十二指腸液Kras癌基因檢測在膽管癌早期診斷中的應用價值

1、十二指腸液K-ras癌基因檢測在膽管癌早期診斷中的應用價值【摘要】 目的 探討十二指腸液標本中K-ras癌基因檢測對膽管癌早期診斷的價值。方法 應用DNAzolR 試劑提取DNA，通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction restriction fragment length polymorplism，PCR-RFLP）法分析，檢測30例膽管癌患者和10例良性膽道疾病患者膽汁及十二指腸液標本中上清液及沉渣的K-ras基因突變情況。結(jié)果 膽管癌組膽汁標本的上清液中K-ras基因突變檢測的陽性率為56.7%；相應的十二指腸液標本陽性率為43%。良性

2、膽道疾病組僅膽汁標本檢出K-ras基因突變1例，良惡性疾病組比較差異有統(tǒng)計學意義P<0.005），膽管癌K-ras基因突變的檢出率在上清液組中明顯高于沉渣組，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義P<0.005），對于膽管刷檢陰性的膽管癌患者，檢測膽汁中K-ras基因突變的陽性率仍可達39.3%。結(jié)論 應用DNAzolR 試劑能有效提取到膽汁及十二指腸液標本中的DNA，十二指腸液K-ras基因檢測可能有助于膽管癌的早期診斷。 【關(guān)鍵詞】 膽管腫瘤 K-ras基因 十二指腸液 Abstact Objecive To explore the applied value of dete

3、ction of K-ras gene mutations in the duodenal juice of patients with biliary tract carcinoma (BTCa) in early diagnosis. Methods DNA was extracted using DNAzolR reagent. The situation of K-ras mutation in the supernant and sediments in the sample of bile and duodenal in 30 cases with BTCa and 10 case

4、s with benign choledocholithiasis were detected with PCR-RFLP. Results The positive rates of assay with K-ras gene mutations in bile supernatant of patients with BTCa were 56.7%. Accordingly， the positive rates of those in duodenal juice were 43%. Only one case K-ras gene mutation was detected in be

5、nign choledochlithiasis. Statistic analysis showed there was significant difference in those gene mutation between BTCa group and benign group(P<0.005). Positive rate of K-ras gene mutations was higher in the supernatant than that in the sediments (P<0.005). For the negative of bile du

6、ct brushing in BTCa, positive rates of assay with K-ras gene mutation could still reach 39.3%. Conclusions DNA can be extracted from bile and duodenal juice with DNAzolR reagent. Assay with K-ras gene mutations in duodenal juice may be useful for early diagnosis of biliary tract carcinoma. Key words

7、 biliary tract neoplasms； K-ras gene； duodenal juice 膽管癌系高度惡性腫瘤，以往認為其發(fā)病率低，近年來隨著現(xiàn)代醫(yī)學診療技術(shù)的發(fā)展，膽管癌的發(fā)病率也不斷上升，同時對此病的診治也不斷取得進展，但由于膽管癌的解剖部位隱匿，早期診斷仍非常困難，一旦發(fā)現(xiàn)多為晚期，致使手術(shù)切除率低，預后差。發(fā)展新的篩選和診斷手段，是提高膽管癌早期診斷率和改善膽管癌預后的關(guān)鍵。 我們采用分子生物學技術(shù)，對膽管癌患者的膽汁和十二指腸液中的癌基因K-ras的突變進行檢測，探討這種檢查方法在膽管癌的早期診斷或在膽管癌篩查中的應用價值。 1 對象和方法 11 對象 本課題實驗研究

8、對象均為2004年02月至2005年02月間在本院的住院患者，其中包括：膽管癌組共30例，男/女為19/11，年齡為3089歲，平均年齡為（62±14）歲。其他良性膽道疾病組（對照組）共10例，男/女為6/4，年齡為2878歲，平均年齡為（54±15）歲，均為膽結(jié)石患者。上述病例的診斷均經(jīng)細胞學檢查或手術(shù)探查證實。膽管癌組的病例中，按照Bismuth分型，型13例，型7例，A2例，B3例，型5例。 12 方法 121 標本的來源 所有病例的十二指腸液標本均通過十二指腸引流管獲取。膽管癌組的膽汁標本通過逆行胰膽管造影術(shù)（endoscopic retrograde cholan

9、gio-pancreatography， ERCP)膽管插管后抽取，良性膽道疾病對照組的膽汁標本均通過術(shù)后T管引流處獲取。 所有標本獲取后迅速在常溫下2000 r/min離心20 min，分成上清液和沉渣兩部分，并即時凍存于-80以備DNA提取。 膽管癌組的患者，在ERCP時，同時行膽道刷檢術(shù)，作細胞學檢查。 122 標本的DNA提取 從-80取出標本，室溫下溶解后，取1 ml標本，按DNAzolR reagent(Cat.No:10503-027,CAS.No:593-84-0; Invitrogen TM,US)的說明書步驟提取DNA：標本的溶解勻化：培養(yǎng)血細胞（約1×107細胞

