免疫性血小板減少性紫癜動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

1、免疫性血小板減少性紫癜動(dòng)物模型的研究進(jìn)展     【摘要】  免疫性血小板減少性紫癜（immune thrombocytopenic purpura，ITP）是一種較為常見(jiàn)的自身免疫病，其臨床試驗(yàn)多建立于臨床藥物的應(yīng)用，而非亞臨床研究，有可能因?yàn)橐馔獠l(fā)癥被迫中止，因此建立理想的動(dòng)物模型有助于加深對(duì)ITP發(fā)病機(jī)制和用藥機(jī)理的理解。本綜述回顧了ITP模型的發(fā)展過(guò)程，總結(jié)了被動(dòng)型和主動(dòng)型造模方法在ITP研究中的應(yīng)用，尤其是轉(zhuǎn)基因小鼠可更好模擬人類(lèi)疾病病理狀態(tài)，有利于進(jìn)一步探討新的診斷和治療方法。 【關(guān)鍵詞】  免疫性血小板減少性紫癜Pro

2、gress of Studies on Animal Model of immune thrombocytopenic purpura ReviewAbstract     Human ITP clinical trials have been performed based on observations of  clinical uses of drugs，other than  on  mechanism studies in preclinical models，many studies were stopped b

3、ecause of unexpected complications. So  there was  need to develop ideal animal model of ITP to improve the  understanding of the pathophysiology and the mechanisms of action of therapeutics. In this  review，the history of animal models of ITP was retrospected，two modeling method

4、s    inducing passive and active   models，especially transgenic rice model which can more accurately represent human disease pathophysiology，and their  application in study of ITP were summarized.  An animal model for human immune thrombocytopenia allows detailed s

5、tudies of the mechanism，kinetics，and therapy of human immune thrombocytopenia.Key words  immune thrombocytopenic purpura; autoantibody; animal model    目前人類(lèi)免疫性血小板減少性紫癜（immune thrombocytopenic purpura，ITP）的臨床試驗(yàn)多建立在臨床藥物應(yīng)用的基礎(chǔ)上，而不是亞臨床研究。這樣的試驗(yàn)有可能因?yàn)槌霈F(xiàn)意外并發(fā)癥而被迫中止1，2，因此建立理想的動(dòng)物模型有利于加深對(duì)ITP治

6、療藥物機(jī)理和發(fā)病機(jī)制的理解，并進(jìn)一步探討新的診斷方法和治療方法。一個(gè)理想的動(dòng)物模型應(yīng)該能復(fù)制出ITP的所有方面，如它的易感性、臨床過(guò)程和組織病理，同時(shí)也應(yīng)該容易建立、具有可操作性和穩(wěn)定性3。數(shù)十年來(lái)，已有眾多的造模方法應(yīng)用于ITP的研究，為ITP基礎(chǔ)和臨床研究不斷進(jìn)展提供了平臺(tái)。被動(dòng)型的病理模型此造模方法是：將致病的抗體注射入受體動(dòng)物體內(nèi)，然后觀察其效應(yīng)。被動(dòng)型的ITP病理模型建立的早期，主要是通過(guò)體內(nèi)給予多克隆抗血小板抗體，依賴抗體的劑量導(dǎo)致血小板數(shù)量的一過(guò)性減少?？寡“逖澹ˋPS）造模方法1905年Marlno率先用兔血小板免疫豚鼠，制取豚鼠抗兔血小板抗血清，并以此抗血小板血清輸入兔體

7、內(nèi)造成血小板破壞形成血小板減少模型，以研究紫癜形成與血小板減少的關(guān)系。1913年，LeSourd等開(kāi)始用反復(fù)輸注抗血小板血清(APS)的方法造模得到骨髓中巨核細(xì)胞數(shù)量增加的血小板減少模型，來(lái)研究巨核細(xì)胞與血小板的關(guān)系。1951年，Harrington等4將ITP患者血漿輸給正常人造成受者血小板減少，從而揭示了ITP免疫發(fā)病學(xué)本質(zhì)是循環(huán)中存在抗血小板因子而引起血小板減少。 至此，用免疫法造成的血小板減少動(dòng)物模型開(kāi)始應(yīng)用于ITP的實(shí)驗(yàn)研究。    自上世紀(jì)80年代，造模動(dòng)物多為純系小鼠所取代，同位素標(biāo)記技術(shù)、骨髓和脾巨核細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)以及流式細(xì)胞儀的應(yīng)用，使人們對(duì)血小板

8、產(chǎn)生的調(diào)節(jié)因素及其與巨核細(xì)胞之間的關(guān)系有了新的認(rèn)識(shí)。用有微環(huán)境損傷的S1/S1小鼠和有嚴(yán)重多能干細(xì)胞缺陷的w/w小鼠造模5，通過(guò)對(duì)該模型停止注射抗血清后，觀察有無(wú)血小板反饋性增高。發(fā)現(xiàn)這種造血調(diào)節(jié)是發(fā)生在各系祖細(xì)胞水平而不是多能干細(xì)胞水平。利用I標(biāo)記葡萄球菌蛋白A(SPA)測(cè)定血小板相關(guān)抗體PAIgG及l(fā)n標(biāo)記血小板測(cè)定其壽命，均證實(shí)了免疫法所造動(dòng)物血小板減少模型具有骨髓中巨核細(xì)胞增多、PAIgG增高、血小板壽命縮短等特性，與ITP臨床表現(xiàn)相符。Ebbe等6用缺乏胸腺細(xì)胞的裸鼠造模，試圖揭示ITP發(fā)病與細(xì)胞免疫之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，在急性免疫性血小板減少刺激下血小板生成是正常的，巨核細(xì)胞大小和

