SDS-PAGE電泳試劑盒(細(xì)胞和組織)

1、SDS-PAGE電泳試劑盒（細(xì)胞和組織）(產(chǎn)品編號(hào)DBI-1001; DBI-1002)I. 簡介:1） SDS-PAGE 電泳實(shí)驗(yàn)是絕大部分實(shí)驗(yàn)中很重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，高純度的起始試劑是影響凝膠質(zhì)量的一個(gè)重要因素，可靠的電泳結(jié)果取決于這一實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。該試劑盒中配備了進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳實(shí)驗(yàn)所需要的全部試劑，而且對(duì)試劑盒進(jìn)行了優(yōu)化組合，使實(shí)驗(yàn)者可以方便的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以分離從50500kDa 范圍的蛋白質(zhì)分子。II. 試劑盒內(nèi)容:試劑盒組分DBI-1001 DBI-1002 顏色10 次20 次預(yù)混凝膠溶液（30%）分離膠緩沖液濃縮膠緩沖液TEMED試劑AP（過硫酸

2、銨）試劑1*Loading buffer(空白對(duì)照)6* Loading buffer（樣品使用）蛋白標(biāo)準(zhǔn)（普通）50ml20ml15ml200ul*1支*4支200ul*1支1ml*1支3支50ml*220ml*215ml*2100ul*2支*4支200ul*2支1ml*2支6支NMNMNMGRAYGRAYNMNMNM備注：AP（過硫酸銨）試劑在使用前，每只管子中加入600ul的去離子水，溶膠AP試劑，制成10%的溶液，于4度保存?zhèn)溆谩?0%的AP溶液可保存12周。試劑溶液通常儲(chǔ)存在4。C，在混勻或灌膠之前無須恢復(fù)到室溫。III.蛋白質(zhì)抽提步驟:一、樣品的準(zhǔn)備將所抽提好的蛋白質(zhì)溶液，選用合適

3、的蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。具體內(nèi)容可參考DBI 公司的Bradford 蛋白定量試劑盒（DBI1045,1046）和BCA 蛋白定量試劑盒（DBI1047,1048）。將抽提好的蛋白質(zhì)溶液溶解于樣品緩沖液中。取500ul的蛋白加入試劑盒中所配備的6* Loading buffer（樣品使用）100ul，混勻，于95度10分鐘，待樣品冷卻至室溫即可使用。二、分離膠濃度的選擇丙烯酰胺在凝膠中的百分比分離膠的分辨范圍15% 1545KD12.5% 1560KD10% 1875KD7.5% 30120KD5% 60212KD實(shí)驗(yàn)者可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)分子量大小選用不同的分離膠濃度進(jìn)行分離膠的配制和

4、實(shí)驗(yàn)。T%和C%是通常用來表示凝膠中丙烯酰胺組成的指標(biāo)。T%是指丙烯酰胺總的含量（w/v）， C%是指交聯(lián)的丙烯酰胺（即雙丙烯酰胺與丙烯酰胺單體的比值（w/v）。有以下公式得出：T%=丙烯酰胺（g）+雙丙烯酰胺（g）/總體積（ml）×100%C%=雙丙烯酰胺（g）/丙烯酰胺（g）+雙丙烯酰胺（g）×100%三、試劑與緩沖液的準(zhǔn)備分離膠的配制（）濃度6% 7.5% 8% 9% 10% 12% 13% 15%凝膠溶液（ml） 水（ml） 分離膠緩沖液（ml） AP 試劑（ul） 100 100 100 100 100 100 100 100TEMED 試劑（ul） 10 10

5、10 10 10 10 10 10取一個(gè)10ml 的離心管（也可選用小型燒杯），根據(jù)上表選擇的分離膠濃度，依次加入凝膠溶液、水、分離膠緩沖液、AP 試劑、TEMED 試劑，迅速混勻。（制成的分離膠溶液須在3 分鐘內(nèi)灌注到玻璃平板內(nèi)）濃縮膠的配制（5ml，）工作液的用量灌制不同厚度的凝膠（兩塊6cm*8cm）所需的凝膠液量。配制電泳緩沖液取已配制好的5×電泳緩沖液150 毫升，加去離子水至750 毫升，備用。5×電泳緩沖液配方：總量為1L Tris 堿（） 甘氨酸（） SDS(0.5%m/V)準(zhǔn)備蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品：每個(gè)泳道加入5ul 純化的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)便足夠。使用的設(shè)備

