首批還原型谷胱甘肽雜質(zhì)國(guó)家對(duì)照品的研制

1、首批還原型谷胱甘肽雜質(zhì)國(guó)家對(duì)照品的研制王 悅 , 郝蘇麗 , 楊化新 , 范慧紅 (中國(guó)藥品生物制品檢定所 , 北京 100050摘要 : 目的 建立首批還原型谷胱甘肽中氧化型谷胱甘肽雜質(zhì)對(duì)照品 。 方法 以茚三酮試驗(yàn)進(jìn)行鑒別 , 應(yīng) 用液質(zhì)聯(lián)用儀 、 紅外光譜儀對(duì)氧化型谷胱甘肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證 , 反相高效液相色譜法使用 2種流動(dòng)相體系進(jìn) 行純度測(cè)定比較 , 用質(zhì)量平衡法計(jì)算含量 。 結(jié)果 確證了氧化型谷胱甘肽原料的結(jié)構(gòu) , 并確定首批氧化型 谷胱甘肽對(duì)照品含量為 93 6%。 結(jié)論 首批氧化型谷胱甘肽國(guó)家對(duì)照品 (批號(hào) :140746 200801 的建立方 便了還原型谷胱甘肽中氧化型谷胱甘肽

2、雜質(zhì)的定性和定量控制 。關(guān)鍵詞 : 谷胱甘肽 ; 氧化型谷胱甘肽 ; 對(duì)照品 ; H PLC中圖分類號(hào) :R915 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A 文章編號(hào) :1002 7777(2010 03 0248 03Standardization of the National Reference Standard of the Impurity of GlutathioneWang Yue, H ao Suli, Yang H uax in and Fan H uiho ng (Natio nal Institute for the Co ntro l of Pharm aceutical and Biolog

3、 ical Products, Beijing 100050ABSTRACT: Objective To establish the natio nal reference standard fo r o xidized g lutathio ne (GSSG. Methods LC M S and IR Spectrometer w ere used to confir m the structure o f the m aterial. Tw o m obile phases w ere used to determ ine the purity of ox idized g lutath

4、io ne by H PLC, and the content of the product w as calculated by mass balance m ethod. Results T he structure o f the material has been confirm ed, and the content of o xidized glutathione w as 93 6%.Conclusion T he establishm ent of national refer ence standard o f ox idized glutathione can effici

5、ently contr ol the quality and quantity of o xidized g lutathione in g lutathione. KEY WORDS: g lutathione; o xidized g lutathione; natio nal reference standard; H PLC還原型谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨 酸結(jié)合而成的三肽 , 屬于含有巰基的小分子肽類物 質(zhì) , 在生物體內(nèi)有著重要的作用 , 具有抗氧化、清 除自由基、解毒、增強(qiáng)免疫力、延緩衰老、抗癌等 功效 , 是重要的功能因子 1, 在臨床上用于放療及 化療患者、各種低氧血

6、癥、肝臟疾病 , 亦可用于有 機(jī)磷、胺基或硝基化合物中毒的輔助治療。國(guó)內(nèi)現(xiàn) 有 7個(gè)廠家生產(chǎn)谷胱甘肽及其制劑。氧化型谷胱甘肽為還原型谷胱甘肽及制劑中最 主要的雜質(zhì) , 是由 2個(gè)還原型谷胱甘肽以二硫鍵結(jié) 合的產(chǎn)物 , 氨基酸序列 :該雜質(zhì)含量的控制一直以來(lái)都使用還原型谷胱 甘肽自身對(duì)照法 2 3, 由于自身對(duì)照法不能對(duì)雜質(zhì) 定性 , 若樣品中有關(guān)物質(zhì)成分復(fù)雜時(shí) , 就為氧化型 谷胱甘肽的定性及定量帶來(lái)了較大困擾 , 因此迫切 需要氧化型谷胱甘肽對(duì)照品的研制。1 儀器與試藥Waters 液相色 譜儀 (1525泵 , 2487檢測(cè)器 , 717plus 自 動(dòng) 進(jìn) 樣 器 , EM POWER

7、工 作 站 ; Mettler T oledo 電子天 平 ; WRB 1B 數(shù)字熔點(diǎn)儀 ; FEB 115精 密烘 箱 ; M ettler To ledo MP230酸 度 計(jì) ; Thermo Nico let NEXU S FTIR 紅 外光 譜儀 ; Finig an LCQ DECA XP Plus 液質(zhì)聯(lián)用儀 ; Perkin Elmer M odel 343Plus 旋光儀。氧化型谷胱甘肽原料 (北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有 限公司購(gòu)買(mǎi) , Sig ma 公司 生產(chǎn) , CAS 27025 41 8 ; 茚三酮、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、庚烷磺 酸鈉和磷酸均為分析純 ; 甲醇為色譜純 ;

