高效液相色譜法測定豬尿中鹽酸克倫特羅

1、【方法測定】 文章編號 1004 8685(2001 04 0436 02高效液相色譜法測定豬尿中鹽酸克倫特羅 蘇文周 , 蔡玉枝 , 羅曉燕( 廣州市衛(wèi)生防疫站 , 廣東 510080 中圖分類號 R657. 7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 鹽酸克倫特羅 (Clenbuterol Hydorchloridum , a -(叔丁氨基 甲基 -4-氨基 -3,5-, 種 2腎上腺受體激動藥 , 以致因 。生 豬被飼喂添加了鹽酸克倫特羅的飼料 , 其尿液可檢出鹽酸克 倫特羅 。1 材料與方法111 儀器與試劑 HP1100型高效液相色譜儀 , G 1315A DAD 二極管陣列檢測器 , G 1313A

2、A LS 自動進(jìn)樣器 , 超聲波水浴 , 離 心機(jī) (4000r/min , 恒溫水浴箱 。乙醇 , 乙醚 ,0. 01m ol/L 磷酸二氫鈉溶液 ;2m ol/L 氫氧化鈉 溶液 :20g氫氧化鈉 (優(yōu)級純 溶于 250ml 水中 ; 無水硫酸鈉 。 (所有試劑除了注明外 , 均為分析純 。鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液 :儲備液 ,500g/ml :5.00mg 鹽酸克 倫特羅溶于超純水中 , 加甲醇 1ml , 然后用超純水定容 10ml ; 工 作液 :將儲備標(biāo)準(zhǔn)液用超純水經(jīng)兩步稀釋為 2. 0g/ml 的工作 標(biāo)準(zhǔn)液 。112 樣品處理 吸取豬尿 10ml 于 125ml 分液漏斗中 , 用

3、 2m ol/ L NaOH 溶液調(diào) pH 值至 1112(約 8滴 , 分別用 30、 25ml 乙醚 萃取 2次 , 每次振搖 2min , 待分層后把乙醚層 (上層 通過無水 硫酸鈉 (23g 的漏斗放入 100ml 蒸發(fā)皿中 。 然后用少許乙醚 清洗分液漏斗并淋洗無水硫酸鈉 , 淋洗液放入蒸發(fā)皿中 。將 蒸發(fā)皿置水浴上 (約 60 揮發(fā)蒸干后 , 再用 60%乙醇溶液分 3次將殘留物洗入定容瓶中并定容 2ml , 然后經(jīng) 0. 5m 雙層濾膜 離心過濾后 , 供 HP LC 測定 。113 色譜分析 色譜條件 :Dianonsil C182004. 6mm 色譜 柱 , 檢測波長 24

4、3nm ; 柱溫 28 ; 進(jìn)樣量 20l ; 流動相 0. 01m ol/L NaH 2PO 4+甲醇 =67+33; 流速 0. 8ml/min 。按上述色譜條件 , 采用外標(biāo)法 , 以保留時間定性 , 并以鹽 酸克倫特羅的特征紫外吸收光譜對照樣品的掃描光譜進(jìn)行確 認(rèn) , 然后根據(jù)樣品峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰面積比較計算鹽酸克倫特 羅含量 。2 結(jié)果與討論211 樣品的采集和前處理 本實驗的豬尿樣品從廣州肉聯(lián)廠 和廣州茅山肉聯(lián)廠的剛屠宰的每頭生豬的膀胱中分別采集于 具塞廣口瓶中 , 蓋緊瓶塞 , 然后冷藏備用 。豬尿中的雜質(zhì)必須。 鹽酸克倫特羅可溶解于水或乙醇 , 不溶于乙 , 而 在 堿 性 溶

5、液 中 可 溶 于 乙 醚 14, 豬 尿 樣 品 用 2m ol/L NaOH 溶液堿化 ,pH 調(diào)節(jié)為 1112, 然后用乙醚萃取 , 乙醚層 揮干后再用 60%乙醇溶液溶解殘渣并定容 , 供 HP LC 測定 。按 本處理方法進(jìn)行回收試驗的結(jié)果良好 。212 色譜條件的選擇 根據(jù)文獻(xiàn) 1、 4, 并經(jīng)本實驗室 G 1315A DAD 二極管陣列檢測器進(jìn)行光譜掃描證實 , 鹽酸克倫 特羅紫外吸收特征光譜在 210、 243和 296nm 有 3個峰值依次 變低的吸收峰 , 考慮方法的靈敏度 、 線性范圍和光譜干擾等因 素 , 選定檢測波長為 243nm 。據(jù)文獻(xiàn) 3報道 , 采用 0. 0

6、1m ol/L 磷酸二氫鈉 +甲醇為流動相 , 在本實驗條件下 , 當(dāng)柱溫 28 , 流動相 0. 01m ol/L 磷酸二氫鈉溶液 +甲醇 =65+35(V/V 流速 0. 8ml/min 雜質(zhì)峰與鹽酸克倫特較峰分離不完全 , 而當(dāng)比例為 67+33(V/V 時 , 出峰時間 9. 5min 左右 , 分離效果好 , 不受雜質(zhì) 和溶劑的干擾 。流動相流速選擇實驗表明 , 當(dāng)流速 1. 0ml/min 時出峰快 , 但分離不好 ; 流速 0. 8ml/min 時分離效果達(dá)到要求 , 當(dāng)流速小于 0. 8ml/min 時 , 則色譜峰擴(kuò)寬 , 保留時間也太長 。 用上述選定的條件得到的色譜圖 ,

