?；撬嵋种茖?shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)沉積

1、    ?；撬嵋种茖?shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)沉積        摘要目的 研究牛磺酸抗肝纖維化作用。 方法 用四氯化碳（CCl4)制備肝纖維化模型；免疫組化檢測肝、型膠原和透明質(zhì)酸、層粘連素沉積；Northern blot雜交檢測肝、型前膠原、組織金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1) mRNA含量。 結(jié)果 CCl4肝纖維化大鼠肝臟、型膠原、透明質(zhì)酸和層粘連素染色明顯增多；、型前膠原、TIMP-1 mRNA顯著增加。?；撬崽幚淼拇笫螅鲜龈髦笜?biāo)的陽性染色明顯減少，并可明顯抑

2、制、型前膠原基因表達(dá)，而對TIMP-1 mRNA卻無明顯影響。 結(jié)論 牛磺酸對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有保護(hù)作用，可明顯抑制纖維生成與沉積。提示它對防治肝纖維化有一定的臨床意義。關(guān)鍵詞牛磺酸 細(xì)胞外基質(zhì) 前膠原 組織金屬蛋白酶抑制因子-1 基因Taurine inhibites deposition of extracellular matrix in experimental liver fibrosis in ratsCHEN Yuexiang, LI Shi, ZHANG Xingrong, et al.Department of Gastroenterology, Changzhe

3、ng Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200003AbstractObjective To study the effect of taurine on liver fibrosis and its mechanism. Methods Fibrosis was induced by the administration of carbon tertrachloride(CCl4) in rats. Some of the animals were treated with taurine. The rats wer

4、e killed after 12 weeks of CCl4 treatment. Depositions of type , and collages, laminin and hyaluronic acid were studied in liver sections by immunohistochemical technique using specific antibody. The hepatic contents of type , procollage and tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-) mRNA were d

5、etermined by Northern blot hybridyzation. Results A significant elevations of hepatic collagen , , , laminin and hyaluronic acid were observed after 12 weeks of liver injury in animals without taurine treatment, and a definite increase in the amounts of hepatic type , procollagen and TIMP-1 mRNA was

6、 noted. Taurine prevented increases in type , procollagen mRNA expression as well as the accumulation of the collagens, laminin and hyaluronic acid in the liver. Conclusion The data indicate that taurine has a protective effect in CCl4-induced hepatic fibrosis. The results suggest taurine might be o

7、f potential value in clinical practice.Key wordsTaurine Extracellular matrix Procollagen Tissue inhibitor of metalloproteinase-1 Gene我們以前工作發(fā)現(xiàn)，牛磺酸可有效減輕四氯化碳（CCl4）所致大鼠肝纖維化程度，降低肝臟羥脯氨酸含量和透明質(zhì)酸（HA）、層粘連素（LN）水平，改善肝功能。為進(jìn)一步研究牛磺酸抗肝纖維化作用，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)法和Northenr blot雜交技術(shù)觀察其對肝纖維化大鼠細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積的影響。材料和方法一、試劑及動物?；撬幔ê菔?/p>

8、生物化學(xué)試劑廠）；CCl4（宜興市第二化學(xué)試劑廠）；兔抗、型膠原抗體由上海醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供；兔抗LN抗體為本院自制；兔抗HA抗體由張櫓榕博士惠贈；ABC試劑盒為Vector公司產(chǎn)品；異硫氰酸胍、Mops為Watson公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶EcoR、Hind購自華美生物技術(shù)公司；a2()、a2()前膠原cDNA由美國Prockop博士惠贈；組織金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)cDNA由加盒大Edwards博士惠贈；地高辛標(biāo)記及檢測試劑盒為Boehringer-Mannheim公司產(chǎn)品。雌性SD大鼠，135175g，由本校實(shí)驗(yàn)動物中心提供。二、肝纖維化模型制備及其分組將大鼠隨機(jī)分為3組

