試驗四蛋白質(zhì)純化鹽析沉淀法

1、實驗四蛋白質(zhì)純化鹽析沉淀法【實驗目的】采用硫酸銨鹽析法將日本血吸蟲谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶融合蛋白從大腸桿菌BL21 （DE3 PGEX-NS5；細田胞裂解液中分離出來，使學生學習掌握制備細胞裂解 液的技術和采用鹽析法從中分離目的蛋白質(zhì)的技術?！緦嶒炘怼坑名}析法從成分復雜的蛋白質(zhì)溶液（如細胞裂解液）中提取目的蛋白質(zhì)是 一種傳統(tǒng)的目前仍被廣泛使用的蛋白質(zhì)分離純化技術。此種技術的工作原理如 下：蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，其溶解度會隨鹽濃度的升高而增加，此種現(xiàn)象被稱 作鹽溶。但是當鹽的濃度繼續(xù)增高時，蛋白質(zhì)的溶解度又以不同程度地下降并先后 從溶液中析出，此種現(xiàn)象被稱為鹽析。上述現(xiàn)象是由于蛋白質(zhì)分子中極性基團 之

2、間存在靜電力。在低鹽濃度下，蛋白質(zhì)分子中極性基團之間的靜電力受鹽離 子的影響而被消除，蛋白質(zhì)在水中的極性基團的電荷被中和，水化膜被破壞， 于是蛋白質(zhì)分子之間相互聚集并從溶液中析出。鹽析法就是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在 一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達到彼此分離的方法。鹽析的一般操作步驟是，選擇一定濃度范圍的鹽溶液（如 0-25%飽和度的硫 酸銨）使部分雜質(zhì)呈 “鹽析”狀態(tài)從溶液中沉淀出來，經(jīng)離心法去除。而目的蛋 白質(zhì)呈鹽溶狀態(tài)，存在于上清中。增加鹽濃度（如 25-60%飽和度的 NH4SO4）使目的蛋白質(zhì)呈鹽析狀態(tài)，而從溶液中分離出來。在鹽析時，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強度的關系，可用下式表

3、示：Sig二-Ks x IS0式中的S為蛋白質(zhì)在離子強度為I的溶解度，S0蛋白質(zhì)在純水（離強度為0）中的溶解度；KS為鹽析常數(shù)。離子強度I可用下式表示：刀Z2式中，M-溶液中各種離子xx濃度Z-各種離子所帶的電荷數(shù)在溫度恒定時，S0對于某一種蛋白質(zhì)在某一溶液中的溶解度是一個常數(shù)，igS0也為一常數(shù)，以B代替，故式（1）可以改寫為：lgS= Ksx I（3） B值主要與蛋白質(zhì)的結構，鹽離子的平均半徑以及鹽離子的電荷數(shù)有 關，也受溶液中的氫離子濃度（PH值）和溫度影響。一般來說，蛋白質(zhì)在某一 鹽溶液中的鹽析系數(shù)-KS越大，鹽析效果越好。由于蛋白質(zhì)含有許多親水基團，需要在較高的 I植 下才能從溶液中

4、析出。由式（3）可以看出，在一定的溫度和 PH值下，改變鹽的離子強度（I）可以把 不同的蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來。此種方法稱為“KS分段鹽析法”常用于蛋白質(zhì)的初步提純。在一定的的I值下，改變溫度及 PH值，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀出來，稱為 “分段鹽析法”，常用蛋白質(zhì)純化過 程的后期，特別是某些蛋白質(zhì)結晶析出時。蛋白質(zhì)鹽析常用硫酸銨等中性鹽。硫酸銨因其溶解度大（25C時的飽和硫酸銨溶液的摩爾濃度為4.1M，即 767xx/升，0C 時為3.9M，676 克/升），溫度系數(shù)小而被廣泛使用。硫酸銨價格便宜，不易引 起蛋白質(zhì)變性并具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，分段效果比其他鹽類好，廢液可以作 肥料，對環(huán)境無污染。

5、其缺點是，其 NH+4 對用凱氏定氮測定蛋白質(zhì)含量有干擾，硫酸銨溶液的PH 常在4.55.5 之間 ,其緩沖能力比較差。有時用硫酸鈉 .。蛋白質(zhì)鹽析時 ,鹽的濃度一般 以飽和度表示，飽和溶液的飽和度定為 100%。用硫酸銨鹽析時，溶液飽和度調(diào) 度方法有三種，一是當?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大，需調(diào)正的濃度不高時，可以向蛋 白質(zhì)溶液中添加飽和鹽溶液。另一種方法是向蛋白質(zhì)溶液中直接添加磨碎的鹽 結晶粉末，此種方法用于需要的鹽濃度高，而且蛋白質(zhì)溶液體積不宜過分增加 時。第三種方法是將待鹽析蛋白質(zhì)的溶液裝于透析裝內(nèi)對飽和硫酸銨進行透 析，此法鹽濃度變化比較連續(xù)平穩(wěn)，不會出現(xiàn)局部過高現(xiàn)象。但是鹽析時需要 測定鹽的