10、）+1 mlDNAzolR搖勻。標本的離心：室溫下離心（10 000 g、10 min）后，將上清液移至新試管。DNA的收集：上清溶解液中加入0.5 ml 100%乙醇每1 ml DNAzol，上下顛倒混勻，室溫下靜置3 min，再離心（4 000 g、12 min）后，靜置1 min，然后吸去管內(nèi)液體。DNA的洗滌：于試管中加入1 ml 75%乙醇，上下顛倒混勻36次后，靜置1 min，吸去乙醇，此步驟至少重復兩次后，讓標本在空氣中自然干燥。DNA的溶解：于試管中緩慢加入100 ?滋l 8 mM NaOH 溶解DNA，然后在4 -20 下貯存?zhèn)溆谩?123 引物設(shè)計 所有引物的設(shè)計由本院分子

11、生物實驗室，根據(jù)Pubmed的Genome數(shù)據(jù)庫，自行設(shè)計提供。引物合成是委托上海生物工程公司合成。 124 K-ras基因第12密碼突變的檢測 采用突變富集聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）法，可以檢測出第一外顯子第12密碼子的突變。引物序列KR-F：5ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT3；KR31-R：5TCAAAGAATGGTCCTGGACC3；KR32-R：5TGCACCAGTAATATGCATAT3。 經(jīng)2

12、次PCR及2次酶切反應，酶切產(chǎn)物行3%瓊脂糖凝膠電泳，凡出現(xiàn)143bp的突變帶者，都認為是有K-ras基因第12突變，否則認為其是野生型。實驗過程中以滅菌去離子水為PCR反應模板作陰性對照；每份標本至少重復實驗兩次。 13 統(tǒng)計學方法 兩組間異常率的比較用四格表?字2檢驗。 2 結(jié)果 膽管癌組和良性膽道疾病組的膽汁標本和十二指腸液標本上清液標本組的K-ras 基因突變檢出率的比較見表1；檢測結(jié)果分別見圖1及圖2。膽管癌組不論是膽汁標本還是十二指腸液標本K-ras基因檢測異常率均明顯高于良性膽道疾病組，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P0.05）。 膽管癌組的膽汁標本和十二指腸液標本的上清液組和沉渣組

13、K-ras 基因突變的檢出率比較見表2；膽管癌組K-ras基因突變率在膽汁及十二指腸液的上清液標本中明顯高于沉渣組，兩者相比較差異有統(tǒng)計學意義，見表2。 膽管癌組細胞刷檢癌細胞陽性、可疑陽性或陰性K-ras基因突變率的比較見表3；膽管癌組細胞刷檢癌細胞陰性的患者膽汁標本中K-ras基因突變率低于癌細胞陽性組或癌細胞可疑陽性組，但是該組患者膽汁標本中的K-ras基因突變的檢出率仍達39.3%。 3 討論 膽管癌患者的預后總體很差，其很大程度上取決于確診時疾病所處的階段，大約有20%的肝門部膽管癌患者在得到診斷時已沒有手術(shù)治療的可能，剩余者在剖腹探查時又有近一半的患者僅能行姑息性治療，故可根治切除

14、的病例僅占總數(shù)的30%1，由此我們認識到，對膽管癌的早期診斷已成為膽管癌治療的關(guān)鍵，探討研究膽管癌早期診斷方法是一個重大的課題。 31 檢測K-ras癌基因突變在膽管癌診斷中的價值 癌基因是指能導致細胞惡化的核酸片段，是指在自然或試驗條件下，具有潛在的誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化的基因。目前對K-ras癌基因的研究最為廣泛和深入2-4。在許多人類的腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有ras基因的點突變，ras基因是一種原始保守的基因，其結(jié)構(gòu)與功能從真菌到人類基本一致5。K-ras癌基因位于人類第12號染色體，編碼分子質(zhì)量為21000的GTP/GDP結(jié)合蛋白-P21蛋白，P21蛋白與G蛋白有關(guān)，在細胞生長刺激信號的傳遞和細胞生長

15、調(diào)節(jié)中起著一定的作用6。人體細胞的K-ras原癌基因在正常情況下呈低水平表達，參與調(diào)節(jié)和維持正常細胞的功能，當受到各種因素激活后，被激活的癌基因大量表達，產(chǎn)生特異性轉(zhuǎn)化蛋白，最終導致正常細胞的癌變。膽管癌主要與K-ras癌基因的突變有關(guān)，有大量的文獻報道膽管癌患者K-ras癌基因突變檢出率在53%79%7-9。本資料中膽管癌組的膽汁標本及十二指腸液標本中K-ras癌基因突變檢出率為56.7%和43.3%，而良性膽道疾病組中，除膽汁標本發(fā)現(xiàn)1例K-ras基因突變陽性外，其余病例均未發(fā)現(xiàn)變異，兩組比較K-ras癌基因的突變率差異有顯著性，提示K-ras癌基因的檢測有助于膽管癌的診斷。 32 標本D

