中華稻蝗對(duì)重金屬鎘解毒機(jī)制研究

1、中華稻蝗對(duì)重金屬鎘的解毒機(jī)制研究【摘要】：鎘(Cadmium,Cd)是一種毒性極強(qiáng)的金屬元素,能對(duì)人體健康造成不良影響。在農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境中,鎘可通過(guò)農(nóng)作物的吸收在食物鏈各環(huán)節(jié)間轉(zhuǎn)移和累積,對(duì)生物體正常的生理生化代謝產(chǎn)生嚴(yán)重影響,同時(shí)鎘污染還加劇了農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的惡化,最終影響到人類的身體健康。昆蟲是自然界中分布最廣泛的動(dòng)物類群,極易受到重金屬等環(huán)境因子的脅迫。已有大量研究表明,環(huán)境中的鎘可通過(guò)呼吸、表皮滲透和攝食等途徑進(jìn)入昆蟲體內(nèi)。而在鎘脅迫對(duì)昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和生理機(jī)能產(chǎn)生影響的同時(shí),昆蟲也發(fā)展了各種防御或解毒機(jī)制來(lái)減少過(guò)量重金屬的危害,維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。植食性昆蟲中華稻蝗Oxyachinens

2、is是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲,主要以禾本科植物為食。當(dāng)中華稻蝗取食被鎘污染的農(nóng)作物或其它雜草時(shí),環(huán)境中的鎘便會(huì)通過(guò)食物鏈在其消化道等部位累積。本文以中華稻蝗為實(shí)驗(yàn)材料,從生化水平和分子水平對(duì)重金屬鎘的解毒機(jī)理進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究。全文共分為五部分：一、為研究重金屬在中華稻蝗自然種群體內(nèi)的累積分布,以山西省代縣水稻田中華稻蝗為研究對(duì)象,用火焰原子吸收法測(cè)定中華稻蝗不同組織部位的鎘和鉻含量。研究結(jié)果表明：鎘和鉻在中華稻蝗自然種群不同組織部位的富集量不同,且雌雄間存在差異。鎘在雌蟲體內(nèi)的富集順序?yàn)椋褐心c后腸前腸翅頭卵巢足體壁；在雄蟲體內(nèi)為中腸前腸后腸足頭體壁。鎘在雌雄中華稻蝗消化道內(nèi)均有較高的富集,其中

3、中腸的累積量最高,且與其它組織部位存在顯著差異。中華稻蝗雌蟲各組織部位對(duì)鉻的累積濃度依次為中腸足體壁頭卵巢前腸翅后腸,中華稻蝗雄蟲體內(nèi)鉻濃度的分布依次為足體壁中腸頭前腸精巢后腸。多因素方差分析結(jié)果表明,自然條件下雌雄中華稻蝗對(duì)重金屬鎘和鉻的累積具有組織特異性,且兩種重金屬在中華稻蝗體內(nèi)的累積規(guī)律有所不同。二、為了研究重金屬鎘在植食性昆蟲中的累積和排泄規(guī)律,本文通過(guò)鎘慢性染毒的方法,用不同濃度鎘溶液培養(yǎng)的麥苗飼喂中華稻蝗,研究了食物鎘染毒對(duì)中華稻蝗形態(tài)特征的影響,采用原子吸收法測(cè)定不同齡期蟲體(2齡到成蟲)整蟲、糞便和蛻中的鎘蓄積量。研究結(jié)果表明,高濃度鎘對(duì)中華稻蝗的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用。整蟲鎘

4、蓄積規(guī)律為：對(duì)照組不同齡期中華稻蝗的鎘累積量較低,且各齡期間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異；處理組同一發(fā)育階段,鎘蓄積濃度以劑量依賴的方式增加,隨著中華稻蝗的生長(zhǎng)發(fā)育(從若蟲到成蟲),鎘累積濃度呈現(xiàn)先增加然后緩慢降低的規(guī)律。糞便中的鎘蓄積規(guī)律為：對(duì)照組4齡若蟲糞便中的鎘蓄積量最高,其它齡期糞便中鎘含量無(wú)顯著差異；處理組在同一發(fā)育階段,鎘在中華稻蝗糞便中的累積量隨著麥苗中鎘含量的增加而增加,且各處理間存在顯著差異。蛻中的鎘蓄積為：對(duì)照組2齡若蟲蛻中的鎘蓄積量最高,與其它齡期相比差異顯著；處理組隨著麥苗中鎘濃度的增加,蛻中鎘蓄積量顯著增加,且各處理間差異顯著。相關(guān)性分析表明,中華稻蝗蟲體、糞便和蛻中的鎘

