2012CB518600-G基于微血管病變性疾病的營衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會生化”研究_修正版

1、修正版項目名稱:基于微血管病變性疾病的營衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會生化”研究首席科學(xué)家:吳以嶺河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司起止年限:2012.1-2016.8依托部門:國家中醫(yī)藥管理局河北省科技廳、關(guān)鍵科學(xué)問題及研究內(nèi)容1. 擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題闡明營衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會生化”異常與微血管物質(zhì)一能量一信息紊亂相關(guān)性，揭示AMI無再流、急性腦梗死、DN異病同治的共性病理機制，闡明心血管事件鏈級聯(lián)反應(yīng)的微血管內(nèi)在機制,尋求微血管病變性疾病異病同治及阻斷心血管事件鏈的有效治療新途徑，創(chuàng)新發(fā)展脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會生化” 理論。2主要研究內(nèi)容2.1營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常與 孫絡(luò)徹血管”物質(zhì)-能量-

2、信息網(wǎng)絡(luò)紊亂相關(guān)性及微觀病理特征研究深入研究營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常，闡明以微血管EC為核心和啟動 因素、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)與血液細胞共同參與、臟腑組織細胞功能結(jié)構(gòu)損傷、多維時 空動態(tài)演變的“孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息紊亂的復(fù)雜病理過程，為闡明微血 管病變性重大疾病的共性機制與級聯(lián)反應(yīng)的內(nèi)在機制、尋找有效干預(yù)策略和治療 方藥提供實驗數(shù)據(jù)支持。既往研究通過臨床3469例血管病變患者臨床調(diào)查總結(jié)出的脈絡(luò)病變八類臨 床證候類型，本項目借助現(xiàn)代實驗條件，深入探討脈絡(luò)病變辨證論治中臨床證候類型脈絡(luò)瘀阻、脈絡(luò)絀急、脈絡(luò)瘀塞、絡(luò)息成積的孫絡(luò)-微血管”微觀病理特 征：孫絡(luò)瘀阻（微血栓、栓塞、組織水腫壓迫管

3、腔狹窄、閉塞等）、孫絡(luò)絀急（微 血管痙攣）、孫絡(luò)疏失（缺血組織微血管密度降低、數(shù)目減少及微血管EC凋亡、 緊密連接破壞，通透性異常增加等）、孫絡(luò)滋生（易損斑塊中病理性血管新生等）2.2探討微血管病變損傷心腦腎導(dǎo)致 AMI無再流、急性腦梗死、DN異病同治的共性病理機制圍繞心肌灌注單元”新概念，闡明微血管 EC損傷及神經(jīng)體液調(diào)節(jié)異常在AMI無再流和再灌注損傷中的核心機制。以腦微血管結(jié)構(gòu)功能與血腦屏障相關(guān) 性及其與腦組織細胞相互作用關(guān)系為核心， 觀察腦梗死不同階段腦影像學(xué)動態(tài)演 變規(guī)律，揭示既往提出的 缺血區(qū)微血管保護一腦梗死治療新靶點”的科學(xué)內(nèi)涵。揭示DN細胞外基質(zhì)增生、間質(zhì)纖維化、足細胞損傷的微

4、血管發(fā)病機制為通絡(luò)干 預(yù)的異病同治提供實驗數(shù)據(jù)及理論支持。2.3揭示易損斑塊、AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件鏈微血管病變的內(nèi)在機制以VEGF為靶點，探討動脈硬化斑塊病理性血管滋生及淋巴管與斑塊易損性的相關(guān)機制。揭示 AMI心肌缺血對電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)、神經(jīng)重構(gòu)等導(dǎo)致心律失常的發(fā)病機制。揭示心肌微循環(huán)障礙、能量代謝障礙、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)異常在心 力衰竭中的作用，闡明微血管和心肌細胞之間的物質(zhì)、 能量和信息網(wǎng)絡(luò)的改變?yōu)?通絡(luò)藥物干預(yù)阻斷心血管事件鏈提供實驗支持。2.4通絡(luò)藥物的藥效物質(zhì)、作用機制及臨床研究選擇通絡(luò)代表性藥物通心絡(luò)、參松養(yǎng)心及芪藶強心膠囊，通過復(fù)方中藥的化 學(xué)物質(zhì)組系統(tǒng)分離，結(jié)合多維

5、多息指紋圖譜等組效化學(xué)分析方法， 圍繞臨床療效 特點建立多指標活性篩選方法，初步闡明其不同類別物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。 采用 隨機雙盲、對照、多中心研究方法，開展參松養(yǎng)心膠囊治療室性早搏伴心功能不 全、芪藶強心膠囊治療慢性心力衰竭的臨床循證評價。二、預(yù)期目標1. 總體目標圍繞營衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會生化”異常引起滲灌氣血、濡養(yǎng)代謝、津血互換 障礙與“孫絡(luò)-微血管”多維時空動態(tài)演變的物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂的相關(guān)性， 闡明AMI無再流、腦梗死、DN的共性病理機制，揭示易損斑塊、AMI、心律失常、 心力衰竭心血管事件鏈的內(nèi)在機制， 尋找有效干預(yù)策略，明確通絡(luò)方藥異病同治 不同微血管病變性重大疾病、有效阻斷

6、心血管事件鏈的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制，創(chuàng) 新發(fā)展脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會生化”理論，提高上述重大疾病臨床防 治水平。2. 五年預(yù)期目標2.1闡明營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常導(dǎo)致滲灌氣血、濡養(yǎng)代謝、津血互換障 礙與 孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂的相關(guān)性。探討宏觀證候類型的 孫 絡(luò)-微血管”微觀病理改變，借助理化實驗手段，闡明孫絡(luò)滋生、疏失、瘀阻、 絀急病理改變的微觀特征。2.2揭示孫絡(luò)-微血管”病變損傷心腦腎導(dǎo)致AMI無再流、急性腦梗死、DN異病同治的共性病理機制：建立心肌灌注單元”新概念，明確微血管EC損傷”在AMI再灌注后心肌無再流和再灌注損傷產(chǎn)生中的核心作用并揭示通絡(luò)干預(yù)作用

7、機制； 以腦微血管結(jié)構(gòu)與功能研究為核心， 在整體動物與離體細胞實驗，闡明急性腦梗 死微血管結(jié)構(gòu)功能及血腦屏障損傷的動態(tài)病理演變規(guī)律，圍繞神經(jīng)血管單元探討 通絡(luò)干預(yù)腦梗死的微血管作用機制，發(fā)展腦微血管EC介導(dǎo)的腦神經(jīng)保護技術(shù)平 臺；闡明糖尿病微血管損傷所致腎小球系膜基質(zhì)增生、 足細胞損傷及腎間質(zhì)纖維 化的發(fā)病機制及通絡(luò)藥物干預(yù)作用。2.3揭示易損斑塊、AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件鏈微血管病變的內(nèi)在機制：揭示斑塊內(nèi)新生血管、新生淋巴管及二者協(xié)同在斑塊易損中的作用，闡明抑制VEGF-A和VEGF-C的表達在抑制斑塊內(nèi)微循環(huán)，穩(wěn)定斑塊中的機制及通 絡(luò)干預(yù)作用，揭示斑塊內(nèi)血管新生與缺血組織微血管

