腫瘤細胞培養(yǎng)方法和培養(yǎng)基

1、1、 RPMI-1640+10%胎牛血清培養(yǎng)基2、 DMEM+15%胎牛血清培 養(yǎng)基培養(yǎng)基成分:成分PRMI-1640mg/L )DMEM(mg/L )fit鬣酸20084天冬酰搬50天冬氮酸20胱氨酸48半胱氮酸50谷氨酸20谷氨酰胺300584甘氨酸10301542輕脯氨酸20異亮氮酸50104.8亮氮酸50104.8賴氮酸40146.2蛋氨酸1530苯丙氨酸1566脯氨酸20成分表3042培養(yǎng)基肝癌細胞培養(yǎng)蘇氨隈20952色氨酸516酪氨酸2072緘氨酸2093.6生物素0.20.254氯化膽堿34葉酸14肌醉357+2菸酰胺14實驗前準備工作操作者的皮膚、培養(yǎng)瓶的蓋和外壁常用酒精消毒。

2、用紫外線消毒實驗室空氣、工 作臺面和一些不能使用其他方法消毒的培養(yǎng)器皿。進無菌室前或做完實驗后，均 應幵燈照射30min進行消毒。紫外線照射60min可以消滅空氣中大部分細菌。1、玻璃器皿的清洗滅菌(5%鹽酸溶液、重鉻酸鉀120ml、硫酸200ml、蒸餾水200ml):(1)浸泡:新使用或重復使用的玻璃器皿須經5%鹽酸溶液或自來水浸泡過夜或 煮沸30min，水洗。以去除新購進玻璃器皿所帶有灰塵、鉛、砷等物質，并消除 其弱堿性。(2) 刷洗:浸泡后用軟毛刷和優(yōu)質的洗潔精進行刷洗。刷洗后經行烘干。(3) 酸浸:刷洗后的玻璃制品酸浸前須適當晾干或烘干，以免造成酸浸液稀釋，影響效果。將玻璃制品完全浸泡

3、入清潔液中24h。清潔液具有極強酸蝕作用，操作過程需戴防護用具。(4) 沖洗、烘干備用:浸酸后的玻璃器皿先用自來水充分沖洗，吸管需沖洗10min，器皿需每瓶灌滿自來水、倒掉反復10次以上，不留任何酸浸液殘跡，然后用蒸餾水漂洗23次，將清洗好的玻璃器皿放入烘干箱中，烘干后的玻璃器 皿要求干凈透明，無油煙，不能殘留任何有害物質及化學藥品等。（5）包裝滅菌:器材經清洗烤干或晾干后，先應嚴格包裝，然后再行消毒滅菌處 理，以防止消毒滅菌后再次遭受污染。包裝材料常用包裝紙、牛皮紙、硫酸紙、 棉布、鋁飯盒、玻璃或金屬制吸管筒、紙繩等。2、橡膠制品清洗消毒：L NaOH煮沸15分鐘，流水沖洗，L HCI煮沸1

4、5分鐘，流水沖洗，自來水煮沸2次，蒸餾水煮沸20分鐘，50C烤干備用3、塑料制品的清洗消毒（瓶蓋、離心管） ：使用器皿后立即用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50C清洗液刷洗，流水沖洗，晾干，浸于清潔液15分鐘，流水沖洗（1520遍）,蒸餾水浸洗 三次，雙蒸水泡24小時，晾干備用。三、細胞復蘇：凍存細胞保存管保存在液氮中（-196C），取出保存管后必須快速冷凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，致使細胞死亡。在凍存細胞的保存管中含有對 細胞有毒害的成分DMSO故在解凍應馬上將其去除。在冷凍活化前應在無菌臺上 將細胞培養(yǎng)液配好，然后將保存管從液氮中取出，放于37C的溫水中快速使細胞解凍

5、。解凍后懸液快速移入培養(yǎng)液中混勻，離心去掉上清液，再加入細胞培養(yǎng) 液。實驗人員穿上無菌實驗室操作服用酒精噴于手上消毒，然后就位用酒精棉球擦拭 實驗臺（1）取一15ml離心管用滴管在其內滴加5-9mI培養(yǎng)液（取8ml）。（2）從液氮罐中取出凍存管，并迅速放入37C水浴，不時搖動，使其急速融化，3060s內完成 （3）凍存管用70酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液轉移入上述 離心管中（用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來） 。（4）低速離心（1000rmin） 5min，去上清后再用8ml培養(yǎng)液再清洗離心一次。（5） 離心后倒掉上清液，在離心管中滴加3ml培養(yǎng)液（RPMI-16