5、蓄積量與食物鎘含量呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系。通過(guò)對(duì)不同發(fā)育階段中華稻蝗對(duì)鎘的蓄積和排泄規(guī)律研究,表明中華稻蝗取食染鎘麥苗后,可以通過(guò)糞便和蛻皮排出部分鎘,減輕鎘對(duì)中華稻蝗蟲體的毒性作用,但不同齡期中華稻蝗對(duì)鎘的蓄積和排泄能力有所差異。三、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS-transferases,GST)和羧酸酯酶(Carboxylesterase,CarE)是昆蟲體內(nèi)重要的解毒酶系,在內(nèi)源性和外源性化合物的解毒過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本文通過(guò)食物鎘慢性染毒研究了鎘對(duì)不同發(fā)育階段的中華稻蝗GST和CarE活性的影響。研究結(jié)果表明,不同發(fā)育期的中華稻蝗GST和CarE活性差異顯著,表明GS

6、T和CarE在中華稻蝗正常的生理代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用；鎘脅迫對(duì)中華稻蝗若蟲GST活性有誘導(dǎo)作用,表明GST可能參與若蟲對(duì)鎘的解毒過(guò)程,而由于發(fā)育階段生理代謝的差異,成蟲GST活性被鎘抑制。鎘濃度、發(fā)育階段和酶作用底物顯著影響中華稻蝗CarE活性。以a-NA為作用底物的測(cè)定結(jié)果顯示,鎘對(duì)2齡和5齡若蟲CarE活性具有顯著的誘導(dǎo)效應(yīng),而對(duì)其它齡期中華稻蝗CarE活性的無(wú)明顯的誘導(dǎo)效應(yīng)。以-NA為作用底物的測(cè)定結(jié)果顯示,2齡若蟲和3齡若蟲CarE活性在鎘脅迫下差異顯著。而4齡若蟲、5齡若蟲和成蟲的CarE活性在鎘脅迫下無(wú)顯著差異。兩種底物測(cè)定結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn),中華稻蝗CarE的活性以a-NA為底物測(cè)

7、定的活性大于以p-NA為底物時(shí)的活性。本研究結(jié)果顯示雖然GST和CarE可以作為環(huán)境鎘污染的監(jiān)測(cè)指標(biāo),但在研究GST和CarE對(duì)鎘的解毒機(jī)理方面,蟲體的發(fā)育階段及酶作用底物等都是需要充分考慮的因素。四、金屬硫蛋白(Meatllothionein,MT)能被重金屬等多種因素誘導(dǎo)。當(dāng)生物體受到鎘脅迫時(shí),可通過(guò)增加MT的表達(dá)以抵御重金屬的危害。為了系統(tǒng)研究鎘脅迫下中華稻蝗不同組織和不同發(fā)育階段MT的表達(dá)和鎘蓄積狀況,本研究通過(guò)食物鎘慢性染毒和急性鎘注射方法,研究了鎘對(duì)中華稻蝗MT的誘導(dǎo)效應(yīng),并采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行中華稻蝗MT基因片段的克隆。研究結(jié)果表明,MT在中華稻蝗不同組織的表達(dá)水平具有明顯的

8、組織特異性和劑量依賴性,其中中腸的鎘含量和MT表達(dá)水平最高；對(duì)照組不同發(fā)育階段中華稻蝗MT表達(dá)水平差異顯著,其表達(dá)順序依次為5齡3齡和成蟲4齡和2齡；而在同一發(fā)育階段,MT的表達(dá)水平與鎘蓄積濃度具有顯著的正相關(guān)關(guān)系；鎘急性注射未能誘導(dǎo)MT的表達(dá)。這一結(jié)果表明中華稻蝗MT可以作為環(huán)境鎘污染監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物。五、昆蟲能通過(guò)合成熱休克蛋白(Heatshockproteins,Hsps)來(lái)適應(yīng)外界壓力。Hsps作為分子標(biāo)記應(yīng)用于生態(tài)毒理學(xué)研究較傳統(tǒng)的生物學(xué)指標(biāo)更為敏感。本文通過(guò)RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)從中華稻蝗克隆獲得四個(gè)hsps基因的cDNA全長(zhǎng)序列,分別為葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(OcGrp78)