8、減少的內(nèi)在機制；闡明AMI電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)、神經(jīng)重構(gòu)導(dǎo)致心律失常的發(fā)病機制及通絡(luò)干預(yù)作用，探討心衰與心律失常相互影響及通絡(luò)藥物干預(yù)作用；闡明心肌微循環(huán)障礙、能量代謝與信息調(diào)控異常對心力衰竭發(fā)病的影響，明確心肌缺血所致心臟重構(gòu)對心力衰竭發(fā) 生發(fā)展的影響機制，探討通絡(luò)藥物防治心力衰竭的作用。2.4初步闡明通心絡(luò)保護缺血再灌注損傷微血管、參松養(yǎng)心快慢兼治心律失常、芪藶強心膠囊標本兼治慢性心衰的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制；為參松養(yǎng)心治療室 性早搏伴心功能不全、芪藶強心治療慢性心力衰竭提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。2.5創(chuàng)新發(fā)展脈絡(luò)學(xué)說營衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會生化”理論，培養(yǎng)高層次脈絡(luò)病變 基礎(chǔ)與臨床研究隊伍，發(fā)表論文 1

9、20-140篇，其中SCI、El收錄60篇左右，申請專利5項左右，主辦國際學(xué)術(shù)會議3-5次，擴大國際學(xué)術(shù)影響力，國內(nèi)學(xué)術(shù)會 議5次，培養(yǎng)博士、碩士研究生 70-80人。3五年預(yù)期取得的進展、突破及科學(xué)價值3.1理論創(chuàng)新一一創(chuàng)新發(fā)展脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi)由絡(luò)以通、交會生化”理揭示營衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會生化”異常引起滲灌氣血、濡養(yǎng)代謝、津血互 換障礙與“孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂的相關(guān)性，闡明以微血管EC 為核心和啟動因素、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)與血液細胞共同參與、臟腑組織細胞功能結(jié)構(gòu)“由損傷、多維時空動態(tài)演變的“孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息紊亂的復(fù)雜病理變 化，揭示脈絡(luò)病變宏觀臨床證候類型的 “孫絡(luò)-

10、微血管”病變微觀病理改變，闡 明孫絡(luò)絀急、瘀阻、滋生、疏失的微觀病理特征，創(chuàng)新發(fā)展脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi) 絡(luò)以通、交會生化”理論。3.2治療創(chuàng)新開辟微血管病變性重大疾病的異病同治及阻斷心血管事件鏈的通絡(luò)治療新途徑通過研究營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常與 孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng) 絡(luò)紊亂對心、腦、腎重要臟器的影響，揭示 AMI無復(fù)流、急性腦梗死、DN的共性病理機制，闡明易損斑塊、AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件鏈的內(nèi)在 機制，繼承創(chuàng)新中醫(yī)通絡(luò)干預(yù)及治療方藥的特色優(yōu)勢，開辟微血管病變性重大疾 病的異病同治及阻斷級聯(lián)反應(yīng)病理進程的通絡(luò)治療新途徑。3.3模式創(chuàng)新創(chuàng)建源于經(jīng)典、基于臨床、創(chuàng)新理論、研

11、發(fā)新藥、提高療效”的中醫(yī)藥發(fā)展新模式 本項目將基礎(chǔ)實驗研究、臨床循證評價、藥效物質(zhì)與作用機制研究有機結(jié)合， 創(chuàng) 新發(fā)展脈絡(luò)學(xué)說營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”理論，闡明通絡(luò)方藥的物質(zhì)基礎(chǔ)與作 用機制，采取國際公認又體現(xiàn)中醫(yī)特色的隨機雙盲、 多中心循證研究，客觀評價 通絡(luò)方藥的臨床療效，為提高心腦血管病、 DN、心律失常、心力衰竭等重大疾 病的臨床防治水平提供理論指導(dǎo)和有效藥物， 為探索現(xiàn)代高科技條件下的中醫(yī)藥 創(chuàng)新發(fā)展模式提供有益借鑒。三、研究方案（一）總體研究思路、技術(shù)路線及可行性分析1項目假說營衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會生化”異常引起滲灌氣血、濡養(yǎng)代謝、津血互換障礙 與多維時空動態(tài)演變的“孫絡(luò)-微血管”

12、物質(zhì)一能量一信息紊亂密切相關(guān)，是心 腦血管病及DN發(fā)展加重的共性病理機制，也是心血管事件鏈的內(nèi)在機制，通絡(luò) 干預(yù)可對微血管病變性重大疾病進行異病同治，也可有效阻斷心血管事件鏈。2總體研究思路以源于經(jīng)典、基于臨床、創(chuàng)新理論、研發(fā)新藥、提高療效 ”為指導(dǎo)思想，在 既往系統(tǒng)構(gòu)建脈絡(luò)學(xué)說，系統(tǒng)研究脈絡(luò)病變發(fā)病規(guī)律、臨床證候類型及辨證治療, 從營衛(wèi)交感與血管內(nèi)皮-中膜-外膜相互影響闡明血管病變病理演變及防治規(guī)律基礎(chǔ)上，進一步圍繞營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常所致滲灌氣血、濡養(yǎng)代謝、 津血互換障礙與多維時空動態(tài)演變的孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂相 關(guān)性，結(jié)合微血管病變影響心、腦、腎主要臟器而導(dǎo)致

13、的重大疾病，吸取現(xiàn)代微循環(huán)研究可視化動態(tài)成像、彩色微球、核素掃描、聲學(xué)造影等先進技術(shù)手段，闡 明以微血管EC為核心和啟動因素、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)與血液細胞參與的、臟腑組織細胞功能結(jié)構(gòu)損傷的、多維時空動態(tài)演變的孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)交換、能量代謝 及信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)紊亂的復(fù)雜病理變化規(guī)律。探討脈絡(luò)病變宏觀臨床證候類型的孫絡(luò)-微血管”病變微觀病理改變，揭示孫絡(luò)絀急、瘀阻、滋生、疏失的微觀病 理特征，揭示AMI無再流、急性腦梗死、DN異病同治的共性機制，闡明易損 斑塊、AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件鏈的內(nèi)在機制。尋求異病同治微血管病變性重大疾病及阻斷心血管事件鏈的通絡(luò)干預(yù)策略和藥物，探討通絡(luò)方藥的 物質(zhì)基礎(chǔ)

14、與作用機制，創(chuàng)新發(fā)展脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”理論，提 高微血管病變性重大疾病的臨床防治水平。項目總體學(xué)術(shù)思想營在脈中，衛(wèi)在脈外"內(nèi)經(jīng)血脈相傳，壅塞不通"金匱要略L營衛(wèi)不通，血凝不流”傷寒論損其心者，調(diào)其營衛(wèi)”難經(jīng)揭示營衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會生化”異常 孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂相關(guān)性心血管事件鏈內(nèi)在機制創(chuàng)新發(fā)展脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi)由絡(luò)以通、交會生化理論3. 項目研究的技術(shù)路線技術(shù)途徑以源于經(jīng)典的脈貉學(xué)說營衛(wèi)理論為指導(dǎo)基于臨床、創(chuàng)新理論、提高療效項目假說基礎(chǔ)實驗研究臨床循證評價藥效物質(zhì)研究整體、器官、組織，細胞，分子微血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)、血液細胞、臟瞞組