7、 如圖 1。(1 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖 (2 含鹽酸克倫特羅樣品的譜圖 圖 1 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)與樣品的譜圖213 鹽酸倫特羅的定性定量 鹽酸克倫特羅 (Clenbuterol Hy 2 dorchloridum 為 2腎上腺素受體激動藥 , 有多種同屬此類的藥 物 。 目前 , 國際上對鹽酸克倫特羅測定的其中一種方法 -酶 聯(lián)免 疫 法 中 , 有 如 Carbuterol 、 Salbutam ol Methy1-Clenbuterol 、 Brobuterol 、 Brombuterol 等多種同類藥物會產(chǎn)生假陽性 。為了防 止假陽性檢測結(jié)果 , 本實驗先通過保留時間進(jìn)行初步定性

8、, 再 根據(jù)二極管陣列檢測器同步掃描所測得的特征吸收光譜圖進(jìn) 一步定性 , 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品的同步掃描特征吸收光譜在 210、 243和 296nm 有 3個峰值依次變低的吸收峰 。 檢出含鹽酸 克倫特羅的樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液中鹽酸克倫特羅的同步掃描光譜63420018114Chinese Journal of Health Lab oratory T echn ology 2001August 11N o 4完全吻合 , 如圖 2。然后用峰面積進(jìn)行單點或多點校準(zhǔn)法定 量 。(1 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液 (2 檢出鹽酸克倫特羅樣品圖 2 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)與樣品的掃描光譜214 線性 、 精密度與回收

9、試驗 , 2、 表 3。表 1 (20l 濃 度 (g/ml 0. 51. 02. 05. 010. 0峰面積 (mAU 16. 0033. 4863. 00161. 67331. 05 回歸方程為 y =0. 03018X +0. 04667, 相關(guān)系數(shù) r =0. 9999;本方法當(dāng)樣品的取樣量 10ml 時 , 最低檢出濃度為 0. 15g/m L 。表 2 用檢出鹽酸倫特羅的豬尿試樣作重現(xiàn)性實驗的結(jié)果測定次序 123456平均值 標(biāo)準(zhǔn)差 變異系數(shù)濃度 (g/m l 1. 951. 941. 871. 991. 981. 981. 950. 0452. 28%表 3 方法的回收試驗數(shù)據(jù)

10、(濃度單位 :g/ml 樣品號 本底含量 加入量 測定值 回收率 (%020. 330. 500. 8298. 7020. 331. 501. 7897. 2032. 731. 504. 100. 5032. 732. 00100. 821650頭生豬的膀胱作 50份 , 結(jié)果有, 含量范圍為 0. 22. 7g/ml 。參 考 文 獻(xiàn)1 中華人民共和國和國農(nóng)業(yè)部 . NY 438-2001. 飼料中鹽酸克倫特羅 (a-興奮劑 的測定 .2 馮杰 , 吳平谷 . 飼料中克倫羅 (Clenbuterol 的氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用法測定 . 動物營養(yǎng)學(xué)報 ,2000,12(g :48-50.3 趙榕

11、 , 吳國華 , 等 . 反相高效液相色譜法測定豬肝中鹽酸克倫特羅 .中國食品衛(wèi)生雜志 ,2000,12(2 :22-24.4 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典編委會 , 中華人民共和國藥典 ,95版藥典 :629.(上接 438頁 表 2 方法的精密度實驗結(jié)果 (n =6水 樣理論加標(biāo)測定濃度均數(shù) X SRSD (%本底值 濃度 (mg/L (mg/L 未檢出 2. 862. 842. 962. 920. 0461. 6未檢出4. 294. 234. 494. 350. 1022. 3215 方法的準(zhǔn)確度 取兩種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液加到已知水樣中去 , 分別重復(fù)測定 6次回收量 , 并計算回收率 ,

12、見表 3。表 3 回收率實驗結(jié)果 (n =6 水 樣 理論加標(biāo) 回收率 (% 平均回收率 (%本底值濃度 (mg/L 未檢出 2. 86102. 17103. 5102103101. 599. 5103. 5未檢出 4. 29101. 4598. 67102. 67104100104. 6798. 67由表 3可見 , 加標(biāo) 2. 86mg/L 時 , 回收率范圍在 99. 5103.5%之間 , 平均回收率為 102. 17%; 加標(biāo) 4. 29mg/L 時 , 回收率范圍在 98. 67%104. 6%之間 , 平均回收率為 101. 45%。磷質(zhì)是水源污染的重要元素之一 , 準(zhǔn)確 、 快速地測定水源 中磷的污染程度 , 對促進(jìn)水質(zhì)保護(hù)和保障人群的健康有重要 意義 。 我國目前對水中總磷的測定 , 采用鉬酸銨分光光度法 , 該方法雖結(jié)果準(zhǔn)確 、 可信 , 但樣品需進(jìn)行前處理 , 在使用硝酸 高氯酸消解時 , 需在通風(fēng)櫥中加熱 , 高氯酸與有機(jī)物混合經(jīng) 加熱有一定危險性 ; 有些試劑如抗壞血酸需現(xiàn)用現(xiàn)配 , 造成試 劑浪費 , 操作繁瑣 。 我們采用的釩 鉬磷酸比色法 , 具有較高 的準(zhǔn)確度 、 精密度 , 重現(xiàn)性好 , 顯色物穩(wěn)定 , 不受溫度影響 。方 法快速 , 操作簡便 , 安全 , 所用儀器試劑簡單 , 適合基層實驗室 廣泛使用 。參考文獻(xiàn)1 中國標(biāo)準(zhǔn)出