8、 還原型谷 胱甘肽對(duì)照品 (中國(guó)藥品生物制品檢定所 , 批號(hào) :248中國(guó)藥事 2010年第 24卷第 3期作者簡(jiǎn)介 :王悅 , 研究實(shí)習(xí)員 , 碩士研究生 ; T el:(010 67095305; E mail:w angyu ejoygmail com140706 200702 。2 方法與結(jié)果2 1 性狀為白色凍干粉末。2 2 鑒別2 2 1 化學(xué) 鑒別 取待 標(biāo)品 適量 , 加 水制 成約 1m g mL 1的溶液 , 加入茚三酮試液 1滴 , 加熱 , 溶液由淡黃色變?yōu)樗{(lán)紫色。2 2 2 H PLC 法鑒別2 2 2 1 磷酸鹽緩沖液系統(tǒng) RP HPLC 純度分析 2色譜 柱 :S

9、ymm etry Shield RP 18(4 6m m 150mm, 5 m ; 流動(dòng) 相 :0 025m ol L 1磷 酸二 氫鈉溶液 (用 磷酸 調(diào)節(jié) pH 值 至 3 15 ; 檢 測(cè)波 長(zhǎng) :220nm 。將還原型谷胱甘肽對(duì)照品和氧化型谷 胱甘肽待標(biāo)品用流動(dòng)相制成約 1mg mL 1的溶液 , 注入液相色譜儀 , 記錄色譜圖見(jiàn)圖 1、圖 4。待標(biāo) 品溶液主峰保留時(shí)間為 5 072m in, 對(duì)照溶液主峰 保留時(shí)間為 2 949m in, 主峰后最大雜質(zhì)峰保留時(shí) 間為 5 080min, 分離度為 3 23。2 2 2 2 庚 烷磺酸鈉溶 液系統(tǒng) RP HPLC 純度 分 析 3色譜

10、 柱 :Symm etry Shield RP 18(4 6m m 150mm, 5 m ; 流動(dòng)相 :0 01mo l L 1庚烷磺酸 鈉溶液 (取庚烷磺酸鈉 2 2g 和磷酸二氫鉀 6 8g, 加水 1000mL 溶解后 , 加磷酸調(diào)節(jié) pH 值至 3 0 甲醇 (97! 3 為流動(dòng)相 ; 檢測(cè)波長(zhǎng) :210nm, 將 還原型谷胱甘肽對(duì)照品和氧化型谷胱甘肽待標(biāo)品用 流動(dòng)相制成約 1mg mL 1的溶液 , 注 入液相色譜 儀 , 記錄色譜圖見(jiàn)圖 1、圖 5。待標(biāo)品溶液主峰保 留時(shí)間 為 9 618min, 對(duì)照 溶 液 主峰 保 留 時(shí)間 為 4 196m in, 主 峰 后 最 大 雜

11、質(zhì) 峰 保 留 時(shí) 間 為 9 701m in, 分離度為 7 58。a 磷酸鹽緩沖液系統(tǒng) ; b 庚烷磺酸鈉溶液系統(tǒng)。圖 1 還原型谷胱甘肽對(duì)照品色譜圖2 3 結(jié)構(gòu)確證2 3 1 紅外光譜法 采用溴化鉀壓片 ; 待標(biāo)品掃 描次 數(shù) 為 32; 背 景 掃 描 數(shù) 32; 分 離 度 4 000; sam ple g ain 1 0; mirr or velocity 0 6329; Aper ture 100 00。紅外圖譜與標(biāo) 準(zhǔn)圖譜 (Spectr al Database fo r Or ganic Co mpo unds, SDBS No :11258 基本一 致 , 見(jiàn)圖 2 。圖

12、2 待標(biāo)品紅外光譜圖2 3 2 質(zhì)譜法 稱取待 標(biāo)品 , 加水制 成 10 g mL 1的溶液。離子源 :ESI 源 ; 源電 壓 5KV; 毛 細(xì)管電 壓 15V; 鞘氣流速 40arb; 輔助氣流速 5arb; 透鏡電 壓 30V; 掃描方式 :負(fù)離子全掃描 ; 進(jìn)樣 :流動(dòng)注 射進(jìn)樣 30 L m in 1。氧化型谷胱甘肽分子式為 C 20H 32N 6O 12S 2, 相 對(duì)分子量為 612 63, 經(jīng) H PLC M S 分析測(cè)得 其準(zhǔn) 分子離子峰 M H -為 611 0, 因此其相對(duì)分子質(zhì) 量為 612 0, 與理論值一致 , 見(jiàn)圖 3 。圖 3 待標(biāo)品質(zhì)譜圖2 4 檢查2 4

13、1 干燥 失重 105 干燥至 衡重 , 減失 重量 4 5%。2 4 2 比旋度測(cè)定 待標(biāo)品用水配成 40mg mL 1, 20D = 97 5#。2 4 3 熔程 數(shù)字熔點(diǎn)儀預(yù)置溫度為 145 , 調(diào) 節(jié)升溫 速 率 為 1 min 1, 測(cè) 得 待 標(biāo) 品 熔 程 為164 6166 7 。2 4 4 純度分析磷酸鹽緩沖液系統(tǒng) RP H PLC 純度分析。方法 同 2 2 2 1%。將待標(biāo)品用 流動(dòng)相制成 約 1mg mL 1的溶液 , 注入液相色譜儀 , 見(jiàn)圖 4, 用 H PLC 系統(tǒng)工作站對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理 , 用面積歸一化法 計(jì)算出其純度 , 結(jié)果為 98 03%(n =4 。圖