15、織細胞功能結(jié)構(gòu)輛巔-能屋-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂 異病同治英性機制 乜晰級聯(lián)反應(yīng)內(nèi)在機%/闊機雙肓、爹中心0證詡究參松養(yǎng)心治抒室早伴心功能不全臨床研究蔑苗強心治抒慢性亡衰黑蜒分離，仿生酶解、光譜、色倍技術(shù)通心貉腔S參松養(yǎng)心膠*萬苗強心膠It主要有效組分或成廿 件用機制N數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)整合創(chuàng)新發(fā)展營衛(wèi)“由絡(luò)以通，交會生化”理論3.1基礎(chǔ)實驗研究3.1.1營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常與微血管病變相關(guān)性及微觀病理特征研究采用可視化動態(tài)成像、彩色微球、轉(zhuǎn)錄因子芯片、基因啟動子芯片等先進技術(shù)手段，闡明以微血管EC介導(dǎo)的、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)與血液細胞參與的、臟腑組織細胞功能結(jié)構(gòu)損傷的、多維時空動態(tài)演變的孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)

16、交換、能量代謝 及信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)紊亂的復(fù)雜病理演變規(guī)律。采用兔心導(dǎo)管介入冠狀動脈封堵、麥 角新堿冠脈注射、月桂酸鈉注射建立孫絡(luò)滋生和孫絡(luò)疏失、孫絡(luò)絀急、孫絡(luò)瘀阻 模型。應(yīng)用活體微循環(huán)、定量放射自顯影、血管內(nèi)超聲顯像系統(tǒng)、冠脈造影技術(shù)等觀察微血管形態(tài)、通透性及血流變化，電鏡觀察微血管EC超微結(jié)構(gòu)，采用生孫絡(luò)-微血管”病變化、Western blot、免疫組化檢測與EC通透性、緊密連接、凋亡相關(guān)因子及血管活性物質(zhì)水平和表達，探討脈絡(luò)病變宏觀臨床證候類型的 孫絡(luò)絀急、瘀阻、滋生、疏失的微觀病理特征。營衛(wèi)壹'由絡(luò)以通，交會生化”異常與"孫絡(luò)一微血管 物質(zhì)一能量一信息紊亂相關(guān)性研究潼遷三

17、血，J物質(zhì)交換 穗、脂.£白質(zhì)交換能量代謝Oj, COjHNa*、K*信息調(diào)控神經(jīng)怵；15調(diào)節(jié)*倍號轉(zhuǎn)昌途徑與. 轉(zhuǎn)導(dǎo)分子.轉(zhuǎn)錄S子以微血管EC為核心和啟動因盍.神經(jīng)休液調(diào)節(jié)與血液細胞*同蔘與、臟腑組織細胞功能結(jié)構(gòu)損傷、多維時空動態(tài)演變的孫絡(luò)-微血管物質(zhì)-能1-倍息紊亂的復(fù)雜病理過程.物質(zhì)一能量一信息血管內(nèi)皮細厭代謝，津血3.1.2微血管病變損傷心腦腎重要臟器導(dǎo)致 AMI無再流、急性腦梗死、DN異病同治的共性病理機制研究采用高血脂和糖尿病引起 EC損傷基礎(chǔ)上建立豬AMI再灌注損傷模型，采用心臟導(dǎo)管、心臟超聲、彩色微球、病理、分子生物學(xué)方法研究AMI無再流與再灌注損傷的微血管EC、心肌

18、灌注單元保護的分子機制及信號調(diào)節(jié)機制。采用激光多普勒、激光散斑血流視頻監(jiān)測進行定點腦血流、區(qū)域內(nèi)腦血流檢測，采用免疫組化觀察腦微血管結(jié)構(gòu)、功能特征性改變；對腦微血管EC、神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞對腦微血管調(diào)節(jié)作用的研究，觀察腦微血管EC與神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞相互關(guān)系；應(yīng)用核磁、PET-CT等影像技術(shù)，觀察腦梗死患者梗死灶和缺血半 影區(qū)的神經(jīng)-血管形態(tài)、生化與功能變化特征。從整體、器官、細胞、分子水平采用可視化連續(xù)性微循環(huán)觀察系統(tǒng)、Western-blot、RT-PCR、血清藥理學(xué)、共聚焦激光掃描電鏡等技術(shù)，研究DN微血管血流動力學(xué)異常和EC功能障礙、腎小球細胞外基質(zhì)增生、腎小球足細胞損 傷、腎小管上皮細胞

19、轉(zhuǎn)分化發(fā)病機制。闡明通絡(luò)藥物對微血管病變性重大疾病異 病同治的作用機制。3.1.3易損斑塊、AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件鏈微血管病變的內(nèi)在機制研究通過高脂喂養(yǎng)的apoE-/-小鼠AS模型，觀察新生血管、淋巴管與斑塊易損性 的關(guān)系；以VEGF靶點體內(nèi)轉(zhuǎn)染病毒載體介導(dǎo)的VEGF-RNAi或/和VEGF-C-RNAi，觀察斑塊內(nèi)微循環(huán)、病變進程及斑塊易損性的變化；體外培養(yǎng)血管EC和淋巴管EC,給予 VEGF或/和 VEGF-C過表達、VEGF-RNAi或/和VEGF-C-RNAi，觀察通絡(luò)干預(yù)對血管EC和淋巴管EC功能及其下游信號通路分 子的表達。應(yīng)用高脂喂養(yǎng)的 ap oE-/-小鼠制備動脈

20、粥樣硬化易損斑塊和心肌梗死 并存的復(fù)合動物模型，觀察新生血管和淋巴管與斑塊易損性以及斑塊內(nèi)孫絡(luò)滋生 與缺血心肌孫絡(luò)疏失的內(nèi)在機制，在同一生物體內(nèi)同步觀察通絡(luò)藥物對缺血心肌 和易損斑塊內(nèi)微血管不同變化的雙向調(diào)控的分子機制。建立AMI兔模型，采用高頻超聲診斷儀、導(dǎo)管、超聲造影檢測血流動力學(xué)、心功能及心肌灌注情況；采用免疫組化、PCR、Western-blot等方法觀察AMI對微血管功能、心肌細胞電傳導(dǎo)、神經(jīng)重構(gòu)、心肌重構(gòu)的影響及通心絡(luò)、參松養(yǎng)心膠囊的治療作用。選取RGS5基因敲除小鼠和心臟特異性 RGS5轉(zhuǎn)基因小鼠建立AMI模型，應(yīng)用電生理、膜片鉗技術(shù)、激光掃描共聚焦顯微鏡等觀察通心絡(luò)、 參松養(yǎng)心

21、膠囊對RGS5轉(zhuǎn)基因及基因敲除小鼠心肌梗死模型心電生理的影響。離體培養(yǎng)乳鼠微血管 EC和冠狀動脈結(jié)扎小鼠模型自構(gòu)建慢性心力衰竭模型，采用形態(tài)學(xué)、電生理、激光多普勒、超聲等技術(shù)，觀察機械負荷、神經(jīng)體液因子對EC結(jié)構(gòu)功能的影響，不同病理階段微血管分布數(shù)量、EC和心肌結(jié)構(gòu)功能變化及心肌代謝的影響。闡明通絡(luò)藥物阻斷心血管事件鏈的內(nèi)在機制。3.2臨床循證評價采取國際公認又能體現(xiàn)中醫(yī)特色的循證醫(yī)學(xué)臨床研究方法，藥物設(shè)盲、數(shù)據(jù) 管理和統(tǒng)計分析由第三方統(tǒng)計單位具體實施， 開展參松養(yǎng)心膠囊治療室性早搏伴 心功能不全、芪藶強心膠囊治療慢性心衰臨床評價，為臨床提供療效確切的治療 藥物。3.3通絡(luò)藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作