16、NA提取及檢測方法的選擇與優(yōu)化 本課題在預實驗中曾經(jīng)采用傳統(tǒng)DNA提取法蛋白酶K消化、酚氯仿抽取法進行操作，但無法提取到有效的DNA，改用DNAzolR試劑則較好地解決了問題，這表明從標本中無法提取到有效DNA，不是細胞或細胞成分缺乏,而是可能存在PCR抑制物，結(jié)合文獻報道,認為這可能與標本中膽鹽和膽紅素有關(guān)10。通過采用DNAzolR試劑，用 75%乙醇混勻?qū)NA進行反復的洗滌和純化，從而有效去除此類物質(zhì), 成功地提取到有效的DNA。DNAzolR試劑是一個能對來源廣泛的樣本基因組DNA進行分離的試劑，它基于采用了一個新的胍去垢劑溶解液，這個溶解液能夠有選擇性地促進細胞溶解物中DNA的沉淀

17、。應用DNAzolR試劑可以在1030 min內(nèi)完成DNA的提取，并能回收到70%100%的DNA。同時DNAzolR試劑允許不論樣本體積大小的大量基因組DNA進行分離，且其實驗原始記錄簡單快捷，因此，應用DNAzolR試劑是一個可靠、高效和簡便的DNA提取法，有助于實驗的成功。 對K-ras癌基因第12密碼突變的檢測，采用突變富集PCR-RFLP法，可以檢測出第一外顯子第12密碼子的突變。 本實驗中對膽管癌組的膽汁標本和十二指腸液標本的上清液組及沉渣組的K-ras癌基因突變的檢出率進行比較，發(fā)現(xiàn)膽管癌組在膽汁及十二指腸液的上清液中K-ras癌基因突變檢出率分別為56.7%和43.3%，明顯高

18、于沉渣組，兩者比較有統(tǒng)計學意義，實驗的結(jié)果與國外的文獻報道基本相符11-13，提示上清液的基因檢測對提高基因診斷的陽性率更有意義。 造成上清標本基因突變檢出率較高的原因，可能與以下因素有關(guān)，腫瘤細胞的自然凋亡較正常細胞更頻繁，由于腫瘤細胞凋亡而產(chǎn)生大量的DNA小片段通常在離心后相比正常上皮細胞的DNA更容易黏附在上清液中，從而造成上清液的腫瘤細胞DNA小片段的含量比沉渣要高。因此，用上清液標本進行PCR檢查，更容易取得較高的陽性率。 33 十二指腸液K-ras癌基因檢測在膽管癌早期診斷中的價值 膽管癌細胞生長在膽汁環(huán)境中，膽汁酸鹽有較強的細胞膜損害作用，加上癌細胞自身凋亡頻繁的分子生物特點，癌

19、細胞很容易受破壞后釋放出細胞內(nèi)成分，癌細胞也可以脫落，隨膽汁排到十二指腸液中。因此，從膽汁及十二指腸液中都可能提取出突變的DNA片段。在我們的研究中，十二指腸液中K-ras基因的檢出率達43.3%，與膽汁中K-ras基因的檢出率56.7%差別不大，也提示十二指腸液中K-ras癌基因可能來源于膽管癌組織。由于獲取十二指腸液標本較簡易且無創(chuàng)，所以，應用十二指腸液行分子標志物檢測對膽管癌行早期診斷的方法，臨床上有可行性，對提高膽管癌的早期診斷是有價值的。雖然該檢測方法在臨床中的應用尚有許多問題亟待解決。 臨床上疑診膽管癌常需行ERCP并行細胞刷細胞學檢查，以獲得組織學診斷，但細胞刷檢的陽性率較低。本

20、組資料顯示，膽管癌患者即使行ERCP細胞刷檢癌細胞陰性者，K-ras基因檢測陽性檢出率仍有39.3%，這提示膽汁的K-ras基因檢測可補充細胞學或病理學檢查的不足，從而提高膽管癌的診斷率。 應用DNAzolR 試劑能有效提取到膽汁及十二指腸液標本中的DNA，十二指腸液K-ras基因檢測可能有助于膽管癌的早期診斷?！緟⒖嘉墨I】 1 焦興元，任建林. 消化系腫瘤學（新理論、新觀點、新技術(shù)）M. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2004：338.2 奉典旭，張圣道，韓天權(quán)，等. 血漿K-ras突變聯(lián)合CA19-9檢測對胰腺癌的診斷價值J. 肝膽胰外科雜志，2002，14（2）：73-75.3 任玥欣，許國銘，

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