柱離心法小量提取質(zhì)粒DNA及DNA的瓊脂糖凝膠電泳

1、柱離心法小量提取質(zhì)粒DNA及DNA的瓊脂糖凝膠電泳實驗?zāi)康暮鸵螅?、了解質(zhì)粒DNA的應(yīng)用，并學(xué)習(xí)用柱離心法小量提取質(zhì)粒DNA。2、掌握DNA瓊脂糖凝膠電泳的方法。實驗原理：質(zhì)粒是細菌中獨立于染色體之外的較小的環(huán)狀雙鏈DNA，它通常攜帶某種藥物（如氨芐青霉素，卡那霉素，鏈霉素，四環(huán)素等）的抗性基因，具有獨立的復(fù)制原點，并且具有較高的拷貝數(shù)（從幾個到幾百個不等）。柱離心法首先用堿使大腸桿菌裂解，并使其中的DNA（包括質(zhì)粒及細菌的染色體DNA）全部變性。再用酸性緩沖液中和，質(zhì)粒DNA由于分子較小，很快復(fù)性，而染色體DNA分子巨大，幾乎不能復(fù)性，最后和細胞碎片及膜蛋白共沉淀被離心去除，上清液中含有復(fù)

2、性的質(zhì)粒DNA，蛋白質(zhì)，RNA，并且鹽濃度較高。在這種條件下，質(zhì)粒DNA能夠牢固地結(jié)合在離心柱中的吸附基質(zhì)上，而大多數(shù)蛋白質(zhì)和RNA在離心時被穿過，殘留在吸附基質(zhì)上的少量蛋白質(zhì)和RNA可以用漂洗液洗去，最后，吸附在離心柱上的質(zhì)粒DNA用低離子強度的溶液或水洗脫。與蛋白質(zhì)相比，DNA的分子量通常要大得多，必須用孔徑較大的瓊脂糖凝膠介質(zhì)進行分離。在理想的電泳條件下，具有相同構(gòu)型的DNA的電泳遷移率和它們分子量的對數(shù)成線性關(guān)系，分子量相同的質(zhì)粒DNA的電泳遷移率和它們的構(gòu)型有關(guān)，由快到慢通常為超螺旋，線性，開環(huán)和復(fù)制中間體（連環(huán)體）。DNA限制性內(nèi)切酶可以從內(nèi)部切割環(huán)狀或線狀雙鏈DNA，II型DNA

3、限制性內(nèi)切酶具有固定的識別位點和切割位點，它們可以在特定位點以特定方式切割質(zhì)粒DNA，并且產(chǎn)生有固定序列及形狀的末端。因此，它們在重組DNA技術(shù)中具有重要作用。實驗材料：含質(zhì)粒的大腸桿菌DH5； LB+Amp培養(yǎng)基（配方參照分子克隆，除非特別說明，以下同）；柱離心質(zhì)粒小量制備試劑盒（博大泰克公司）；質(zhì)粒DNA（pUC18-G）；電泳用瓊脂糖；TAE緩沖液；goldview熒光染料；6× DNA上樣buffer；限制性內(nèi)切酶EcoRI （10 U/l，GAATTC）；HindIII （10 U/l，AAGCTT）；10× buffer R。實驗方法：1將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌單克

4、隆接種到1.5 ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)1216小時；2 1.5 ml過夜菌轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，10000 rpm( r/min)離心1 min，用水泵吸干培養(yǎng)基上清液，加入100 ml 溶液I(含RNaseA)，充分混勻；3加入150 ml 溶液II，加蓋顛倒6-7次使之混勻，室溫放置12min；4加入150 m l 溶液III，加蓋后顛倒6-7次混勻，室溫放置5min；5用臺式高速離心機，12000 rpm離心10min；6吸附柱中加入420 l 結(jié)合緩沖液，將步驟5中的上清轉(zhuǎn)移至吸附柱中，蓋上收集管的蓋子，混勻， 12000 rpm離心1 min；7取下吸附

5、柱，倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管，向吸附柱中加入600 l 漂洗液 , 靜置1 min，12000 rpm離心30 s；8重復(fù)步驟7一次；9取下吸附柱，倒掉收集管中的液體，吸附柱放回同一收集管， 12000 rpm離心2 min；10吸附柱放入一個新的1.5 ml離心管，在吸附柱的中央加50 l洗脫緩沖液或 TE buffer或水，室溫放置3 5分鐘。蓋好蓋子12000 rpm 離心1分鐘，收集質(zhì)粒DNA溶液，-20凍存?zhèn)溆茫?1在250 ml椎形瓶中稱取0.6 g瓊脂糖，加60 ml 1× TAE buffer，在微波爐中加熱至沸騰且均勻；12往膠溶液中加3 l gol

6、dview熒光染料，混勻，室溫自然冷卻；13制膠板兩頭分別用膠布封好，放置在水平的實驗臺上，將梳齒架在制膠板的梳齒槽內(nèi)，待膠溶液冷至50時，把60 ml膠液全部到入制膠板中，室溫自然冷卻至充分凝固；14撕去封制膠板的膠布，將裝有凝膠和梳齒的制膠板放入電泳槽中，加1× TAE至高過凝膠表面加樣孔頂端2 mm，小心拔出梳齒；15取5 l質(zhì)粒DNA，與1 l 6× DNA上樣buffer混勻后全部加入點樣孔，100 V恒壓電泳至溴酚藍指示劑前沿走到凝膠中間（約需1小時）；16關(guān)閉電泳儀，連制膠板一起取出凝膠，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果并拍照；實驗結(jié)果：實驗現(xiàn)象討論：1、分析影響瓊脂糖電泳遷移率的主要因素：（1）DNA的分子量：質(zhì)粒DNA是不同于染色體DNA的一種分子量較小的DNA，因而遷移率較?。唬?）瓊脂糖濃度：上網(wǎng)查得：