22、用機制研究針對通絡(luò)代表性藥物通心絡(luò)、參松養(yǎng)心、芪藶強心膠囊，植物藥采用系統(tǒng)分 離、光譜、色譜技術(shù)，動物藥采用仿生酶解、膜分離、葡聚糖凝膠篩分技術(shù)進行 分離確定多活性組分，圍繞臨床療效特點通過離體、在體模型進行藥效篩選，初 步闡明其不同類別物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制4取得重大突破的可行性分析4.1具有取得重大突破的絡(luò)病理論、臨床、藥物及廣泛的學(xué)術(shù)基礎(chǔ)項目主持人30余年始終致力于絡(luò)病理論及其臨床應(yīng)用研究，首次系統(tǒng)構(gòu)建絡(luò)病證治”和 脈絡(luò)學(xué)說”理論體系，為絡(luò)病學(xué)學(xué)科建立奠定了理論基礎(chǔ)，以絡(luò)病理論為指導(dǎo)開辟心腦血管病、心律失常、慢性心力衰竭治療新途徑，研制的治療心腦血管病的通心絡(luò)膠囊、治療心律失常的參松養(yǎng)心膠囊

23、、治療慢性心力衰竭的芪藶強心膠囊等國家專利新藥均在基礎(chǔ)與臨床循證醫(yī)學(xué)研究中取得良好療效。中醫(yī)絡(luò)病學(xué)學(xué)科正式建立并成為國家中醫(yī)藥管理局重點與優(yōu)勢學(xué)科，絡(luò)病學(xué)教 材在全國40余家及國外新加坡高等醫(yī)學(xué)院校開課，建立了中華中醫(yī)藥學(xué)會絡(luò)病 分會和十多省絡(luò)病專委會，形成了上千人的絡(luò)病研究專家隊伍，具備本項目取得 創(chuàng)新性突破的理論、臨床、藥物及廣泛的學(xué)術(shù)基礎(chǔ)。4.2本項目與原973項目具有延續(xù)性和創(chuàng)新性在既往973項目研究中首次提出中醫(yī)經(jīng)脈理論包括經(jīng)絡(luò)和脈絡(luò)，系統(tǒng)構(gòu)建了對心腦血管等重本項目與原973項目具有延續(xù)性與創(chuàng)新性大疾病具有指導(dǎo)價值的脈絡(luò)學(xué)說，提出了脈絡(luò)系統(tǒng)構(gòu)建脈絡(luò)學(xué)說母S衛(wèi)交®異融電與內(nèi)J

24、S-中腫相互卑響、縮窄學(xué)說的核心理論營衛(wèi)承制調(diào)平，揭示了營氣與血管內(nèi)皮、衛(wèi)心悸,營衛(wèi)"由貉以通、交會生|;”異常,1r.1心水rL心律失常1r管事件鏈肉左機制1慢性心袞創(chuàng)新貫展脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi)“由絡(luò)以通、交會生化”理論急性腦梗詛性心梗無再流 a尿病腎病氣與血管外膜及NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性,從營衛(wèi)交感異常與內(nèi)皮-中膜-外膜”相互影響全面深刻的揭示了血管病變由外到內(nèi)(Outside-in)與由內(nèi)到外(In side-out)的發(fā)病機制，通心絡(luò)穩(wěn)定易損斑塊研究發(fā)表在Am J Physiol Heart Circ Physiol雜志，被評價為 傳統(tǒng)中醫(yī)藥對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的挑戰(zhàn)”，本研究為未來可能發(fā)展成冠心

25、病事件的高?；颊唿c燃了希望之燈”；提出 微血管病變”為AMI無再流、急性腦梗死、糖尿病微血管并發(fā)癥的共性核心機制，開展的基礎(chǔ)與臨床研究證實了脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi)理論重要的臨床指導(dǎo)價值?；?469例血管病變患者臨床調(diào)查制定脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”辨證診斷標準，提出八類臨床證候類型和辨證治療，為本項目圍繞假說深入開展研究奠定了良好的工作基礎(chǔ)。本項目以脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi)理論為指導(dǎo)， 界定營衛(wèi)交會與交感概念的不同，圍 繞營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常導(dǎo)致的滲灌氣血、濡養(yǎng)代謝、津血互換障礙與孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂的相關(guān)性，揭示 AMI無再流、急性腦梗死、DN等微血管病變性重大疾病異病同治的共性機制，

26、闡明易損斑塊、AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件鏈的內(nèi)在機制，尋找有效干預(yù)策略和治療藥物,創(chuàng)新發(fā)展營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”理論，不僅體現(xiàn)了原973項目研究的延續(xù)性,使中醫(yī)經(jīng)典的營衛(wèi)理論及通絡(luò)藥物在微血管病變性重大疾病治療中發(fā)揮指導(dǎo)作用，更增加了脈絡(luò)學(xué)說營衛(wèi)理論的原創(chuàng)優(yōu)勢。4.3擁有以中醫(yī)為主體多學(xué)科交叉研究隊伍和豐富的管理經(jīng)驗在原承擔的973項目中，堅持以中醫(yī)為主體多學(xué)科融合的研究方式， 形成了 包括山東大學(xué)齊魯醫(yī)院張運院士、 北京阜外心血管醫(yī)院楊躍進教授、 復(fù)旦大學(xué)中 山醫(yī)院葛均波教授、北京中醫(yī)藥大學(xué)李澎濤教授等高層次西醫(yī)專家在內(nèi)的多學(xué)科 交叉的研究團隊，本項目又增加了中華醫(yī)學(xué)會心電生理

27、和起搏分會候任主任委員 武漢大學(xué)副校長黃從新教授、河北醫(yī)科大學(xué)黨委書記溫進坤教授、人民解放軍總 醫(yī)院楊明會教授等，體現(xiàn)了以中醫(yī)為主體多學(xué)科交叉的專家組成特色， 項目主體 研究人員中涵蓋了中醫(yī)、西醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、微循環(huán)研 究領(lǐng)域?qū)＜?，為項目順利開展提供了專家團隊支持。前期項目制定了項目內(nèi)部管理辦法，設(shè)立有項目辦公室，配備專職人員負責(zé) 項目內(nèi)部管理與外部協(xié)調(diào)，建立了項目網(wǎng)絡(luò)平臺共享研究數(shù)據(jù)，實行課題研究月 報、季報與年報制度，建立項目內(nèi)部學(xué)術(shù)交流會議制度，在人才培養(yǎng)、基地建設(shè)、 文章發(fā)表、組織管理、數(shù)據(jù)共享、國際學(xué)術(shù)交流、經(jīng)費使用等方面積累了豐富的 經(jīng)驗，為本項目的順利開展奠