6、40）,混勻（可 用滴管輕柔吹打） 。（6） 將離心管中的混合液轉移到培養(yǎng)瓶中，并在培養(yǎng)瓶中滴加15滴10%小牛血清，蓋上瓶蓋，標好細胞種類和日期、培養(yǎng)人姓名等，將培養(yǎng)瓶平放，置于37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換一次培養(yǎng)基。四、細胞傳代： 當觀察到培養(yǎng)瓶中細胞鋪滿度為90%時（細胞生長處于對數期時） ，解凍復活成功 后的細胞要進行分離培養(yǎng)，否則細胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙， 影響細胞生長。細胞由原培養(yǎng)瓶內分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的過程稱之 為傳代培養(yǎng)。傳代細胞細胞株的最大利處在于提供了大量持久的實驗材料，便于 實驗。（1） 試驗臺的消毒工作準備好，棄去舊培養(yǎng)液，用PBS液（不含

7、鈣，鎂離子）洗1-2次，以免剩余培養(yǎng)液影響胰蛋白酶活性。 （細胞貼壁生長） 。（2）向瓶內加入1ml消化液（怕，置于37C孵箱或室溫（25C溫度）下進行消 化，1-3min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現胞質回縮、細胞間 隙增大后，應立即中止消化（將培養(yǎng)瓶翻轉過來，以保證細胞沒有脫壁） 。備注：若細胞沒有脫壁，生長良好，則直接倒掉消化液，加培養(yǎng)液8ml，離心收 集細胞；若發(fā)現很多細胞已解離已脫壁（即解離過度） ，則直接加培養(yǎng)液進行離心收集細胞。(4)倒出消化液，向瓶內用滴管加入培養(yǎng)液少量(約2ml),輕輕轉動培養(yǎng)瓶， 把殘留胰蛋白液消化液沖掉，然后再加3ml培養(yǎng)液+15滴小牛血清。(

8、5)使用吸管，吸取瓶內培養(yǎng)液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁 脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。(6)將準備好的細胞懸液轉入離心管中，離心(1000rmin) 5min。(7)將離心后離心管中液體倒掉，在離心管中加入3ml培養(yǎng)液，并反復吹打細胞，制成細胞懸液。(8)取3個無菌培養(yǎng)瓶，酒精棉球擦拭消毒，并在酒精燈下過火消毒。(9)在培養(yǎng)瓶中各加入1ml細胞懸液、2ml培養(yǎng)液(用移液槍) 、15滴小牛血 清，加好后酒精燈下過火加塞。(10)細胞培養(yǎng)換液時間應根據細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般23d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴大

9、培養(yǎng)或 換成維持液。五、細胞凍存： 細胞的凍存最常用的方法是液氮冷凍保存法，主要是加入適量的保護劑緩慢的冷 凍細胞。由于細胞在不加任何保護劑的情況下，細胞內外水分會很快結成冰晶，從而引起一系列不良反應。如細胞脫水使局部電解質濃度升高，PH值改變，部分蛋白質因此變性使細胞內部結構紊亂，溶酶體膜被破壞而放出大量酶將細胞內部 結構破壞。因此在細胞凍存時的關鍵是盡可能減少細胞內水分， 減少細胞內冰晶 的形成， 故凍存時采用甘油或DMSOk保護劑，這兩種物質分子量較小，溶解度大，易穿透細胞，可使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性，對細胞毒害作用 小，梯度慢速冷凍可使細胞內水分滲出細胞外，減少形成冰晶對細胞

10、產生的傷害。細胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術。細胞凍存在-196C液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。(1)選對數增生期細胞(細胞鋪滿度為90%左右時)，在凍存前1d換液。(2)試驗臺的消毒工作準備好，倒掉培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液。(3)向瓶內加入1ml %胰蛋白酶液，以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。(4)置37 C孵箱或室溫(25 C溫度)下進行消化，1-3min后把培養(yǎng)瓶放在倒 置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。(5)吸出消化液，在吸除胰蛋白液后，直接加入3ml培養(yǎng)液+15滴小牛血清，終 止消化。(6)使用彎頭吸管，吸取瓶內培養(yǎng)液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從 瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞，按常規(guī)方 法把培養(yǎng)細胞制備成懸液。(7)將培養(yǎng)瓶中的細胞懸液轉移到15ml離心管中，(1200r/min) 6min，去掉 上清液。再加3ml培養(yǎng)液按常規(guī)方法形成細胞懸液。(8)配制凍存培養(yǎng)液(培養(yǎng)液7ml，10%小牛血清2ml，10%DMSO 1m)，l于離心 管中加入1ml細胞懸液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞 均勻。(9)將細胞懸液分裝入無菌凍