N端和C端結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑2X的組裝是非必要的

1、N端和C端結(jié)構(gòu)域在P2X內(nèi)的組裝是分散的單克隆抗體免疫共沉淀（抗FLAG,抗HA）的非離子洗滌劑過去也被用作為探針，通過考察P2X2缺失突變體和嵌合能力與在HEK293細(xì)胞全長P2X2和P2X3亞基的關(guān)聯(lián)來探查在HEK293細(xì)胞中P2X2受體裝配100。免疫共沉淀顯示無論是胞內(nèi)功能區(qū)的N端還是C端結(jié)構(gòu)域（直到28rP2X2殘基和362rP2X2遠(yuǎn)端殘基，分別對應(yīng)30zfP2X4 和370zfP2X4）都不是全長rP2X2 或 rP2X3 亞基細(xì)胞表面表達(dá)和組裝所必需的。此外，通過7nAChR信號肽裂解置換 rP2X2殘基 1-50 （包括整個(gè)TM1螺旋）并沒有阻止全長rP2X2 或 rP2X3

2、 亞基的免疫共沉淀，這些數(shù)據(jù)在很大程度上排除了胞質(zhì)內(nèi)N端或C端結(jié)構(gòu)域或TM1螺旋在亞基識別方面的序列特異性作用。100BN-PAGE直接顯示了胞內(nèi)C端結(jié)構(gòu)域的三聚體的分散性，表明了hP2X5結(jié)構(gòu)可以控制exon-10 residues (hP2X5+exon10)的插入，但是缺乏整個(gè)細(xì)胞內(nèi)C端結(jié)構(gòu)域（residues R365hP2X5+exon10 onwards）也可以和同源三聚體一樣高效率的組裝。101這三種基本殘基覆蓋在突變體胞內(nèi)C端結(jié)構(gòu)域的最末端。363KKR365hP2X5+exon10 （對應(yīng)著365KKR367zfP2X4)最有可能作為符合“正電荷居內(nèi)規(guī)則”的拓?fù)浠虻男盘?0

3、2。由截去zfP2X4結(jié)構(gòu)(residues 27-381zfP2X4 對應(yīng) 25-379hP2X5+exon10) 的N端和C端結(jié)構(gòu)域組成的同源三聚體晶體結(jié)構(gòu)證實(shí)了N端結(jié)構(gòu)域和至少一部分C端結(jié)構(gòu)域的組裝是有分散性的。TM2通過限制胞外結(jié)構(gòu)域的折疊空間影響組裝通過觀察截去了R304rP2X2 （對應(yīng)著R312zfP2X4 or R310rP2X5 見圖5A5A ）并且刪除了pre-TM2區(qū)（相當(dāng)于 strand 14 of the zfP2X4結(jié)構(gòu)）可以推斷出TM2螺旋在同源和雜合三聚體中扮演著重要角色，并且TM2螺旋阻止了全長P2X2或P2X3亞基的組裝以及自我的組裝100。這種觀點(diǎn)是通過兩

4、嵌合體組成的胞外段兩側(cè)的包括rp2x3跨膜螺旋（x3-x1-x3），反之亦然（x1-x3-x1）的P2X1 N-和C-末端結(jié)構(gòu)域的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持100。在HEK293細(xì)胞中，理由是WT P2X6可以裝配rp2x1但不與rp2x3共表達(dá)103。有趣的是，x1-x3-x1嵌合體可以與WT rp2x6亞基共沉淀，而x3-x1-x3和WT P2X3不行100,103。這一發(fā)現(xiàn)被解釋為支持一個(gè)觀點(diǎn)，TM螺旋懷有對P2X亞基組裝很關(guān)鍵的特異識別基序。為了研究在P2X亞基組裝中TM2螺旋的作用，我們利用WT P2X5亞基發(fā)生在人類僅僅作為一種缺乏pre-tm2區(qū)和大部分的TM2螺旋由于剪接10外顯