9、：正常組（8只），CCl4組（16只），?；撬峤M（12只）。采用CCl4制備肝纖維化模型1，即用3/2（V/V）CCl4橄欖油溶液0.3ml/100g體重腹部皮下注射，每周2次，共12周。?；撬峤M在造模開始時(shí)，給予?；撬?，每日250mg/kg背部皮下注射。CCl4組除CCl4外，給予等量生理鹽水。正常組僅給予生理鹽水。各組動物在最后一次CCl4注射后48小時(shí)斷頭處死，取部分右葉肝用體積分?jǐn)?shù)為10%甲醛固定、石蠟包埋或液氮速凍。三、免疫組化染色石蠟包埋塊4m連續(xù)切片或冰凍切片，采用ABC法作免疫組化染色。主要步驟：(1)石蠟切片梯度水化或冰凍切片丙酮固定；(2)加10%正常血清封閉20分鐘；(3

10、)加特異性抗體(一抗）40過夜；(4)加生物素化二抗373分鐘；(5)加ABC試劑（1:100）3740分鐘；(6)1.0mmol/L DAB-H2O2顯色10分鐘；(7)蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。以PBS替代一抗作空白對照，正常血清替代二抗作替代對照，結(jié)果均為陰性。棕褐色為陽性染色。四、Northern blot雜交1.探針制備與標(biāo)記：前膠原a2(I)、a2()和TIMP-1質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增，以堿裂解法抽提，分別用EcoR、Hind酶切后，低溶點(diǎn)膠回收并電泳鑒定。cDNA標(biāo)記按地高辛標(biāo)記試劑盒標(biāo)記。2.總RNA提?。喝∫旱獌龃娓谓M織約500mg，以異硫氰酸胍一步法提取總RN

11、A，核酸蛋白分析儀（DU-600，Beckman）測定其濃度及純度，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。結(jié)果示A值260/A值280為1.82.0，電泳28s和18s區(qū)帶清晰集中，表明所提取之RNA純度良好且未降解。3.Northern印跡轉(zhuǎn)移與雜交：取20g RNA，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳后Northern印跡轉(zhuǎn)移至尼龍膜（QIAGEN），80烘烤2小時(shí)，6×SSC浸泡濕潤后，裝入雜交袋中，加預(yù)雜交液，預(yù)雜交424小時(shí)。棄去預(yù)雜交液，加雜交液（含特異性cDNA探針60100ng/ml）4216小時(shí)。雜交后依次用2×SSC 0.1%SDS、0.1×SSC 0.1%

12、SDS洗，加150mU/ml抗地高辛抗體3730分鐘，加顯色液避光顯色34小時(shí)。水洗后，照相并計(jì)算機(jī)灰度掃描。結(jié) 果一、牛磺酸對ECM沉積的影響用特異性抗體作免疫組化染色來分析纖維化肝臟ECM成分的沉積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射CCl4 12周，肝竇、匯管區(qū)、中央靜脈周圍、型膠原陽性染色較正常肝臟顯著增多（1、2，見插頁）。LN和HA染色也明顯增強(qiáng)，并主要分布于肝竇（3，見插頁）。1CCl4組肝臟I型膠愿免疫組化(ABC100)2CCl4組肝臟IV型膠原免疫組化(ABC100,冰凍切片)3CCl4組肝臟HA免疫組化(ABC100)?；撬嶂委煹拇笫蟾闻K，上述成分的免疫組化陽性染色較CCl4組減少（46，見

13、插頁），表明?；撬峥蓽p少、型膠原和LN、HA在肝臟的沉積。4?；撬峤M肝臟I型膠愿免疫組化(ABC100)5牛磺酸組肝臟IV膠原免疫組化(ABC100,冰凍切片)6?；撬峤M肝臟HA免疫組化(ABC100)二、?；撬釋Α⑿颓澳z原、TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響Northern blot雜交結(jié)果顯示，CCl4組大鼠肝臟、型前膠原mRNA分別較正常組增加5.6、4.40倍。?；撬峤MI、型前膠原mRNA分別增加2.92、2.45倍，其增加的程度均較CCl4組減輕。CCl4組大鼠TIMP-1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)（較正常組增加2.17倍），牛磺酸治療對TIMP-1基因表達(dá)無明顯影響。討 論本實(shí)驗(yàn)觀察到，CC