6、飽和度，過程復雜，較少應用。采用方法一時，所需添加的飽和鹽溶液的體積可按下式計算：S2-S1V二V01-S式中，V 和鹽溶液的體積 V0原溶液的體積S1 原溶液的飽和度S2要達到的飽和度采用第二種方法時，可從附表一中選擇要達到某一濃度時所需添加的固體 硫酸銨量。影響蛋白質(zhì)鹽析的因素：（1）蛋白質(zhì)溶液中鹽的濃度。不同蛋白質(zhì)的鹽析要求鹽的飽和度不同。從 成分復雜的蛋白質(zhì)溶液中分離蛋白質(zhì)時，鹽的飽和度應由稀到濃漸次增加。每 出現(xiàn)一種蛋白質(zhì)沉淀就應將其分離除去后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第二種 蛋白質(zhì)沉淀出來；（2）蛋白質(zhì)溶液的PH值。在蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小而 容易沉淀出來，因此鹽析時

7、應將 PH值調(diào)節(jié)在目的蛋白質(zhì)的等電點附近；3/ 7(3) 蛋白質(zhì)濃度。在相同鹽析條件下，蛋白質(zhì)濃度越大越易被鹽析沉淀。 但是濃度太高時，易使雜蛋白共沉淀；( 4)溫度。濃鹽溶液對蛋白質(zhì)有一定的保護作用，因此一般的鹽析操作可 以在室溫下進行?！緦嶒炂鞑摹?00ml燒杯，50ml離心管，高速冷凍離心機，微量離心管(1.5ml)10支,聚丙烯酰胺凝膠電泳儀一臺，1ml,200山20山移液器各1 把,1ml,200和20山槍各1支，微量離心管支架，磁力攪拌器及攪拌磁棒?！緦嶒灢牧稀?.大腸桿菌BL21 ( DE3) PGEXNS5；細田胞裂解液，由上一實驗提供2分析純硫酸銨：用干凈的磁研缽研成田粉末。

8、3. 30%三氯乙酸4. SDS-PAG所需試劑【實驗方法】1 .鹽析曲線的測定對于一求知鹽析特性的蛋白質(zhì)來說，用鹽析作為一純化步驟時，應首先用 實驗確定使此種蛋白質(zhì)鹽析沉淀出來的最佳飽和度，其測定方法如下：(1)取 7支微量離心管，用記號筆在管帽上標記 20%、30%、40%、50%、60%、 70%和 80%；( 2)以上述離心管作容器分別稱取磨田的硫酸銨晶體末0.057xx、0.088xx、0.122xx、0.156xx、 0159xx、0.235 克和0.281xx；（ 3）分別向上述裝有（ NH4）2SO4 粉末的離心管中添加0.5ml 細胞裂解液，充分振蕩使（ NH4）2SO4 溶

9、解后，在室溫下靜置 2 小時；（ 4）將離心管放置于離心機中，以 1000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速離心 5 分鐘后，傾去上 清，倒立離心管，以便盡可能多地去除上清；（5）添加0.5ml蒸餾水及8 "30%三氯乙酸混勻，靜置10分鐘后，離心，盡量去除上清；（因此步會造成蛋白質(zhì)不溶影響后續(xù)工作，所以省略 ）（ 6）將離心管置于快速干燥器中干燥 30分鐘；（7）向離心管中添加100"SDS-PAG上樣緩沖液懸浮沉淀后，在沸水浴中 煮沸3分鐘，取出置-20C冰箱中備用；(8)制備SDS聚丙烯酰胺凝膠；按下列上樣順序向加樣孔中添加10 “樣品：樣孔 910 包涵體樣 20%30%40%50%60%70%80包%涵體空白對照電泳分離 后，染色、脫色、觀察目的蛋白質(zhì)出現(xiàn)在何種濃度的( NH4)2SO4 鹽析樣孔中，以確定最佳的鹽析條件。2鹽析(1)將50ml細胞裂解液置于100ml燒杯中，加入攪拌磁棒后放置在磁力 攪拌器上( 2)在攪拌狀態(tài)下緩緩加入研細的( NH4)2SO4 末至最佳飽和度之前的一級飽和度，靜置 2 小時后 ,離心得上清( 3)在攪拌下向上清中添加研細的( NH4)2SO4 粉末，使終濃度達最佳飽和度，靜置 2 小時后離心收集目的蛋白沉淀( 4)將沉淀的蛋白質(zhì)溶解于盡量小體積的磷酸鹽緩沖的生理鹽水中，用 Bradford試劑測定蛋白質(zhì)濃度后，置-2