人線粒體融合蛋白―2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定-精選文檔

1、人線粒體融合蛋白2 基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒 定血管平滑肌細(xì)胞( Vascular smooth muscle cells ， VSMCs) 的增殖是動脈粥樣硬化(Atherosclerosis , AS)形成的中心環(huán) 節(jié)。線粒體融合蛋白-2 (mitofusin-2 , MFN2是一種細(xì)胞增 殖抑制因子，能抑制 VSMC增殖1，2。本研究擬通過構(gòu)建人 MFN2基因真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染原代人臍靜脈平滑肌細(xì)胞， 熒光定量PCR法及 Western blot 檢測MFN2 mRN及蛋白表達(dá)， 為今后研究MFN2在AS中的作用打下良好基礎(chǔ)。1 資料與方法1.1 一般資料 原代人臍靜脈平滑肌細(xì)胞

2、由本實(shí)驗室培養(yǎng)；DME培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Hyclone公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5a購自北京博邁德生物科技公司；真核基因表達(dá)載體 pEGFP-N1 購自Clontech 公司;Taq DNA聚合酶購自寶生物公司； 限制性內(nèi)切酶 Bgl II及EcoRI、T4 DNA連接酶均購自Fermentas 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量 PCR式劑盒購自Fermentas公司; TRIzol 試劑、轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000 購自 Invitrogen 公司；兔抗人MFN2抗體購自北京博奧森生物科技 XX公司。1.2 方法1.2.1 原代細(xì)胞人臍靜脈平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 采用于海

3、 嬌3 等方法培養(yǎng)及鑒定原代培養(yǎng)的人臍靜脈平滑肌細(xì)胞。122人MFN2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 在NCBI網(wǎng)站查找人MFN2 mRNA編碼區(qū)序列，并設(shè)計引物。上游引物：5'-GAAGATCTATGTCCCTGC TCTT CTCTCGAT下游引物：5'-GGAATTCTCTGCTG GGCTGCAGGTAC上下游弓 I物分別弓 I入 BglII 及 EcoR I 酶切位點(diǎn)（以下劃線標(biāo)出）。 TRIzol 法提取人 臍靜脈平滑肌細(xì)胞總 RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；膠 回收進(jìn)行酶切-連接后轉(zhuǎn)化DH5x大腸桿菌，提取質(zhì)粒經(jīng) BglII 及EcoR I雙酶切及測序鑒定。測序正

4、確者命名為pEGFP-MFN21.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞接種于 24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞 融合60%- 80%寸，設(shè)置pEGFP-N空質(zhì)粒對照組及 pEGFP-MFN2 轉(zhuǎn)染組，每組設(shè)三個復(fù)孔。按照 Lipofectamine 2000 說明書步 驟進(jìn)行，轉(zhuǎn)染各組后37C細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，6h后更換完 全培養(yǎng)液。 48h 后用熒光顯微鏡觀測各組細(xì)胞綠色熒光蛋白 （GFP） 表達(dá)情況。1.2.4 熒光定量PCR檢測MFN2 mRN的表達(dá) 提取轉(zhuǎn)染 pEGFP-MFN細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行熒光定量PCR 以GAPDI為內(nèi)參照，根據(jù)PCF儀自動生成的Ct值，根據(jù)公式： 目的基

5、因的相對量=2- Ct計算目的基因的相對表達(dá)量。1.2.5 western blot 檢測 MFN2 蛋白的表達(dá) 按照全蛋白提 取試劑盒說明書提取總蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%兌脂 奶粉室溫封閉2h,分別用抗MFN2和抗B -actin抗體4C孵育 過夜，TBST洗膜；辣根過氧化物酶（1 : 3000）室溫標(biāo)記1 h ,TBST洗膜；X光膠片曝光、顯影、定影。照像并分析，以B -actin 蛋白為內(nèi)參，用MFN2與B -actin條帶像素灰度的比值表示 MFN2 蛋白的相對表達(dá)量。1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果以 表示，應(yīng)用 SPSS 11.0 統(tǒng)計學(xué)軟件 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用 t 檢

6、驗進(jìn)行兩樣本間比較，以 P<0.05 為 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3 討論MFN2是近年發(fā)現(xiàn)的具有許多生物學(xué)功能的蛋白，在VSMCs以及心、腎等組織中廣泛分布 4 。研究發(fā)現(xiàn)，高血壓大鼠、球 囊損傷大鼠和ApoE基因敲除小鼠的VSMC中Mfn2表達(dá)均明顯下 調(diào)。我國學(xué)者陳光慧等1首次發(fā)現(xiàn)MFN2基因控制VSMCS增殖， 其機(jī)制主要在于 MFN2是原癌基因Ras的直接負(fù)調(diào)控因子，能夠 與其相互作用，阻滯Ras-Raf-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而將細(xì)胞周期 阻斷在 G0/G1 期。研究還發(fā)現(xiàn)， 血管緊張素 II 、內(nèi)皮素 -1 及 IL-1 等可以通過下調(diào) MFN2表達(dá)，促進(jìn)VSMC的增殖，而相應(yīng)的受體 阻斷劑可以阻斷該作用；MFN2的表達(dá)水平可受到心鈉素和腎上 腺髓質(zhì)素的正調(diào)節(jié)，從而抑制 VSMC的增殖4。為了進(jìn)一步明 確MFN2的作用，我們初步構(gòu)建了含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP報告基因的人 MFN2真核重組表達(dá)載體。結(jié)果表明成功 構(gòu)建了人MFN2基因真核表達(dá)載體，并且將其其轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的 VSM