9、、熱休克蛋白70(Ochsp70)、熱休克蛋白90(Ochsp90)和熱休克蛋白40(Ochsp40)。本文采用Real-timePCR方法檢測(cè)了這四種熱休克蛋白基因在中華稻蝗不同組織部位和不同發(fā)育階段的表達(dá)。結(jié)果表明,中華稻蝗Hsps基因的表達(dá)具組織特異性和發(fā)育階段特異性,表明Hsps家族在中華稻蝗的發(fā)育過(guò)程中起著重要的生物學(xué)作用。鎘誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,急性鎘暴露能誘導(dǎo)OcGrp78、Ochsp70、Ochsp90和Ochsp40基因的表達(dá),且這四種hsps基因在鎘急性誘導(dǎo)下的表達(dá)模式基本相同：即在短時(shí)間(6h)內(nèi)表達(dá)量達(dá)最大值,12h時(shí)表達(dá)量已開(kāi)始明顯下調(diào),48h時(shí)降至對(duì)照水平或低于對(duì)照水平

10、；就誘導(dǎo)效率而言,Ochsp70的誘導(dǎo)效率最高,是對(duì)急性鎘脅迫最敏感的hsps基因。鎘慢性染毒結(jié)果顯示,OcGrp78、Ochsp70、Ochsp90和Ochsp40的表達(dá)模式明顯不同：食物鎘慢性染毒能引起OcGrp78、Ochsp90和Ochsp40基因表達(dá)不同程度的上調(diào),而長(zhǎng)期取食被鎘污染的食物則顯著抑制了Ochsp70基因的表達(dá)。根據(jù)本文研究結(jié)果,建議可將OcGrp78、Ochsp70、Ochsp90和Ochsp40作為環(huán)境鎘急性污染的分子標(biāo)記,其中Ochsp70對(duì)鎘脅迫最為敏感。而OcGrp78、Ochsp70、Ochsp90和Ochsp40是否可以作為鎘慢性污染的分子標(biāo)記還有待深入研

11、究。綜上所述,環(huán)境中的重金屬鎘可以通過(guò)食物鏈在中華稻蝗體內(nèi)蓄積于不同的組織部位。重金屬在中華稻蝗體內(nèi)的過(guò)量累積對(duì)中華稻蝗的形態(tài)特征(體長(zhǎng)、體重等)有抑制作用。中華稻蝗可通過(guò)體內(nèi)重要酶系、金屬硫蛋白和熱休克蛋白等的作用對(duì)機(jī)體形成保護(hù)作用。本研究為將中華稻蝗作為農(nóng)業(yè)環(huán)境中重金屬鎘污染的生物標(biāo)志物提供基礎(chǔ)資料?！娟P(guān)鍵詞】：中華稻蝗鎘解毒酶金屬硫蛋白熱休克蛋白【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)【學(xué)位級(jí)別】：博士【學(xué)位授予年份】：2012【分類號(hào)】：X174【目錄】：中文摘要12-15ABSTRACT15-19第一章前言19-331.1鎘概述19-221.1.1鎘的理化性質(zhì)191.1.2鎘污染概況19-201.

12、1.3鎘的毒性作用機(jī)理20-221.2昆蟲對(duì)鎘的解毒機(jī)制22-241.2.1昆蟲對(duì)過(guò)量鎘的儲(chǔ)存231.2.2昆蟲對(duì)鎘的排泄調(diào)控231.2.3抗氧化系統(tǒng)的作用23-241.2.4金屬結(jié)合蛋白的解毒241.3金屬硫蛋白概述24-281.3.1金屬硫蛋白的理化性質(zhì)25-261.3.2金屬硫蛋白的分類261.3.3金屬硫蛋白的生理功能26-271.3.4昆蟲金屬硫蛋白的研究概況27-281.4熱休克蛋白概述28-311.4.1熱休克蛋白的分類28-291.4.2熱休克蛋白的生物學(xué)功能29-301.4.3昆蟲熱休克蛋白的研究概況30-311.5本論文的研究?jī)?nèi)容及意義31-33第二章重金屬鎘和鉻在中華稻蝗

13、體內(nèi)的組織分布33-402.1材料與方法33-342.1.1樣本的采集33-342.1.2樣本的處理342.1.3重金屬含量測(cè)定342.1.4統(tǒng)計(jì)分析342.2結(jié)果34-372.2.1土壤樣本和水稻樣本鎘含量34-352.2.2鎘在中華稻蝗體內(nèi)的累積分布35-362.2.3鉻在中華稻蝗體內(nèi)的累積分布362.2.4鎘和鉻累積的多因素方差分析36-372.3討論37-402.3.1鎘在中華稻蝗體內(nèi)的組織分布37-382.3.2鉻在中華稻蝗體內(nèi)的組織分布38-392.3.3鎘、鉻的聯(lián)合作用39-40第三章中華稻蝗對(duì)重金屬鎘的累積和排泄40-493.1材料與方法41-423.1.1麥苗染毒413.1.