28、定了良好基礎(chǔ)。4.4具備咼水平實驗研究平臺，掌握項目研究領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)和方法課題承擔單位擁有教育部神經(jīng)與血管生物學(xué)重點實驗室、衛(wèi)生部心血管重構(gòu) 與功能研究重點實驗室、教育部心血管基因和分子遺傳重點實驗室、 衛(wèi)生部心血 管再生醫(yī)學(xué)重點實驗室、衛(wèi)生部心血管藥理學(xué)重點實驗室、 省部共建國家重點實 驗室培育基地、國家中醫(yī)藥管理局絡(luò)病重點研究室（心腦血管）、河北省絡(luò)病重 點實驗室（GLP認證）、國家中醫(yī)藥管理局二級實驗室、北京市重點實驗室等, 擁有生化、電生理、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、細胞學(xué)、現(xiàn)代藥學(xué)、生物醫(yī)學(xué)信 息處理等多個技術(shù)服務(wù)平臺，具備多種高性能實驗設(shè)備與儀器，為項目的開展提 供有力的實驗技術(shù)支

29、持。申報單位不僅掌握激光多普勒腦血流監(jiān)測、激光散斑血流視頻監(jiān)測系統(tǒng)，可 動態(tài)觀察微血管血流與形態(tài)結(jié)構(gòu)，同時還掌握核素掃描、聲學(xué)造影、彩色微球、PET、PET-CT等技術(shù)，可觀察心腦組織中微循環(huán)血流灌注情況，從而更系統(tǒng)的研究微血管自身病變及其對心腦重要臟器的影響。 同時掌握基因沉默、基因敲除、 蛋白質(zhì)芯片、轉(zhuǎn)錄因子芯片等細胞與分子生物學(xué)關(guān)鍵技術(shù)， 可深入研究微血管功 能及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路變化。掌握大孔樹酯、膜分離等系統(tǒng)分離方法、葡聚糖凝 膠篩分、仿生酶解、組合光譜技術(shù)等，可開展通路藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制 研究。上述技術(shù)平臺及研究技術(shù)為順利開展基于微血管病變的重大疾病研究及通 絡(luò)藥物藥效物質(zhì)與

30、作用機制提供了有力保障。（二）與國內(nèi)外同類研究相比的創(chuàng)新點與特色1首次闡明營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常與 孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂相關(guān)性在前973項目系統(tǒng)構(gòu)建脈絡(luò)學(xué)說基礎(chǔ)上，創(chuàng)新發(fā)展脈絡(luò)學(xué)說營衛(wèi)理論，對 營 衛(wèi)交感”與 營衛(wèi)交會生化”概念進行詮釋和界定，首次提出營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會 生化”異常與 孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂相關(guān)性，闡明以微血管 EC為核心和啟動因素、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)與血液細胞共同參與、臟腑組織細胞功能結(jié)構(gòu) 損傷、多維時空動態(tài)演變的“孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息紊亂的復(fù)雜病理變化, 突出顯示了脈絡(luò)學(xué)說營衛(wèi)理論在微血管病變性重大疾病防治中的重要指導(dǎo)價值,

31、并為揭示其病理演變規(guī)律提供實驗數(shù)據(jù)支持。2. 開辟微血管病變性重大疾病異病同治及阻斷病程的通絡(luò)治療新途圍繞營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常引起滲灌氣血、營養(yǎng)代謝、津血互換障 礙與 孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂相關(guān)性，揭示 AMI無再流、急性腦 梗死、DN異病同治的共性機制，闡明易損斑塊、 AMI、心律失常、心力衰竭心血管事件鏈的內(nèi)在機制，為通絡(luò)干預(yù)的異病同治及阻斷心血管事件鏈的病理進程 提供理論支持，發(fā)揮脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”理論的原創(chuàng)優(yōu)勢，開 辟通絡(luò)治療微血管病變性重大疾病的治療新途徑。3. 采用循證方法開展通絡(luò)藥物臨床評價研究，闡明通絡(luò)藥物物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制以通絡(luò)復(fù)方

32、通心絡(luò)膠囊、參松養(yǎng)心膠囊及芪藶強心膠囊為代表方藥，通過復(fù) 方中藥的化學(xué)物質(zhì)組系統(tǒng)分離，結(jié)合多維多息指紋圖譜等組效化學(xué)分析方法， 圍 繞臨床療效特點建立多指標活性篩選方法，初步闡明其不同類別物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。采用隨機雙盲、對照、多中心研究方法，開展參松養(yǎng)心治療室性早搏伴心 功能不全、芪藶強心治療慢性心衰的循證醫(yī)學(xué)研究，客觀評價通絡(luò)藥物的臨床療 效?！钡闹?創(chuàng)建源于經(jīng)典、基于臨床、創(chuàng)新理論、研發(fā)新藥、提高療效醫(yī)藥發(fā)展新模式既往絡(luò)病證治”與脈絡(luò)學(xué)說”理論體系建設(shè)是在傳承前人理論與通絡(luò)藥物 經(jīng)驗基礎(chǔ)上的原始理論創(chuàng)新，理論原創(chuàng)+臨床實踐+創(chuàng)新藥物”三位一體運行機 制是絡(luò)病理論創(chuàng)新的成功模式，也體現(xiàn)了

33、源于經(jīng)典、基于臨床、創(chuàng)新理論、研 發(fā)新藥、提高療效”的中醫(yī)藥發(fā)展新模式，對中醫(yī)基礎(chǔ)理論原創(chuàng)研究的促進作用。在既往脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi)理論基礎(chǔ)上，開展營衛(wèi)由絡(luò)以通、交會生化”異常與 孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂相關(guān)性研究，綜合基礎(chǔ)實驗、臨床評價 與藥效物質(zhì)研究，通過數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)整合，揭示微血管病變性重大疾病異病同治 的共性機制與心血管事件鏈的內(nèi)在機制， 尋找有效干預(yù)策略和治療藥物，體現(xiàn)了與原973項目的延續(xù)性和創(chuàng)新性，通過創(chuàng)新發(fā)展脈絡(luò)學(xué)說的營衛(wèi)由絡(luò)以通、交會生化”理論，增強脈絡(luò)學(xué)說營衛(wèi)理論的原創(chuàng)優(yōu)勢和特色，通過經(jīng)典營衛(wèi)理論的 創(chuàng)新發(fā)展，提高微血管病變性重大疾病的防治水平，促進通絡(luò)創(chuàng)新藥物的研

34、發(fā), 為現(xiàn)代高科技條件下中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論發(fā)展模式提供有益借鑒。(三) 課題設(shè)置課題1課題名稱：營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常與微血管病變相關(guān)性及微觀病理特征研究研究目標：探討營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常引起的滲灌氣血、濡養(yǎng)代謝、 津血互換障礙與 孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂相關(guān)性，闡明以微血管EC為核心和啟動因素、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)與血液細胞共同參與、臟腑組織細胞功能結(jié)構(gòu)損傷、多維時空動態(tài)演變的“孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息紊亂的復(fù)雜病理 變化。探討脈絡(luò)病變宏觀臨床證候類型的 孫絡(luò)-微血管”微觀病理改變，借助微 血管動態(tài)可視技術(shù)和相關(guān)理化檢查手段， 揭示 孫絡(luò)-微血管”病變孫絡(luò)絀急、瘀