9、血小板的產(chǎn)生與Meg-CFC、GM-CFC和BFU-E均無(wú)關(guān)。補(bǔ)充正常T細(xì)胞并不影響血小板的生成，但能加強(qiáng)模型對(duì)APS反應(yīng)。    APS免疫法造模除了通過(guò)加熱滅活補(bǔ)體外，還需采用多種細(xì)胞和組織吸附APS來(lái)去除抗紅細(xì)胞、抗白細(xì)胞和抗組織的抗體，使模型除血小板減少外其它細(xì)胞組織不受影響。免疫法造模具有造模原理簡(jiǎn)單、干擾因素小、有明確血小板抗體產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)，曾一度被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用。雖然人們選擇不同的動(dòng)物種系設(shè)計(jì)模型，但終因該模型血小板抗體是外源性的，需不斷輸入APS才能維持血小板減少狀態(tài)，維持慢性ITP穩(wěn)定性相對(duì)要差，目前已較少采用7。多/單克隆抗體造模方法目前，多/單

10、克隆抗鼠血小板抗體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于被動(dòng)型的病理小鼠模型，它們引發(fā)與臨床和病理表現(xiàn)相同或相近的反應(yīng)，但多用于研究藥物的作用機(jī)理，近年來(lái)也用于新藥的開(kāi)發(fā)及療效的驗(yàn)證。    Teeling等8對(duì)雌性C57BL/6小鼠進(jìn)行大鼠抗GPb/a單克隆抗體-MWReg30腹腔注射，單次大劑量注射后小鼠循環(huán)血小板數(shù)量在3小時(shí)內(nèi)迅速下降，幾乎為零，經(jīng)眼鏡蛇蛇毒因子預(yù)處理也不能影響血小板的消耗，而給予抗FcR/單克隆抗體及IVIG預(yù)處理的小鼠則能夠明顯減少血小板的清除；連續(xù)小劑量輸注的小鼠則在4天后下降到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，其血小板量約為正常對(duì)照組的25%，而這種下降在缺乏FcR鏈的小

11、鼠（分別為FcRI、FcRIII和 FcRIII缺失）卻沒(méi)有觀察到。    Song等9通過(guò)給SCID小鼠腹腔內(nèi)分別注射大鼠抗GP-b抗體-MWReg30和抗GP-a 抗體-2C9.G2誘導(dǎo)產(chǎn)生ITP，未經(jīng)IVIG預(yù)處理的小鼠在24小時(shí)即出現(xiàn)血小板減少，而經(jīng)過(guò)IVIG 預(yù)處理的小鼠則明顯受到保護(hù)，同時(shí)還驗(yàn)證了單克隆抗體anti-TER-119 和anti-CD24 (IgG2b)對(duì)小鼠ITP的治療作用。在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，作者為了避免因IVIG及治療性單克隆抗體引起的免疫反應(yīng)而應(yīng)用SCID小鼠，然而事實(shí)上在BALB/c和CD-1小鼠中也觀察到了相同的結(jié)果。 &

12、#160;  目前尚無(wú)商品化的產(chǎn)抗大鼠血小板單克隆抗體的細(xì)胞，因此Hansen等10采用產(chǎn)鼠抗人血小板單克隆抗體-7E3的雜交瘤細(xì)胞給BALB/c 小鼠進(jìn)行腹腔內(nèi)注射，產(chǎn)生鼠抗人GPb/a IgG1抗體，其誘發(fā)的可重復(fù)的、嚴(yán)重的血小板減少及出血，與臨床表現(xiàn)一致，但這種急性被動(dòng)型模型仍然是通過(guò)給予外源性抗體造成血小板減少，還不能十分精確地模擬人體ITP的狀態(tài)。    此后Hansen等11又采用Sprague-Dawley大鼠以上述方法造模，觀察IVIG的劑量依賴效應(yīng)。在這一急性模型中，血小板減少僅在前24小時(shí)觀察到，最明顯的影響在最初3小時(shí)內(nèi)，因此如果I

