Western Blot試劑的準備

1、Western Blot試劑的準備1. 30%儲備膠溶液：丙烯酰胺（Acr） 29.0g亞甲雙丙烯酰胺（Bis） 1.0g混勻后ddH2O，37溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室溫。2. 4分離膠緩沖液（1mol/L Tris-HClPH 8.8） Tris18.17g加ddH2O溶解，濃鹽酸調PH 8.8，定容至100ml。3. 4濃縮膠緩沖液（0.5mol/L Tris-HClPH 6. 8） Tris12.1g加ddH2O溶解，濃鹽酸調PH 6. 8，定容至100ml。4. 10%SDS：電泳級SDS 10.0g加ddH2O，68助溶，濃鹽酸調PH 7.2，定容至100ml。5. 5電

2、泳緩沖液（PH 8.3）： Tris 15.2g 甘氨酸 94g ddH2O 定容到1000ml SDS 5g先在974ml蒸餾水中加入Tris堿，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。6. 10%過硫酸銨（AP）：0.1gAP加ddH2O至1.0ml，4保存，要在一周內使用，最好新鮮配制。7. 2加樣緩沖液：2SDS加樣緩沖液0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8)2ml10%SDS 4 ml-巰基乙醇 1ml甘油 2ml1%溴芬藍 1ml置4避光保存8. TEMED：注意室溫較低時TEMED量可加倍，最后灌膠之前再用9. 轉膜緩沖液(Towbin transfer Buffe

3、r)：即1SDS-PAGE10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ： NaCl 8.5g(12H2O)Na2HPO4 2.9011g(2H2O)NH2PO4 0.24g加ddH2O定容至 1000ml12. 漂洗液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS溶液每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-2013. 水飽和正丁醇：正丁醇 50 mlddH2O 5 ml 加入瓶中震蕩，使結合，存于室溫。用時取上面一相加在凝膠上面。14. 考馬斯亮藍染色法試劑：一般用G250考馬斯亮藍（蛋白定量專用）染色液： 90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰

4、乙酸的混合液中溶解G250馬斯亮藍0.25g，用Whatman 1號濾紙過濾染液以去除顆粒狀物質。（染色液多次回收利用）脫色液：90 ml甲醇：水（1：1，V/V）和10 ml冰乙酸的混合液15. 麗春紅S染色色法試劑：2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液脫色液：TBS16. Aprotinin:為一58氨基堿性多肽，經反復凍融后，會發(fā)生集聚，儲存液應分裝成小份，保存于-20度，每一小份用后應予廢棄。17. PMSF：在溶液中不穩(wěn)定，應在臨用前從儲存液中現(xiàn)加于裂解液中。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應立即用大量的水沖洗。凡被PMSF污染的衣物應予丟棄。PMSF通常配成10mmol/L濃度儲液（1.

5、74或17.4mg/ml溶于異丙醇中）保存于-20度。18. 顯色液：聯(lián)苯胺顯色液（DAB）DAB 2ml10%H2O2 60lPBS(0.1mol/L PH6.4) 10ml19. 三去污裂解緩沖液 0.5mol/L Tris-HCl(PH 8.0) 0.785g/100ml 0.15mol/LNaCl 0.8775 g/100ml 0.02%疊氮鈉 0.02 g/100ml 0.1%SDS 0.1 g/100ml超級詳細配方：SDS-PAGE、蛋白轉印、Western Blot試劑配制(*整理，2004.9.6)1.5 mol/L Tris (PH8.8)1稱量181.7g Tris置于1

6、L燒杯中。2加入約800 ml去離子水，充分攪拌溶解。3用濃鹽酸調節(jié)pH值至8.8。4定容至1L.5高壓滅菌后，室溫保存。注意：應使溶液冷卻至室溫后再調定pH值，因為Tris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1oC，溶液的pH值大約降低0.03個單位。（參照kara公司Catalog-N1）1 mol/L Tris (PH6.8)1稱量121.1g Tris置于1L燒杯中。2加入約800 ml去離子水，充分攪拌溶解。3按下表量加入濃鹽酸調節(jié)所需的pH值。pH值濃HCl約70 ml約60 ml約42 ml4定容至1L.5高壓滅菌后，室溫保存。注意：1.溶液冷卻至室溫后再調定pH值，因為

7、Tris溶液的pH值隨溫度的變化差異很大，溫度每升高1oC，溶液的pH值大約降低0.03個單位。2. 如1 mol/L溶液呈現(xiàn)黃色，應予丟棄，并置備質量更好的Tris。30丙稀酰胺（100ml）1稱量下列試劑置于燒杯中。丙烯酰胺（Acrylamide）29 g雙丙烯酰胺 (BIS)1 g2加入約60 ml去離子水，充分攪拌溶解。3定容至100 ml, 用0.45 µm濾膜濾去雜質。5于棕色瓶中4oC保存。注意：1. 丙烯酰胺具有很強的神經毒性，并可通過皮膚吸收，其作用具有積累性，配制時應戴手套等。聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為有可能含有少量的未聚合成分。（參照kara公司Ca