35、阻、滋生、疏失的微觀病理特征。主要研究內(nèi)容:(1)研究生理和微血管病變條件下，血小板、單核 /巨噬細胞與EC相互作 用的異同，探討微血管病理改變對血小板募集、單核 /巨噬細胞黏附、內(nèi)皮重建和血管新生的影響，揭示不同條件下血管EC與血液細胞相互作用所激活的胞內(nèi) 信號途徑。（2）應(yīng)用二維凝膠電泳、PF-2D目標蛋白快速分離、質(zhì)譜技術(shù)、代謝 組學(xué)研究技術(shù)，確定EC、平滑肌和心肌細胞在生理和病理環(huán)境中所釋放的活性物質(zhì)，明確其所激活的信號網(wǎng)絡(luò)以及受其調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子和基因，研究基因表達產(chǎn)物對內(nèi)皮細胞的影響和機制以及對微血管結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)。（3）采用高糖和 缺氧條件培養(yǎng)EC、平滑肌和心肌細胞，觀察其 0N

36、00-與ANP交互作用對物質(zhì)和能量代謝的影響及機制。（4）利用基因表達譜分析和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)， 篩選低 氧誘導(dǎo)EC、平滑肌細胞和心肌細胞差異表達的與能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)的關(guān) 鍵基因，探討低氧對心肌細胞 VEGF、NO、組織因子和ROS等化學(xué)信號分子生成、物質(zhì)和能量代謝的影響，利用其條件培養(yǎng)基，觀察對血管祖細胞歸巢、增殖 和分化能力的影響及對EC移行和血管新生的影響。研究低氧誘導(dǎo)對血管祖細胞-EC、骨髓干細胞-心肌細胞相互作用的影響和偶聯(lián)機制，同時在整體水平進行驗證。采用馬來酸麥角新堿冠脈注射制備兔孫絡(luò)絀急模型， 心導(dǎo)管介入冠狀動脈封 堵建立兔孫絡(luò)滋生和孫絡(luò)疏失模型，兔主動脈月桂酸鈉注射制備建

37、立孫絡(luò)瘀阻模 型。應(yīng)用活體微循環(huán)、免疫組化、光鏡觀察微血管形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用定量放射自 顯影觀察冠脈微血管通透性，血管內(nèi)超聲顯像、冠脈造影觀察冠脈形態(tài)及血流動 力學(xué)變化，同時記錄心電圖動態(tài)變化。應(yīng)用電鏡觀察微血管EC超微結(jié)構(gòu)，生化、 原位雜交、Western blot、免疫組化檢測微血管EC緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5、 occludin、纖維粘連蛋白及體現(xiàn)EC通透性的MMP表達，檢測與血管新生相關(guān)的iNOS、VEGF、PDGF、Ang n、TGF-a表達以及凋亡相關(guān)因子和血管活性物質(zhì)eN0S、ET-1、ICAM-1、Ang n等水平和表達，闡明 孫絡(luò)微血管”病變微觀病 理特征。承擔單位：

38、河北醫(yī)科大學(xué)、中國人民解放軍總醫(yī)院課題負責(zé)人：溫進坤主要學(xué)術(shù)骨干：楊明會、韓梅、李紹旦、齊錦生、李玉珍經(jīng)費比例：22%課題2課題名稱：心腦腎重大疾病異病同治的微血管共性病理機制研究研究目標：在高血脂和糖尿病損傷EC的基礎(chǔ)上，圍繞 心肌灌注單元”明確微血管EC損傷”在AMI再灌注后心肌無再流和再灌注損傷的核心作用，揭示 通絡(luò)干預(yù)通過微血管有效保護心肌灌注單位，減少心肌無再流和再灌注損傷的作用機制。以腦微血管結(jié)構(gòu)功能及其與腦組織細胞相互作用關(guān)系為核心，觀察腦梗 死時微血管結(jié)構(gòu)功能變化特征，揭示腦微血管EC與神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞相互影響 的特征改變，臨床研究觀察腦梗死不同階段的腦影像學(xué)變化， 揭示通絡(luò)干

39、預(yù)腦梗 死的微血管機制。圍繞DN微血管血流動力學(xué)異常和EC功能障礙、腎小球細胞 外基質(zhì)增生、腎小球足細胞損傷、腎間質(zhì)纖維化，闡明腎之脈絡(luò)營衛(wèi)交會生化異 常與孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂的相關(guān)性及通絡(luò)干預(yù)作用機制。主要研究內(nèi)容:急性心梗無再流的微血管發(fā)病機制及通絡(luò)干預(yù)研究：采用高脂、高糖飲食建 立豬高血脂和糖尿病AMI再灌注模型，導(dǎo)管法測定左室收縮壓和左室舒張末壓、 左心室內(nèi)壓最大收縮和舒張變化速率、 心排量、心率，超聲法測定心臟結(jié)構(gòu)與功 能改變。觀察毛細血管滲透性、心肌和左室含水量，彩色微球測定心肌血流量。采用硫磺素、Evan s blu染色觀察心肌無再流范圍，四氮唑紅染色觀察梗死心

40、肌面積，光鏡觀察心肌灶性出血率、粒細胞浸潤、微血管EC和心肌細胞損傷程度，電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)及自噬體形成情況。 采用免疫熒光檢測示蹤細胞自噬，CD31 和CD34標記血管內(nèi)皮觀察血管新生，TUNEL法和DNA電泳檢測細胞凋亡。測 定循環(huán)EC計數(shù)、心肌NO水平和NOS活性，ELISA法測定組織ATP、ROS、MDA含量、髓過氧化物酶活性。利用免疫組化、免疫熒光和Western blot法檢測再流區(qū)和無再流區(qū)心肌組織中反應(yīng) mTOR通路活性(mTOR、p-mTOR、eIF4E、EC分泌的保護因子、白細胞STAT-1, 3和5)、微血管EC的結(jié)構(gòu)和功能完整性、與EC、血小板與EC、淋巴細胞與EC相互

41、作用、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、細胞自噬和血管新生等蛋白的表達改變。急性腦梗死的微血管發(fā)病機制及通絡(luò)干預(yù)研究:(1)采用大鼠大腦中動脈栓塞建立腦梗死模型，應(yīng)用激光多普勒監(jiān)測定點腦血流， 激光散斑血流視頻監(jiān)測 區(qū)域內(nèi)腦血流灌注，應(yīng)用在體微循環(huán)觀察儀對正常及急性腦梗死動物大腦皮層表 面的細小血管進行觀察。采用光、電鏡觀察腦微血管結(jié)構(gòu)，免疫組化、ELISA法檢測微血管密度、微血管成分及生成相關(guān)因子表達和水平，實時動態(tài)檢測PO2/CO2評估腦微血管物質(zhì)交換功能。光、電鏡觀察腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，高效液相色譜法檢測腦組織能量負荷，同時觀察神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能。（2）提取腦微血管EC 條件培養(yǎng)液，生物芯片檢測與血

42、管舒縮功能、 凝血與抗凝、介導(dǎo)血細胞與血管內(nèi) 皮粘附、介導(dǎo)血管內(nèi)皮炎癥損傷及神經(jīng)細胞損傷、保護或修復(fù)相關(guān)的活性因子并 進行在體定位及定量分析；提取神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)液，分別作用于腦微P ET-CT血管EC,觀察其活性變化，在上述研究中應(yīng)用通絡(luò)干預(yù)觀察其作用機制。（3） 以腦梗死急性期、恢復(fù)早期和恢復(fù)期臨床患者為研究對象，應(yīng)用核磁、等影像分析技術(shù)，觀察通絡(luò)干預(yù)前后，梗死灶和缺血半影區(qū)的神經(jīng)-血管形態(tài)、生化與功能變化特征。糖尿病腎病的微血管發(fā)病機制及通絡(luò)干預(yù)研究：（1）整體動物采用高脂飲 食+鏈脲佐菌素注射建立糖尿病大鼠模型，觀察大鼠腎功能和尿白蛋白含量，測 定神經(jīng)體液因子和血管活性物質(zhì)的水