5、子跳躍自然缺失突變體的事實(shí)（圖5A5A）指定為hP2X5328-349，而hp2x5328-349不作為一個(gè)功能性的ATP門控離子通道表達(dá)。WT rp2x5 cDNA，其中包括exon-10密碼子，導(dǎo)致典型的P2X受體介導(dǎo)的電流表達(dá)104。通過BN-PAGE，我們可以證明，全長rp2x5亞基高效的組裝為三聚體，而exon-10-lacking hp2x5只形成高階的聚集體，完全保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)101。盡管這些研究結(jié)果證實(shí)，TM2螺旋對P2X亞基的高效組裝是絕對必須的，但是認(rèn)為TM2螺旋能夠提供特定亞基識別信息 100 原來是站不住腳的，至少對于P2X5亞基來說。結(jié)果的發(fā)生是因?yàn)橛捎趶V泛的丙氨酸和亮

6、氨酸的塊替換使TM2螺旋通道功能受損，但是分別通過限制性蛋白水解與BN-PAGE顯示擾亂折疊或者三聚體均不能做為探針。在exon-10-lacking hp2x5亞基的情況下（hp2x5328-349）丙氨酸拉伸的足夠長，排除了疏水性不匹配，而是被迫通過剪接跳過一半的TM2螺旋激活組裝的同源三聚體和跨膜段的形成101?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)與全長TM2螺旋對同源三聚體的作用是作為二膜錨的支架的觀點(diǎn)完全契合101。通過C端結(jié)構(gòu)域的末端與細(xì)胞膜的鏈接，TM1和TM2之間形成了一環(huán)狀結(jié)構(gòu)，限制了胞外結(jié)構(gòu)的空間移動(dòng)，并且因此限制了折疊空間。這種結(jié)構(gòu)可以通過識別細(xì)胞表面幫助正確定位以及允許更高效的碰撞發(fā)生，從而

7、防止相鄰型之間的聚集來協(xié)助組裝。所有第二跨膜結(jié)構(gòu)域的形成的序列操作，包括包括在hp2x5外顯子10缺失（圖5a5a）也會(huì)造成嚴(yán)重的亞基聚合。關(guān)于同源亞基與亞基之間相互作用的特定信息必須位于胞外段101的研究的結(jié)論通過zfp2x4晶體結(jié)構(gòu)被支持。表明亞基間的聯(lián)系主要由胞外區(qū)提供1,2。三種TM1螺旋在三種TM2螺旋的外面，這種結(jié)構(gòu)形成了線性排列的中心離子通道2。在TM2螺旋內(nèi)（在Leu340zfP2X4, Leu346zfP2X4 and Ala347zfP2X4之間）有一些膜內(nèi)連接，用于穩(wěn)定關(guān)閉的通道。在ATP結(jié)合的反應(yīng)中，當(dāng)TM螺旋從中央軸移動(dòng)到開放的通道時(shí)，這些膜內(nèi)連接便破裂了。因此，盡管

8、出現(xiàn)了明顯的差異，但是同時(shí)，新的穩(wěn)定開放通道的亞單位鏈接（包括Leu346zfP2X4 and Ile355zfP2X4）也形成了。D355rP2X5，由拓?fù)渌惴A(yù)測屬于TM2螺旋，是唯一確定支持hp2x5亞基同源三聚體相關(guān)程度的的熱點(diǎn)殘基101。D355rP2X5通過穿過所有7種P2X受體亞型被保護(hù)起來。我們認(rèn)為它是一個(gè)有趣的候選，作為組裝的中介，在TM1螺旋的末端殘基驅(qū)動(dòng)二聚體或者三聚體形成的過程中105,106。然而根據(jù)zfP2X4受體的晶體結(jié)構(gòu)，相應(yīng)的D357zfP2X4殘基應(yīng)局限在TM2螺旋末端內(nèi)側(cè)（圖5B5B）。在這個(gè)位置上，相比于亞基的組裝，通過其帶負(fù)電荷的鏈身與脂質(zhì)頭部基團(tuán)相互