6、1、該試劑盒配備的試劑是根據(jù)BIO-RAD 公司的MiniproteanIII 型電泳儀來做配制的；其所配備的試劑和操作步驟也適用于其他公司所需試劑試劑用量凝膠溶液（ml） 水（ml） 濃縮膠緩沖液（ml） AP 試劑（ul） 100TEMED 試劑（ul） 10凝膠厚度分離膠濃縮膠的電泳系統(tǒng)。2、電源（電壓200V，電流500MA）三、SDSPAGE凝膠電泳1、按廠商的使用指南用兩塊干凈的玻璃平板和 墊片組裝電泳裝置中的玻璃平板夾層，并固定在灌膠支架上。2、將配制好的分離膠溶液，用加樣器將其灌注到玻璃平板夾層中，至頂層約2cm 高為止。3、在用移液器往夾層的液面頂部緩緩加入一層水，讓凝膠在室

7、溫聚合3060 分鐘。聚合后，可見在水層和凝膠層的界面間有一清晰的折光線。4、傾去頂層的水，并以1×濃縮膠緩沖液（試劑盒中所配備的濃縮膠緩沖液1 份加3 份水即可）沖洗凝膠的頂層表面。5、用移液器將配制好的濃縮膠加入到玻璃平板夾層，將 厚的梳子插入夾層的濃縮膠液體中，必要時(shí)補(bǔ)加濃縮膠使液體充盈剩余空間，讓濃縮膠室溫聚合3045min。6、在微量離心管中，用6×SDS 加樣緩沖液按5：1（V/V）稀釋代測(cè)蛋白質(zhì)樣品，于100煮沸35min。同時(shí)，按供應(yīng)商的使用指南融解蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。7、小心拔出梳子，避免撕裂凝膠加樣孔。取出梳子后，以1×電泳緩沖液沖洗加樣孔，并

8、以此緩沖液充滿之。8、按廠商指南將凝膠板固定到電泳槽中，同時(shí)加入配制好的1×電泳緩沖液至剛好淹沒凝膠的加樣孔。9、用25ul 的注射器將蛋白樣品等體積加入到樣品孔中，小心加樣使樣品在孔的底部形成一薄層。10、連接電源，采用恒壓電泳法，電壓為110V，時(shí)間為60 分鐘。11、關(guān)閉電源并撤去連接的導(dǎo)線，棄去電泳緩沖液。將凝膠夾層取出。12、將凝膠定位以識(shí)別加樣順序，小心將封邊的墊片抽出一半，并以此為杠桿撬起上面的玻璃平板，使凝膠保露出來。注意： 檢查加樣孔中是否有氣泡及損壞，損壞的加樣孔可以嘗試2） 甲醇-CH3OH3) 冰醋酸1. 儲(chǔ)存液考馬斯亮藍(lán)染液，1L1. 考馬斯亮藍(lán)R-250

9、2. 甲醇450ml3. 蒸餾水450ml4. 冰醋酸100ml考馬斯亮藍(lán)脫色液，1L5. 甲醇100ml6. 冰醋酸100ml7. 蒸餾水800ml2. 染色過程1） 戴上手套避免將手指印留在電泳膠上，將膠移入一個(gè)小的盛有少量考馬斯亮藍(lán)（20ml 已經(jīng)足夠）的容器內(nèi)（小心不要將膠撕破）?；?qū)⒉ＡО暹B同凝膠浸在染料中輕輕振蕩至凝膠脫落；2） 對(duì)于 的凝膠，可在搖床上緩慢震蕩510min，對(duì)于的凝膠，則需1020min，在染色和脫色過程中要用蓋子或封口膜密閉容器口；3） 棄去染液，將凝膠在水中漂洗數(shù)次。戴手套以避免將雙手染色；4） 加入考馬斯亮藍(lán)脫色液（約50ml），清晰的條帶很快會(huì)顯現(xiàn)出來，大