43、平和 mRNA表達，同時觀察內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)與功能、血小板功能、凝血抗凝功能、血流變相關(guān)指標的變化。離體細胞采用高 糖刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞株（ECV-304）觀察EC形態(tài)、通透性、細胞凋亡、增殖、周期變化、血管活性物質(zhì)、氧化應(yīng)激及相關(guān)信號通路表達。（2）在上述大鼠模型中采用電鏡觀察 DN大鼠腎臟病理，腎功能改變，采用酶聯(lián)免疫、WesternBlot、RT-PCR方法，觀察DN大鼠腎組織中ECM成分、生長因子、ECM降解酶系，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 P38MAPK、NF-K B，糖基化終產(chǎn)物 AGEs和受體RAGE的的表達。離體實驗采用高糖刺激的ECV-304和腎小球系膜細胞共培養(yǎng)及單獨培養(yǎng)，觀察通絡(luò)方藥對三

44、種模型中內(nèi)皮細胞（ET-I）表達及細胞上清液基質(zhì)成分合成的影響，對相關(guān)細胞因子蛋白和基因水平及P38MAPK的影響。（3）采用自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠模型及TGF- p 1刺激的體外腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化模型，觀察通絡(luò)方藥對2型糖尿病KK-Ay小鼠腎間質(zhì)纖維化病理改變的影響，檢測介導(dǎo) EMT的關(guān)鍵信號通路 TGF p -smad2/3、標記蛋白E-cadherin、a -SMA、促進/抑制纖維化因子、降解酶系等指標蛋白和基因水平的表達。（4）采用STZ誘導(dǎo)建立糖尿病腎病模型，觀察大鼠足細胞數(shù)目、足突、 尿白蛋白、腎功能變化和檢測裂孔隔膜蛋白、胞骨架蛋白的蛋白和基因水平的表 達。用永生化足細

45、胞系構(gòu)建體外細胞模型，檢測裂孔隔膜蛋白、胞骨架蛋白、W型膠原a -5鏈的表達，上清液中MMP-2 MMP-啲活性，足細胞黏附率變化。承擔單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院、 北京中醫(yī)藥大學(xué)、首都醫(yī)科 大學(xué)課題負責(zé)人：楊躍進主要學(xué)術(shù)骨干：李澎濤、高彥彬、趙京林、潘彥舒、耿建國、李向東、李衛(wèi) 紅、張紅經(jīng)費比例：32%課題3課題名稱：易損斑塊微血管滋生及通絡(luò)干預(yù)機制研究研究目標：揭示斑塊內(nèi)新生血管、新生淋巴管、二者協(xié)同在 AS發(fā)展、斑塊易損中的作用，闡明抑制VEGF-A和VEGF-C的表達在減少斑塊內(nèi)微血管新生, 抑制穩(wěn)定斑塊及通絡(luò)干預(yù)的作用機制。 探討同一生物體易損斑塊孫絡(luò)滋生與缺血 心肌孫絡(luò)疏

46、失的內(nèi)在機制及通絡(luò)干預(yù)雙向調(diào)節(jié)的分子機制。主要研究內(nèi)容：（1）構(gòu)建VEGF-A和VEGF-C的過表達載體和抑制性載體。（2）培養(yǎng)人主 動脈EC和淋巴管內(nèi)皮細胞，應(yīng)用ELISA法檢測VEGF-A和VEGF-C表達，檢測細胞增殖、遷移、血管形成能力、細胞衰老和凋亡、ICAM-1，VCAM-1等炎癥因子水平，免疫組化、Real time RT-PCR和Western blot檢測P38、JNK和ERK信號通路關(guān)鍵分子表達。（3）通過高脂喂養(yǎng)和頸總動脈外周套管建立 apoE-/-小鼠頸 動脈斑塊模型，給予通心絡(luò)和辛伐他汀干預(yù)。動態(tài)觀察新生血管及新生淋巴管生 長情況及斑塊穩(wěn)定性，同時進行體內(nèi) VEGF基

47、因轉(zhuǎn)染，檢測血脂、炎性因子、纖維蛋白原水平、循環(huán)EC及循環(huán)淋巴內(nèi)皮細胞數(shù)量，采用微型 CT顯示局部新生血管三維圖像、彩色微粒法測定微循環(huán)局部血流量、 免疫組化分析斑塊內(nèi)新生血管 和新生淋巴管相關(guān)指標水平，同時觀察微血管 EC通透性、斑塊內(nèi)細胞凋亡率、MMP-2、MMP-9活性，并進行頸總動脈斑塊穩(wěn)定性和血栓形成的評價。（4）建RASS、Ach、N、NE、5-HT、立apoE-L小鼠頸動脈斑塊合并AMI模型，采用辛伐他汀、通心絡(luò)進行干預(yù)。超聲 觀察心功能，檢測血脂、炎性因子、纖維蛋白原、DA水平,同時觀察循環(huán)EC數(shù)量、微血管EC通透性、頸動脈斑塊微血管密度、斑塊內(nèi)細胞凋亡率。采用微型CT顯示梗死

48、心肌內(nèi)微血管三維圖像，彩色微粒法測定心肌微循環(huán)局部血流量；免疫組化、實時定量RT-PCR及Western blot法檢測心肌內(nèi)微循環(huán)密度、分布和巨噬細胞的含量，檢測心肌內(nèi)血管新生和淋巴管新生、 微血管EC活性因子和炎性指標表達。承擔單位：山東大學(xué)課題負責(zé)人：趙玉霞主要學(xué)術(shù)骨干：劉運芳、倪梅經(jīng)費比例：10%課題4課題名稱：急性心梗致心律失常發(fā)病機制及通絡(luò)干預(yù)研究研究目標：闡明急性心梗對電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)、神經(jīng)重構(gòu)影響導(dǎo)致心律失常 的發(fā)病機制，探討通心絡(luò)和參松養(yǎng)心膠囊對上游調(diào)控靶點 RGS5影響及阻斷心血管事件鏈（急性心梗-心律失常-心力衰竭）的作用機制。主要研究內(nèi)容:采用兔AMI模型，應(yīng)用通心絡(luò)、

49、參松養(yǎng)心膠囊干預(yù)，以免疫組化、放免法、RT-PCR、Western blot法等檢測血液及心肌中 EC相關(guān)活性因子 VEGF、ET、PGI2、NO、Ang n、CNP的含量及表達。高頻超聲診斷儀檢測心功能，導(dǎo)管檢測血流 動力學(xué)，超聲造影檢查觀察心肌灌注情況， 通過在體電生理研究觀察心電生理變 化特性。觀察心肌細胞電傳導(dǎo)（Cx43在細胞、蛋白、基因水平的分布與表達）、 心室肌細胞鈣調(diào)控（L型鈣電流特性，鈣通道基因和蛋白表達，心肌細胞鈣瞬變、 鈣轉(zhuǎn)運蛋白）、心室肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)（心肌纖維化、膠原纖維分布、膠原纖維容積分 數(shù)、TGF- $ CTGF、MMP-2、MMP-9、MAPK 信號通路）、神經(jīng)重構(gòu)（