9、作用在TM2螺旋與細(xì)胞膜之間發(fā)揮更好的作用。TM螺旋在P2X受體功能性上的相互作用雖然事實(shí)上形成成熟的同源三聚體結(jié)構(gòu)并不需要特定序列TM2之間的相互作用，但是不能夠排除TM螺旋作為ATP門控通道對P2X受體的功能起著重要的作用。的確，有證據(jù)通過洗滌劑表明通過zfP2X4受體結(jié)構(gòu)能夠使包裝松散的TM螺旋顯露出來，這些洗滌劑總是優(yōu)先占據(jù)體積較大，圍繞大的水溶性膜蛋白的疏水區(qū)域107。支持這一觀點(diǎn)的證據(jù)來自觀察:在zfP2X4結(jié)構(gòu)中的高度傾斜纏繞的TM螺旋會(huì)導(dǎo)致極薄的疏水層的形成（< 20 Å），這些疏水層太薄以至于無法跨過原生膜。The suggestion that the in

10、termonomer fenestrations seen in the structure leave the channel pore open to the fatty acyl environment 107 could be demonstrated by a molecular dynamics simulation of the membrane-embedded zfP2X4 。相對溫和的TM螺旋結(jié)構(gòu)重排，足以提高疏水性的不匹配，并且通過TM螺旋更緊密的組裝導(dǎo)致在膜之間形成了一個(gè)內(nèi)界面108。以下的兩個(gè)界面是確定的：(i)TM殘基L351rP2X2，一個(gè)亞基的I355rP2X和

11、W358rP2X2與相鄰TM2螺旋上的 L346rP2X2, A347rP2X2和 V354rP2X2相互作用。(ii)TM1殘基Y45rP2X2 和相鄰TM2亞基的L340rP2X2 相互作用108。大量關(guān)于在打開狀態(tài)的膜內(nèi)嵌入受體內(nèi)的緊縮TM螺旋包裝的計(jì)算和實(shí)驗(yàn)證據(jù)也能從在每個(gè)獨(dú)特的亞單位中 rP2X2受體內(nèi)的S345CrP2X2, C348rP2X2 (TM2)和H/C33rP2X2 (TM1)之間的金屬橋梁的功能分析推斷出來108。The close intrasubunit proximity of TM1 and TM2 was also evident from disulfid

12、e trapping experiments of an H33C/S345CP2X2mutant【109】。有趣的是，李和他的同事早在2010便提出了一個(gè)觀點(diǎn)，即在關(guān)閉狀態(tài)的 zfP2X4 結(jié)構(gòu)中，在孔區(qū)亞單位與亞基之間的相互作用受閘區(qū)的限制，這表明在通道開放時(shí)孔隙增大，其他亞基亞基之間的鏈接可以穩(wěn)定孔區(qū)結(jié)構(gòu)，同時(shí)表明TM1殘基H33與在開放孔區(qū)內(nèi)的相鄰的兩個(gè)TM2上的殘基S345相互作用6。基于 ZFP2X4晶體結(jié)構(gòu)的測繪基礎(chǔ)點(diǎn)為了確定對zfP2X4亞基組裝有潛在作用的連接斑塊，我們可視化溶液可及的van der Waals表面相互作用根據(jù)表面的疏水性和靜電電位相互作用（圖22）。通過考慮