10、部分凝膠脫色需要1h，使用過的脫色液則可用水沖洗掉。為了脫色完全，需數(shù)次更換脫色液并震蕩過夜。注意1. 染色和脫色一般用最短的時(shí)間已足夠。但如果染色過夜將需要更長的時(shí)間脫色，如果脫色后染色顯得并不徹底，可以對(duì)凝膠重新進(jìn)行染色。2. 對(duì)于低丙烯酰胺濃度較脆的凝膠，可以用一張Whatman3M 的濾紙與凝膠一塊揭下來，并將凝膠從濾紙上沖洗至染色容器內(nèi)。3. 高濃度的SDS 會(huì)干擾考馬斯亮藍(lán)的染色9。4. 不均勻的染色可能是因?yàn)槿玖蠜]有完全穿透凝膠，也許是加入染料的量不足，或者是振蕩的不夠充分。5. 菲特異性的考馬斯亮藍(lán)染色主要是由于是未溶解的染料的沉淀而成，應(yīng)將染料溶液過濾后再用。6. 染料易被陽

11、性電荷離子基團(tuán)所吸引（如Lys、Arg），因此堿性蛋白質(zhì)染色較深，一些酸性蛋白質(zhì)則不易檢測(cè)到21。7. 如果考馬斯亮藍(lán)染色的敏感度不夠，凝膠可經(jīng)漂洗后再進(jìn)行銀染色，可以參考銀染的具體步驟。8. 染色和脫色可用同一個(gè)容器。用清潔劑或有機(jī)溶劑，如果甲醇或乙醇沾濕的紙或紗布，既可將容器中的染色擦盡。討論1） 異常遷移的原因及解決辦法31：􀂗 蛋白質(zhì)與SDS 不完全結(jié)合引起電泳遷移速率下降；在下述條件下會(huì)出現(xiàn)這種情況：沒有被完全還原的蛋白質(zhì)；化學(xué)性交聯(lián)的蛋白質(zhì)；糖蛋白、酸性蛋白、馬來酰化蛋白質(zhì)或琥珀?；鞍踪|(zhì)。􀂗 蛋白質(zhì)固有的凈電荷數(shù)決定著其與SDS 聯(lián)結(jié)合所帶來的

12、電荷總數(shù)。例如組蛋白，在電泳中會(huì)有相對(duì)異常的遷移率。􀂗 分子量在15kDa 以下的蛋白質(zhì)在SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳中比較反常，主要是因?yàn)樗鼈兊暮少|(zhì)比與大的蛋白質(zhì)不同，而且小粒子在凝膠中遷移時(shí)其特性會(huì)發(fā)生改變，SDS 尿素膠可以部分的解決這些問題。SDS 尿素PAGE 分離蛋白質(zhì)范圍是100010000kDa。􀂗 如果在應(yīng)出現(xiàn)單一蛋白質(zhì)條帶的情況下而出現(xiàn)了雙帶，可能是部分蛋白質(zhì)樣品沒有被完全還原，增加樣品緩沖液中-巰基乙醇的濃度可解決這一問題。但也可能是蛋白質(zhì)水解引起的。􀂗 很多疏水的蛋白質(zhì)（如：大腸桿菌乳糖通透酶）可以聯(lián)結(jié)過量的SDS，并

13、顯示很高的電泳遷移率。提高丙烯酰胺濃度可以得到更精確的分子量。因此在有去垢劑的情況下進(jìn)行電泳可以提供最滿意的分辨率。然而和凝膠微粒大小相同的去垢劑，如Triton X-100，穿透聚丙烯酰胺凝膠能力較差。另外，如果用非離子型去垢劑，蛋白質(zhì)遷移距離短于_同樣荷質(zhì)比的蛋白質(zhì)，并且其遷移率與分子量沒有直接比例關(guān)系。2） 樣品中高濃度的陽離子可能會(huì)導(dǎo)致SDS 的沉淀，應(yīng)該在加入樣品緩沖液之前將其除去。3) 一些蛋白質(zhì)需要快速固定，否則他們會(huì)擴(kuò)散出凝膠。4） 過硫酸胺會(huì)干擾酶的活性，預(yù)電泳或用核黃素有助于排除這一干擾。5） SDS 經(jīng)常會(huì)抑制酶的活性，有多種方法可用來從SDS 聚丙稀酰胺凝膠中恢復(fù)酶的活性。對(duì)于SDS-PAGE 后酶的處理，可以參考文獻(xiàn)。6） 清洗電泳儀和玻璃板時(shí)