14、l4注射12周，肝竇、匯管區(qū)、中央靜脈周圍、型膠原較正常肝臟顯著增加，LN和HA亦明顯增多（主要分布于肝竇），且肝臟、型前膠原mRNA表達(dá)增強(qiáng)，分別較正常肝臟增加5.6和4.4倍。?；撬嶂委熆擅黠@減少肝臟、型膠原、LN和HA沉積，、型前膠原mRNA含量也明顯降低。表明牛磺酸能有效抑制纖維生成（fibrogenesis）和沉積。?；撬岬倪@種作用可能與其保護(hù)肝細(xì)胞2，3、抑制貯脂細(xì)胞、成纖維細(xì)胞增殖和膠原等ECM合成4，5以及抑制脯氨酰羥化酶活性6有關(guān)。?；撬峥梢种企w外培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)化生長因子1(TGFb1) mRNA表達(dá)7。在博萊霉素所致大鼠肺纖維化模型上，牛磺酸對TGF1基因表達(dá)亦有

15、顯著抑制作用8。由于TGF11是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要介質(zhì)，因此，?；撬嵋种圃摶虮磉_(dá)可能是其對肝纖維生成與沉積發(fā)揮抑制作用的重要機(jī)理。ECM降解受一系列酶即基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）催化。MMPs包括間質(zhì)膠原酶、明膠酶及基質(zhì)溶解素，其活性可被組織金屬蛋白酶抑制因子（TIMPs）抑制，后者包括TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3，其中TIMP-1主要抑制間質(zhì)膠原酶。近年研究表明，肝纖維化過程中間質(zhì)膠原酶活性明顯下降，而TIMP-1持續(xù)超常表達(dá)則是間質(zhì)膠原酶活性下降的主要原因9。本實(shí)驗(yàn)觀察到，CCl4肝纖維化大鼠存在肝臟TIMP-1 mRNA表達(dá)增加，但?；撬釋IMP-1基因表達(dá)卻無明

16、顯影響，提示牛磺酸不能通過抑制TIMP-1表達(dá)而促進(jìn)纖維降解（fibrolysis），但牛磺酸是否能拮抗TIMP-1的生物學(xué)效應(yīng)抑或促進(jìn)MMPs活性，尚待進(jìn)一步研究。作者簡介:陳岳祥男,36歲,博士,發(fā)表論文30余篇,參編專著3部,主要從事肝細(xì)胞損傷及肝纖維化發(fā)病機(jī)理與防治研究作者單位:陳岳祥李石張興榮張忠兵孔憲濤上海第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院參考文獻(xiàn)1陳岳祥，黃裕新，王慶莉，等. 抗TNFa單抗對實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的影響. 中華消化雜志，1997，17：358-359.2陳岳祥，黃裕新，趙國寧，等. 急性肝損傷大鼠腫瘤壞死因子a含量變化及牛磺酸治療作用的研究. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志，1995，20: 2

17、06-207.3陳岳祥，王慎傳，趙國寧，等. 牛磺酸抗肝臟缺血再灌注損傷及其機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究. 中華醫(yī)學(xué)雜志，1993，73: 276-279.4陳岳祥，李石，范列英，等. ?；撬嵋种拼笫筚A脂細(xì)胞、肝細(xì)胞增殖及前膠原基因表達(dá). 中華肝臟病雜志，1997, 5: 150-153.5陳岳祥，李石，孔憲濤. 牛磺酸對成纖維細(xì)胞增殖及功能的影響. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996, 17: 548-550.6Wang Q, Giri SN, Hyde DM, et al. Amelioration of bleomycin-induced pulmonary fibrosis in hamsters by c

18、ombined treatment with taurine and niacin. Biochem Pharmacol, 1991, 42: 1115-1122.7Studer RK, Craven PA, Dekubertis FR. Antioxidant inhibition of protein kinase C-signaled increases in transforming growth factor-beta in mesangial cells. Metablosim, 1997, 46: 918-925.8Gurjeyalakshmi G, Hollinger MA, Giri S