13、相鄰兩個(gè)亞基之間的原子 < 4.5 Å的van der Waals表面區(qū)域，亞基與亞基之間的接觸面在開放和關(guān)閉的狀態(tài)下可以被可視化圖33）。相鄰亞基通過靜電作用或通過氫鍵或疏水的特殊殘基（范德華力）被列出在表11中。圖2表面暴露的側(cè)鏈與zfP2X4亞單位相互作用，顯示的是在受體單個(gè)亞基上的表面暴露側(cè)鏈在載脂蛋白封閉狀態(tài)下的表現(xiàn)(left panel; PDB entry 4DW02)，并且結(jié)合ATP開放了相鄰兩個(gè)zfP2X4亞基的接觸面。圖3表1基于zfp2x4受體的晶體結(jié)構(gòu)的亞基與亞基間相互作用位點(diǎn)的計(jì)算預(yù)測，在小于4.5Å的zfp2x4受體的晶體結(jié)構(gòu)中通過應(yīng)用該過

14、濾器的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算的數(shù)據(jù)224,225。ATP結(jié)合位點(diǎn)在最近一些關(guān)于這個(gè)課題優(yōu)秀的綜述中提及了幾位優(yōu)秀的審稿人，同時(shí)包含廣泛的背景信息110-115。這些綜述中包含了關(guān)于結(jié)合ATP的幾個(gè)突變殘基的特別全面的和有價(jià)值的表格概述116。在預(yù)期集中在胞外結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)中嘗試定位ATP結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)被保護(hù)在7種P2X受體的亞基中。相應(yīng)的殘基突變?yōu)楸彼峄蛘甙腚装彼?，而且表達(dá)的突變體的電生理特點(diǎn)可以與ATP的動(dòng)作電位相比。這種方法確定了一系列的帶正電荷的殘基（通過上標(biāo)來表明P2X的種類和亞基），例如K68hP2X1, K70hP2X1, R292hP2X1 and K309hP2X1（對應(yīng)K70zfP

15、2X4, K72zfP2X4, R298zfP2X4 and K316zfP2X4）（圖44，5D5D），殘基末端T186hP2X1 and N290hP2X1 (T189zfP2X4 and N296zfP2X4) （圖44，5D5D），芳香族殘基F185hP2X1and F291hP2X1 (F188zfP2X4 and F297zfP2X4)和其他34.117-132。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，ATP結(jié)合位點(diǎn)（S）可以在兩相鄰亞基的界面產(chǎn)生氧化反應(yīng)，通過半胱氨酸的亞單位交聯(lián)鍵被殘基取代，這個(gè)過程對于ATP高效的運(yùn)作是必不可少的。當(dāng)rp2x1受體在非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)時(shí)，在兩個(gè)被代替的兩個(gè)位于胞外結(jié)構(gòu)

16、域的半胱氨酸K68CrP2X1 and F291CrP2X1（圖5E5E）之間自發(fā)形成亞單位交聯(lián)鍵133。其他六對殘基的半胱氨酸突變(K70rP2X1, F185rP2X1, K190rP2X1, R292rP2X1, R305rP2X1, and K309rP2X1)沒有導(dǎo)致亞單位交聯(lián)鍵形成。圖4在zfp2x4亞單位受體激動(dòng)劑結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)ATP的配位，在PDB entry 4DW12顯示了在ATP復(fù)合體中開放狀態(tài)下的zfP2X4受體結(jié)構(gòu)的亞單位ATP結(jié)合區(qū)域，選擇多肽主鏈的副鏈此外，在一個(gè)基于賴氨酸殘基，與ATP的結(jié)合和位于附近的受體胞外段兩端的丙氨酸替換的研究K69rP2X2 and K30

17、8rP2X2以及 K68rP2X3 and K299rP2X3對rp2x2和rp2x3受體結(jié)合的ATP是必不可少的，得出的結(jié)論是，受體激動(dòng)劑結(jié)合位點(diǎn)位于兩相鄰亞基的亞基之間的界面129。最終確認(rèn)這些代表ATP結(jié)合槽的亞單位槽由ATP結(jié)合的開放狀態(tài)的zfp2x4受體的結(jié)晶提供2。三磷酸鏈和ATP分子腺嘌呤環(huán)形成U形結(jié)構(gòu)在ATP結(jié)合槽內(nèi)。ATP的磷酸氧化是由一條鏈上的K70zfP2X4 and K72zfP2X4和相鄰的另一條鏈上的N296zfP2X4, R298zfP2X4 and K316zfP2X4相互配合的（圖44）。與半胱氨酸的巰基反應(yīng)的ncs-atp P2X2受體突變體的一致性顯示，L