14、2中華稻蝗染毒處理413.1.3樣本的收集413.1.4形態(tài)特征測(cè)量413.1.5鎘含量的測(cè)定41-423.1.6數(shù)據(jù)處理423.2結(jié)果42-463.2.1麥苗中的鎘蓄積423.2.2鎘對(duì)中華稻蝗形態(tài)特征的影響423.2.3中華稻蝗體內(nèi)的鎘蓄積42-443.2.4中華稻蝗糞便中的鎘蓄積443.2.5中華稻蝗蛻中的鎘蓄積44-453.2.6中華稻蝗鎘蓄積與麥苗鎘含量的相關(guān)性45-463.3討論46-49第四章鎘對(duì)中華稻蝗谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和羧酸酯酶活性影響49-624.1材料和方法49-514.1.1主要儀器和試劑49-504.1.2鎘慢性染毒504.1.3酶液提取504.1.4酶活測(cè)定50-5

15、14.1.5數(shù)據(jù)處理514.2結(jié)果51-594.2.1鎘在麥苗中的累積51-524.2.2谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性變化52-534.2.3羧酸酯酶活性變化53-584.2.4多因素方差分析58-594.3討論59-62第五章鎘誘導(dǎo)中華稻蝗金屬硫蛋白表達(dá)及鎘蓄積研究62-755.1材料與方法62-655.1.1實(shí)驗(yàn)材料625.1.2主要試劑和儀器62-635.1.3鎘慢性染毒635.1.4鎘急性染毒635.1.5鎘濃度的測(cè)定635.1.6MT含量測(cè)定63-645.1.7MT基因cDNA全長(zhǎng)的克隆64-655.1.8數(shù)據(jù)分析655.2結(jié)果65-715.2.1中華稻蝗不同組織部位的鎘蓄積665.2.2

16、中華稻蝗不同組織部位的MT表達(dá)66-675.2.3中華稻蝗不同組織部位鎘蓄積與MT表達(dá)的相關(guān)性675.2.4中華稻蝗不同發(fā)育階段的鎘蓄積675.2.5中華稻蝗不同發(fā)育階段的MT表達(dá)67-695.2.6中華稻蝗不同發(fā)育階段鎘蓄積和MT表達(dá)的相關(guān)性695.2.7鎘急性誘導(dǎo)中華稻蝗MT的表達(dá)695.2.8中華稻蝗MT基因cDNA片段的克隆69-715.3討論71-755.3.1鎘濃度的選擇715.3.2中華稻蝗不同組織部位的鎘蓄積和MT表達(dá)71-725.3.3中華稻蝗不同發(fā)育階段的鎘蓄積和MT表達(dá)72-735.3.4鎘急性誘導(dǎo)中華稻蝗MT表達(dá)735.3.5中華稻蝗MT基因克隆結(jié)果分析73-745.3

17、.6MT與環(huán)境鎘污染監(jiān)測(cè)74-75第六章中華稻蝗熱休克蛋白基因cDNA全長(zhǎng)克隆及鎘脅迫條件下的表達(dá)75-956.1材料與方法75-806.1.1主要儀器和試劑75-766.1.2實(shí)驗(yàn)材料766.1.3PCR引物設(shè)計(jì)766.1.4總RNA提取和第一鏈cDNA合成766.1.5中華稻蝗hsps基因cDNA片段的克隆76-786.1.65和3末端基因序列的擴(kuò)增78-796.1.7序列分析796.1.8中華稻蝗hsps基因的定量分析79-806.2結(jié)果80-906.2.1中華稻蝗hsps基因的全長(zhǎng)序列分析80-866.2.2中華稻蝗hsps基因的組織特異性表達(dá)86-876.2.3中華稻蝗hsps基因在不同發(fā)育階段的特異性表達(dá)87-886.2.4