13、VIG在慢性ITP中可加速抗血小板抗體的清除，那么可以考慮其中有其它因素在發(fā)揮作用，且可能更直接控制血小板破壞的其他方面，如干擾Fc或補(bǔ)體介導(dǎo)的血小板破壞等。    應(yīng)當(dāng)說(shuō)，這類(lèi)特異性抗血小板抗體造模方法較之免疫法更能模擬ITP的病理狀態(tài)，但仍不能揭示其完整的發(fā)病機(jī)制，而對(duì)于研究IVIG，anti-D等藥物的作用機(jī)理，這種造模方法不失為一種有效的可控性強(qiáng)的途徑。    總的來(lái)說(shuō)，被動(dòng)型病理模型的優(yōu)點(diǎn)是，特定的抗體抗原關(guān)系是已知的，能夠引起血小板數(shù)量的暫時(shí)變化；其缺點(diǎn)在于，不能較好地模擬人ITP的病理狀況。人體中ITP發(fā)病機(jī)理是多克隆內(nèi)

14、源性血小板抗體不斷地在體內(nèi)生成和循環(huán)，并發(fā)生作用的，被動(dòng)型動(dòng)物模型難以達(dá)到持續(xù)產(chǎn)生抗體的要求，故不適用于自身免疫反應(yīng)的啟動(dòng)及調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。主動(dòng)型的病理模型此造模方法是使動(dòng)物的自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生致病性抗體。這種免疫反應(yīng)可以是自發(fā)的，也可以通過(guò)抗原產(chǎn)生。    日本學(xué)者12發(fā)現(xiàn)一種具有遲發(fā)紅斑狼瘡傾向的(NZW*BXSB)F雌性小鼠。成年后逐漸出現(xiàn)血小板減少、巨核細(xì)胞增多，但形態(tài)正常，PAIgG升高，血小板壽命縮短，抗心磷酯酶抗體增高，這些表現(xiàn)符合ITP臨床特點(diǎn)。利用此模型進(jìn)行異基因骨髓移植治療，發(fā)現(xiàn)對(duì)于血小板減少確有預(yù)防和治療作用。對(duì)該模型進(jìn)行強(qiáng)的松龍重復(fù)注射后，血

15、小板明顯增多，血小板壽命延長(zhǎng)，PAIg下降，這一研究證實(shí)了皮質(zhì)類(lèi)固醇治療ITP機(jī)理或是抑制網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬功能，或是抑制了血小板抗體的產(chǎn)生。但此種模型缺陷是同時(shí)伴有狼瘡腎及心肌梗死，且存在多種自身抗體，表現(xiàn)為多種自身免疫病，干擾因素大，這無(wú)疑增加了分析的難度。    最近Musaji等13用大鼠的血小板免疫CBA/Ht小鼠，使小鼠發(fā)生血小板減少，并在其體內(nèi)檢測(cè)到抗血小板GPb的自身抗體，成功建立了免疫性血小板減少的模型。但該模型維持時(shí)間仍較短，約5周，且為異種血小板免疫，特別適用于輸血后紫癜的研究，對(duì)自身免疫性血小板減少性紫癜，尤其是慢性ITP它仍不是一種較為理想

16、的動(dòng)物模型。    在20世紀(jì)90年代，主動(dòng)型病理模型遇到了很多障礙。人類(lèi)和小鼠各自都有吞噬細(xì)胞Fc受體，通過(guò)亞單位FcR 鏈的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，可以調(diào)節(jié)抗體包被的血小板的清除14。小鼠被敲除了鼠類(lèi)的FcR -鏈基因，接受抗血小板抗體注射后并不出現(xiàn)血小板減少15。試驗(yàn)證實(shí)，對(duì)于ITP來(lái)說(shuō)血小板抗體是必需的，但是僅有它是不夠的。功能性的吞噬細(xì)胞Fc受體也是必需的16。然而，已經(jīng)證實(shí)人類(lèi)和小鼠的所有FcR -受體的組成有非常大的差別。特別是，人類(lèi)具有的FcR -的基因組正是小鼠基因組缺少的，兩者在Fc受體的最主要的不同在于FcRIIa，小鼠中沒(méi)有FcRIIa基因。FcRIIa

17、是表達(dá)于人類(lèi)的血小板和粒細(xì)胞的，F(xiàn)cRIIa基因在靈長(zhǎng)類(lèi)進(jìn)化中出現(xiàn)，F(xiàn)cRIIa基因的同源基因在其他哺乳動(dòng)物和其他靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中是缺失的17。因此，在小鼠中抗體介導(dǎo)的血小板破壞的詳細(xì)機(jī)制能否正確反映人體內(nèi)的情況尚無(wú)定論。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物造模用動(dòng)物模型研究人類(lèi)疾病的有效性是動(dòng)物模型選擇的最重要的標(biāo)準(zhǔn)。因此應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)，對(duì)各方面因素進(jìn)行合適的調(diào)整，建立一個(gè)理想的、穩(wěn)定的、最大程度模擬人體的模型。模型同時(shí)也應(yīng)該是容易建立且具有可操作性，因此嚙齒類(lèi)動(dòng)物成為應(yīng)用最多的動(dòng)物。但人鼠畢竟存在遺傳學(xué)的極大差異，所以可借助于實(shí)驗(yàn)手段來(lái)控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特定基因組分及其表達(dá)等，使動(dòng)物表現(xiàn)特有的遺傳性狀，運(yùn)用此技術(shù)干預(yù)的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。    目前已有成功建立的FcRIIa轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在小鼠血小板和淋巴細(xì)胞