18、191zfP2X4（見圖5F5F，與L186rP2X2相對應(yīng)）與I232zfP2X4之間的疏水相互作用使ATP的腺嘌呤相互協(xié)調(diào)。腺嘌呤基通過T189zfP2X4的側(cè)鏈和主鏈上與K70zfP2X4主鏈的氫鍵使其更加穩(wěn)定2（圖44）。核糖通過L217zfP2X4疏水鍵相互作用部分分解被認(rèn)為是唯一的2。在不同受體不同亞基上的ATP結(jié)合位點(diǎn)的特殊序列最近通過同源建模被發(fā)現(xiàn)134。突變數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)解釋提供了關(guān)于ATP結(jié)合關(guān)鍵觀點(diǎn)E52-G96hP2X1胞外殘基的半胱氨酸掃描誘變結(jié)合綜合藥理分析，通過巰基特異性試劑顯示的32P2-azido-ATP交聯(lián)鍵和半胱氨酸突變體確定K68hP2X1, K70hP2X

19、1 and F92hP2X1殘基分別激活或抑制hP2X1受體通過受體激活劑和拮抗劑蘇拉明135。繪制E52hP2X1-G96hP2X1與hP2X1側(cè)翼區(qū)的半胱氨酸掃描突變體模型的數(shù)據(jù)127,128和在硅分子上對接的ATP和BzATP 提供的ATP結(jié)合位點(diǎn)的同源模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致135。hP2X3丙氨酸突變體的功能分析確定了保守殘基對ATP結(jié)合在hp2x3受體上很重要，包括基本殘基K63hP2X3, K65hP2X3, K176hP2X3, K299hP2X3 and R281hP2X3 （圖5D5D）殘基末端G66hP2X3, N177hP2X3, N279hP2X3, and T172hP2

20、X3和芳香烴殘基F171hP2X3 and F280hP2X3。hP2X3 受體上已知?dú)埢耐茨Ｐ偷念A(yù)測顯示在ATP識別方面，殘基在亞基界面上是以組的形式被聚集成一組殘基，而不是單個(gè)殘基136。在使用8-thiocyano-atp（ncs-atp）衍生物與ATP分子的腺嘌呤環(huán)的位置8的巰基反應(yīng)組的巧妙的研究中，P2X2受體的ATP結(jié)合位點(diǎn)被暴露出來3。半胱氨酸在相鄰兩個(gè)亞基上被取代，并且分開18Å (N140CrP2X2 and L186CrP2X2; 圖. 5F5F)，這個(gè)現(xiàn)象說明通過NCS-ATP被共價(jià)標(biāo)記了的被追蹤的受體處在共價(jià)結(jié)合狀態(tài)，并且通過栓系的位置，增強(qiáng)(L186Cr

21、P2X2)或減弱(L140CrP2X2)調(diào)節(jié)門控通道的能力。這些結(jié)果表明在亞基界面的ATP結(jié)合位點(diǎn)在ATP上的定位受限于受體調(diào)節(jié)門控通道的概率3。在隨后的研究中NCS-ATP受限于L186CrP2X2產(chǎn)生的ATP結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)象的改變，但是不會(huì)改變通道的開放，這表明調(diào)控和預(yù)激活狀態(tài)的存在指導(dǎo)P2X2受體的門控通道137。關(guān)于P2X1受體的電壓鉗法研究用四甲基馬來酰亞胺(TMRM)標(biāo)記的半胱氨酸殘基取代在位于C117rP2X1/C126rP2X1之間（圖5G5G）的第一保守二硫橋之間的拉伸的殘基，C117rP2X1/C126rP2X1定位在頭域的基部，用于分析ATP的激活，門控通道和脫敏現(xiàn)象10。通