8、talog-N1和分子克隆二版P924）10 SDS1稱量10 g 高純度（電泳級）的SDS置于100200 ml燒杯中。2加入約70 ml去離子水，68oC加熱溶解。3滴加數(shù)滴濃鹽酸調節(jié)pH值至7.2。4定容至100 ml，室溫保存。（參照kara公司Catalog-N1和分子克隆二版P924）10過硫酸銨1稱量1 g過硫酸銨。2加入約10 ml去離子水后攪拌溶解。3儲存于4oC。注意：10過硫酸銨溶液在4oC保存時可使用兩周左右，超過期限會失去催化作用。（參照Takara公司Catalog-N1和分子克隆二版P924）1SDS凝膠加樣緩沖液50 mmol/LTrisCl (pH 6.8)1

9、00 mmol/LDTT2%SDS （電泳級）0.1%溴酚藍10%甘油不含DTT的1SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，臨用前必須從1 mol/L DTT儲存液中現(xiàn)用現(xiàn)加于上述緩沖液中。（參照分子克隆二版P884）本人將參照此配方，配成5或6，各成分濃度均擴大5倍。另:Takara公司Catalog-N5上的5SDSPAGE Loading Buffer配方：組分濃度：250 mmol/LTrisCl (pH 6.8)10% (W/V)SDS （電泳級）0.5% (W/V)溴酚藍（BPB）50% (V/V)甘油5% (W/V)-巰基乙醇（2-ME）配制量 5 ml配制方法1稱量下列試劑置于10m

10、l 塑料離心管中。1 M TrisCl (pH 6.8)1.25 mlSDS （電泳級）0.5 g溴酚藍（BPB）25 mg甘油2.5 ml2加去離子水溶解后定容至5 ml。3小份（500 ul/份）分裝后于室溫保存。4使用前將25 ul的2-ME加到每小份中。5加入2-ME的Loading Buffer可在室溫下保存一個月左右。1 mol/L DTT (20 ml)1稱取3.09 g DTT，加入到50 ml塑料離心管中。2加20 ml的0.01 M NaOAc (pH5.2)，溶解后使用0.22m濾器過濾除菌。3分裝后20oC保存。（參照分子克隆二版P884）3 M 醋酸鈉（NaOAc）（

11、100 ml）1稱取40.8 g NaOAc3H2O置于100200ml燒杯中，加入約40ml的去離子水后攪拌溶解。2加冰醋酸調節(jié)pH值至5.2。3定容至100 ml，高壓滅菌后室溫保存。（參照分子克隆二版P884）0.01 M NaOAc (pH5.2)參照此配方配制。5Tris-Glycine Buffer（SDS-PAGE電泳緩沖液）組分濃度：0.125 M Tris, 1.25 M Glycine, 0.5%(W/V) SDS1稱量下列試劑置于燒杯中。Tris15.1 gGlycine94 g10%(W/V) SDS（電泳級）50 ml2加入約900 ml去離子水攪拌溶解。3定容至1L

12、，室溫保存。（參照分子克隆二版P884）Transfer Buffer:自配 Transfer Buffer:500ml25mM Tris base, 0.2M glycine（甘氨酸）, 20% methanol(甲醇PH8.5)先配制1M Tris base (MW:121.1) 100ml: 12.1g Tris base + ddH2O至100ml,PH約111M 12.5ml Tris base + 7.5g glycine(MW:75.05) +100ml methanol+ ddH2O 至400ml,調好PH值，再加ddH2O至500ml.先置于4oC保存?zhèn)溆?。（參照吳興軍給Pr

13、otoco, 據說優(yōu)于分子克隆配方）麗春紅S儲存液（10）麗春紅S2 g三氯乙酸30 g磺基水楊酸30 g加水至100 ml。用1份上述儲存液加9份去離子水即成麗春紅S使用液，使用后應予廢棄。10X TBS (Tris-buffered saline):To prepare 1 liter of 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl; adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1X).（參照Cell signal Technology Protoco）Wash Buffer TBS/T:1X TBS, 0.1% Tween-20自配

14、 Wash Buffer TBS/T:1000ml1TBS,0.1%Tween-20,100ml 10TBS+ 1ml Tween-20+ 900ml ddH2O（參照Cell signal Technology Protoco）Blocking Buffer:1X TBS, 0.1% Tween-20 with 5% w/v nonfat dry milk。自配 Blocking buffer:150mlfor 150ml, add 15ml 10TBS to 135 ml water,mix.Add 7.5g nonfat milk and mix well.While strirring,add 0.15ml Tween-20(100%).(現(xiàn)用現(xiàn)配，4oC儲存?zhèn)溆?（參照Cell signal