達(dá)強(qiáng)度也明顯高于良性卵巢腫瘤組織，證實(shí)CYP1B1是癌癥治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)，對(duì)原發(fā)性卵巢癌早期發(fā)生血行或腹腔種植轉(zhuǎn)移的卵巢癌亦提供了一個(gè)治療點(diǎn)，可通過抑制CYP1B1的活性、利用CYP1B1的代謝激活非毒性的前藥物或前細(xì)胞毒性化合物成為抗癌制劑。Rochat7對(duì)CYP1B1與12種目前使用的抗癌藥物之間相互關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，CYP1B1與氟他胺、紫杉醇、米托蒽醌、多西紫杉醇有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，提示這些藥物可能為CYP1B1的底物。研究還發(fā)現(xiàn)：表達(dá)CYP1B1的癌細(xì)胞經(jīng)多西紫杉醇處理，這些細(xì)胞

14、對(duì)這一抗癌藥的敏感性下降，即降低了多西紫杉醇的細(xì)胞毒性作用。CYP1B1在腫瘤組織中特異性表達(dá)，但在臨近的正常組織和人的肝臟，此酶檢測(cè)不到或表達(dá)極弱。故提示：CYP1B1可能代表一個(gè)未被識(shí)別的抗癌藥代謝途徑或抗藥途徑。腫瘤特異性表達(dá)CYP1B1為開發(fā)由這一P450特異性激活的抗癌藥或做為腫瘤相關(guān)抗原進(jìn)行免疫治療提供了一個(gè)靶點(diǎn)8。本研究結(jié)果與多位國外學(xué)者的報(bào)道類似，即CYP1B1在上皮性卵巢癌組織中過表達(dá)，在卵巢良性上皮性腫瘤組織中表達(dá)率較低，強(qiáng)度較弱，而在正常卵巢組織中不表達(dá)，提示CYP1B1可能是一個(gè)新的腫瘤標(biāo)記蛋白，可作為腫瘤的診斷標(biāo)記。此外，對(duì)抗癌藥敏感性降低的癌細(xì)胞可由P450抑制劑逆

15、轉(zhuǎn)，故可利用CYP1B1在癌細(xì)胞高表達(dá)這一點(diǎn)，通過抑制CYP1B1表達(dá)，逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的耐藥。 圖1 卵巢癌CYP1B1陽性表達(dá) DAB200 圖2 卵巢良性腫瘤CYP1B1陽性表達(dá)DAB200 圖3 正常卵巢組織CYP1B1表達(dá)陰性DAB200 圖4 卵巢癌轉(zhuǎn)移灶CYP1B1表達(dá)陽性DAB200 圖5 卵巢癌CYP1B1血管表達(dá)DAB200 圖6 卵巢良性腫瘤CYP1B1血管表達(dá)DAB200 參考文獻(xiàn) 1 McFadyen MCE，Cruickshank ME，Miller ID，et al. Cytochrome P450 CYP1B1 over-expression in primary a

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