50、NGF、 神經(jīng)營養(yǎng)因子TrkA、P75NTR、炎癥介質(zhì)、GAP43和TH的分布）的表達及活 性。選取RGS5基因敲除小鼠和心臟特異性 RGS5轉(zhuǎn)基因小鼠建立AMI模型,觀察存活率及心功能，在體/離體電生理觀察心律失常自發(fā)、心室激動傳導(dǎo)、心 律失常誘發(fā)、心臟回復(fù)特性情況，激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞鈣瞬變。承擔單位：武漢大學(xué)人民醫(yī)院課題負責(zé)人：黃從新主要學(xué)術(shù)骨干：黃鶴、王晞、唐艷紅經(jīng)費比例：10%課題5課題名稱：急性心梗致心力衰竭發(fā)病機制及通絡(luò)干預(yù)研究研究目標：在細胞、整體水平從心肌微循環(huán)、微血管新生異常和能量代謝障并探討通絡(luò)干預(yù)礙切入，明確急性心梗與心臟重構(gòu)和心力衰竭發(fā)生發(fā)展的機理, 作用機制

51、。主要研究內(nèi)容:siRNA干擾和基因轉(zhuǎn)染方法進(1)培養(yǎng)乳鼠微血管EC,觀察缺氧損傷對EC形態(tài)、舒縮功能、血管新生、 粘附功能、細胞凋亡及炎癥反應(yīng)等指標的影響及通絡(luò)干預(yù)作用，通過基因芯片和 蛋白組學(xué)尋找并篩選通絡(luò)干預(yù)的關(guān)鍵靶點，采用行驗證。(2)采用C57B/L6小鼠，建立心肌梗死致心衰模型與心衰+運動平板模 型，應(yīng)用芪藶強心膠囊進行干預(yù)，動態(tài)觀察不同部位心肌微血管數(shù)量和形態(tài)，F(xiàn)ITC標記血漿白蛋白細靜脈外漏出，ELISA法檢測血中eNOS、NO、ET-1、HIF-1、VEGF、ICAM-1、VCAM-1、TNF- a、IL-2、IL-6、IL-10、MMP 和 TIMP 水平， 采用病理、光

52、鏡、TUNEL的方法觀察不同時期心肌組織變化，超聲檢測心臟功 能，探討血管新生在心力衰竭中的作用。同時檢測血脂、血糖、不同部位心肌細 胞和線粒體形態(tài)數(shù)目、Na+-K+-ATPase活性、胞漿ATPase活性和肌酸含量。采 用RT-PCR和Western Blot方法檢測不同部位 PPAR和PCG-1表達與GLUT-1、GLUT-4含量并觀察PPARx和PCG-1表達與心臟功能改變的關(guān)系，采用蛋白質(zhì) 組學(xué)觀察能量代謝相關(guān)酶類的變化， 檢測心肌細胞線粒體功能，超聲檢測心臟功 能，對于不同干預(yù)組小鼠采用基因芯片、蛋白芯片篩選芪藶強心膠囊作用靶點， 采用siRNA干擾/基因轉(zhuǎn)染的方法結(jié)合 Realti

53、me-PCR、Western Blot方法驗證明確關(guān)鍵的分子機制及調(diào)控原理，探討能量代謝在心力衰竭中的作用。 承擔單位：復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院課題負責(zé)人：周京敏主要學(xué)術(shù)骨干：鄒云增、姜紅經(jīng)費比例：10%課題6課題名稱：通絡(luò)藥物物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機制及臨床評價研究研究目標：初步闡明通絡(luò)代表性藥物通心絡(luò)、 參松養(yǎng)心、芪藶強心膠囊的藥 物物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制；通過臨床循證醫(yī)學(xué)研究，客觀評價參松養(yǎng)心治療室性早 搏伴心功能不全、芪藶強心治療慢性心衰的臨床療效，為臨床提供療效確切的治 療藥物。主要研究內(nèi)容:選擇通絡(luò)代表性藥物通心絡(luò)、參松養(yǎng)心及芪藶強心膠囊，植物藥采用系統(tǒng)分 離、光譜、色譜等技術(shù)，動物藥采用仿生酶解

54、、膜分離、葡聚糖凝膠篩分等技術(shù) 對復(fù)方中藥的化學(xué)物質(zhì)組進行系統(tǒng)分離，結(jié)合多維多息指紋圖譜等組效化學(xué)分析 方法，圍繞通心絡(luò)干預(yù)心腦組織缺血再灌注微血管損傷、參松養(yǎng)心快慢兼治心律 失常、芪藶強心強心、利尿、擴血管、抑制心室重構(gòu)等臨床療效特點建立在體、 離體多指標活性篩選方法，初步闡明其不同類別物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。 采用國際公認隨機雙盲、對照、多中心又體現(xiàn)中醫(yī)特色的循證醫(yī)學(xué)臨床研究方法，藥物設(shè) 盲、數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計分析由第三方統(tǒng)計單位具體實施， 開展參松養(yǎng)心膠囊治療室 性早搏伴心功能不全、芪藶強心膠囊治療慢性心衰的臨床循證評價。承擔單位：河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司課題負責(zé)人：吳以嶺主要學(xué)術(shù)骨干：王宏濤

55、、賈振華、高學(xué)東、賈繼明經(jīng)費比例：16%（四）各課題間的相互關(guān)系以及與項目總體目標和五年目標的關(guān)系圍繞項目假說，開展營衛(wèi) 由絡(luò)以通、交會生化”異常引起的滲灌氣血、濡養(yǎng) 代謝、津血互換障礙與 孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息網(wǎng)絡(luò)紊亂相關(guān)性及微觀病理 特征研究，闡明以微血管EC為核心和啟動因素、神經(jīng)體液調(diào)節(jié)與血液細胞共同參與、臟腑組織細胞功能結(jié)構(gòu)損傷、多維時空動態(tài)演變的“孫絡(luò)-微血管”物質(zhì)-能量-信息紊亂的復(fù)雜病理變化及微觀病理特征（課題1），圍繞 孫絡(luò)-微血管” 病變影響心、腦、腎三大重要臟器而導(dǎo)致的 AMI、急性腦梗死、DN，闡明其異病同治的微血管損傷共性機制（課題 2），以及易損斑塊（課題3）、心律失常（課題4）、心力衰竭（課題5）心血管事件鏈的內(nèi)在機制，尋找有效干預(yù)策略及有效方藥，闡明其物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制，開展通絡(luò)方藥的臨床評價研究（課題6）。項目體現(xiàn) 二橫四縱”的課題設(shè)置思路，課題2是研究 孫絡(luò)-微血管”損傷心、腦、腎重要臟器所致臨床重大疾病，探討其共性機制將為通絡(luò)干預(yù)的異病同治提 供實驗數(shù)據(jù)支持；課題3、4、5均為孫絡(luò)-微血管”引起心血管事件鏈的重大疾 病，探討其級聯(lián)反應(yīng)的內(nèi)在機制，將為治中寓防、防治結(jié)合、阻斷級聯(lián)反應(yīng)的病 理進程開辟新的有效治療途徑；課題 1、6圍繞 孫絡(luò)-微血管