14、 4 磷酸鹽緩沖液系統(tǒng) R P H PL C 色譜圖(下轉(zhuǎn)第 297頁(yè) a 對(duì)照品 ; b 樣品 ; c 水楊酸 ; 1 阿司匹林 ; 2 水楊酸。圖 1 阿司匹林腸溶片 H PL C 色譜圖3 討論由表 2可見(jiàn) , 2種測(cè)定方法的結(jié)果差最高可達(dá) 40%。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中 , 我們根據(jù)液相色譜圖中測(cè)得的供試品溶液中水楊酸的含量 , 在阿司匹林對(duì)照品 溶液添加一定量水楊酸對(duì) 照品 , 使水 楊酸濃度為 2 5mg L 1, 然后測(cè)定添加 前后阿司匹林對(duì)照品 溶液的吸光度 , 結(jié)果吸光度的變化在 5%左右 , 這 說(shuō)明水楊酸不是影響紫外分光光度法測(cè)定結(jié)果嚴(yán)重 偏高的主要因素。不同的廠家使用的不同輔料

15、, 導(dǎo) 致了紫外分光光度法測(cè)定結(jié)果相對(duì)于真實(shí)釋放量不 同程度的偏離 , 影響了實(shí)驗(yàn)者對(duì)阿司匹林腸溶片真 實(shí)釋放量的判斷。另外 , 用紫外分光光度法測(cè)定阿司匹林腸溶片 在緩沖液中的釋放度 , 其吸光度讀數(shù)僅為 0 2左右 , 而供試品溶液的吸光 度以在 0 30 7為宜 , 超出此范圍 , 會(huì)產(chǎn)生較大的誤差 , 使結(jié)果不準(zhǔn)確 , 所以紫外法不符合定量分析的要求。經(jīng)比較 , 高效液相色譜法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性 強(qiáng) , 更適用于小劑量阿司匹林腸溶片在緩沖液中釋 放量的測(cè)定。 參考文獻(xiàn) :1中國(guó)藥典 S 二部 , 2005:284 2842國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn) S WS 10001 (HD 0614 2002,

16、 2002 3何英梅 , 賀軍權(quán) 小劑量阿司匹林腸溶片含量測(cè)定方法商榷 J 中國(guó)藥事 , 2005, 19(2 :25 264趙愛(ài)萍 , 魏曉慧 , 丁太剛 H PL C 法測(cè)定小劑量阿司匹林腸 溶片含量 J 中國(guó)藥師 , 2007, (4 :56 57(上接第 249頁(yè) 庚烷磺酸鈉溶液系統(tǒng) RP H PLC 純度分析。色 譜柱 :方法同 2 2 2 2%, 將待標(biāo)品用流動(dòng)相制成約 1mg mL 1的溶液 , 注入液相色譜儀 , 記錄色 譜圖 , 用 H PLC 系統(tǒng)工作站對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理 , 用面積 歸一化 法計(jì)算 出其 純度 , 結(jié)果 為 99 60%(n =3 , 見(jiàn)圖 5。 圖 5

17、庚烷磺酸鈉溶液系統(tǒng) RP H PL C 色譜圖3 討論&中國(guó)藥典 、 &美國(guó)藥典 、 &英國(guó)藥典 、 &歐 洲藥典 及 &日本藥局方 對(duì)該化合物均無(wú)收載?；诩兌确矫娴目紤] , 我們選擇的待標(biāo)品原料 為 Sigm a 公司生產(chǎn)的氧化型谷胱甘肽。熔程 測(cè)定 結(jié) 果 顯 示 , 該 批 待標(biāo) 品 的 熔 程 為 2 1 , 熔程稍長(zhǎng) , 可能與樣品中雜質(zhì)有關(guān)。 純度使用了 2種流動(dòng)相體系進(jìn)行了分析 , 由圖 3和圖 4可見(jiàn) , 還原型谷胱甘肽對(duì)照品在庚烷磺酸 鈉溶液體系中的保留時(shí)間和雜質(zhì)檢出方面優(yōu)于磷酸鹽緩沖液體系 , 但用該系統(tǒng)分 析氧化型谷胱 甘肽 時(shí) , 峰形對(duì)稱性較差 , 主峰前 沿 (圖 6 , 且 雜質(zhì) 檢出率較低 , 故純度以磷酸鹽緩沖液體系測(cè)定結(jié)果 計(jì) , 為 98 03%。氧化型谷胱甘肽在庚烷磺酸鈉溶液體系中雖然 峰形前沿 , 但主峰保留時(shí)間較磷酸鹽緩沖液體系理 想 , 今后可以更換色譜柱進(jìn)行進(jìn)一步摸索工作。由于氧化型谷胱甘肽國(guó)際上尚無(wú)對(duì)照品 , 經(jīng)研 究 , 含量使用