22、過同源模型和ATP對接的三維演示表明頭域的基部對著ATP結(jié)合位點(diǎn)，ATP的核糖集團(tuán)對著細(xì)胞液，解釋了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。TMRM與經(jīng)過設(shè)計(jì)的半胱氨酸殘基共價(jià)鏈接表明了配體的結(jié)合(N120CrP2X1, E122CrP2X1, and G123CrP2X1)，構(gòu)象改變與通道開放的關(guān)聯(lián)(G115CrP2X1 and G124CrP2X1)，和脫敏現(xiàn)象(P121CrP2X1 and I125CrP2X1) 10。熒光ATP衍生的Alexa-647-ATP可以作為可視化配體結(jié)合和分離有效的工具。P2X1受體的持久脫敏特點(diǎn)是緩慢釋放拮抗劑和激動(dòng)劑誘導(dǎo)的受體內(nèi)在化138。有趣的是，與巰基反應(yīng)的熒光染料Alexa-F

23、luor 546 C5-maleimide 一般ATP不敏感的K69CrP2X2突變體P2X2受體導(dǎo)致通道的門控（開放）對鋅，酸性PH和缺乏ATP的情況做出反應(yīng)139，這可能使活化機(jī)理研究獨(dú)立于ATP結(jié)合。ATP結(jié)合位點(diǎn)的內(nèi)在動(dòng)力學(xué)影響ATP的結(jié)合和隨后的變構(gòu)變化一項(xiàng)hP2X3受體的研究中利用在內(nèi)部和亞單位區(qū)域之間的臨近位置的分子動(dòng)力學(xué)模擬及半胱氨酸氧化交聯(lián)鍵的替換，例如頭區(qū)和背部，背部和左側(cè)。它表明ATP結(jié)合位點(diǎn)會(huì)自發(fā)的發(fā)生構(gòu)象改變，即使沒有ATP140。有趣的是，自發(fā)交聯(lián)的K201ChP2X3（背部）和V274ChP2X3（左側(cè)部）（圖5H5H）能夠阻止ATP結(jié)合在受體上，通過分析與 -m

24、eATP均等的熒光ATP衍生物BODIPY-TR ATP 。得出的結(jié)論是高構(gòu)象的域構(gòu)成的ATP結(jié)合槽是激活位點(diǎn)和活化受體的先決條件140。此外，在zfp2x4受體中ATP的識別是通過頭域的內(nèi)在動(dòng)力學(xué)測定141。在左側(cè)和背側(cè)的因ATP產(chǎn)生和ATP缺乏的內(nèi)在動(dòng)力學(xué)改變引起的構(gòu)象改變同樣通過分子動(dòng)力學(xué)和zfp2x4受體的簡正波分析法顯示出來，并且通過在左側(cè)和背側(cè)的動(dòng)力鋅橋以及半胱氨酸的交聯(lián)被證實(shí)142。開放P2X受體所需要的ATP分子由克隆rp2x2受體介導(dǎo)ATPATP的濃度反應(yīng)引起全細(xì)胞電流產(chǎn)生的希爾系數(shù)為2.0，表明激活位點(diǎn)需要一個(gè)以上的激動(dòng)劑分子結(jié)合20。從對rp2x2受體介導(dǎo)的電流單通道記錄ATP的濃度依賴性估計(jì)一個(gè)類似的ATP激活的希爾系數(shù)是2.3 143。由此說明對于重要的配體結(jié)合位點(diǎn)的量化，希爾系數(shù)是不可靠的，即使在強(qiáng)大的正協(xié)同效應(yīng)的情況下，希爾指數(shù)也只提供最低限度的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)144。因此，希爾系數(shù)為2.3表明在一個(gè)有活性的P2X2受體至少有三個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)。數(shù)據(jù)的動(dòng)力學(xué)造模表明，結(jié)合位點(diǎn)是不獨(dú)