Western_Blot詳解(原理、分類、試劑、步驟及問題解答)

1、四、WEST BLOTTINGWestern Blot詳解(原理、分類、試劑、步驟及問題解答)、作者：佚名 文章來源：本站原創(chuàng) 點(diǎn)擊數(shù)：12403 更新時(shí)間：2009-9-30 9:50:44Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測(cè)。本文主要通過以下幾個(gè)方面來詳細(xì)地介紹一下Western Blot技術(shù):一、原理二、 分類ECF三、 主要試劑四、 主要步驟五、 實(shí)驗(yàn)常見的問題指南4.濾紙、膠和膜的問題一、 原理與Southern或Northern雜交方法

2、類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。二、分類現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。

3、只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。三、主要試劑1、 丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)儲(chǔ)于棕色瓶，4避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gS

4、DS，1mlH2O去離子水配制，室溫保存。3、 分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。4、 濃縮膠緩沖液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用約48ml 1mol/L HCL調(diào)至pH6.8加水稀釋到100ml終體積。過濾后40C保存。這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCL調(diào)節(jié)PH值，而不用Tris.CL。5、 TEMED原溶液N，N，NN四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。PH太低時(shí)

5、，聚合反應(yīng)受到抑制。10%(w/v)過硫酸胺溶液。提供兩種丙稀酰胺聚合所必須的自由基。去離子水配制數(shù)ml，臨用前配制.6、 SDS-PAGE加樣緩沖液:pH6.8 0.5mol/L Tris緩沖液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巰基乙醇3.2ml，0.05%溴酚藍(lán)1.6ml，H2O 32ml混勻備用。按1:1或1:2比例與蛋白質(zhì)樣品混合，在沸水終煮3min混勻后再上樣，一般為20-25ul，總蛋白量100g。7、 Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸餾水溶解至1000ml，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸

6、電極緩沖液。臨用前稀釋10倍。8、 轉(zhuǎn)移緩沖液：配制1L轉(zhuǎn)移緩沖液，需稱取2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至總量1L。9、 麗春紅染液儲(chǔ)存液：麗春紅S 2g 三氯乙酸30g 磺基水楊酸 30g 加水至100ml 用時(shí)上述儲(chǔ)存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。10、 脫脂奶粉5%(w/v)。11、 NaN3 0.02% 疊氮鈉(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。12、 Tris緩沖鹽溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、 Tween20(15)鼠抗人-MM

7、P-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、 過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體。15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、 100mmol/L NaCl。19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。（可以參看分子克?。┧摹⒅饕襟E主要包括以下4個(gè)基本步驟原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，以下為定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。1培養(yǎng)細(xì)胞或藥物處理。2棄培養(yǎng)基，用1X

8、 PBS漂洗細(xì)胞2次，去盡殘留培養(yǎng)基。3加入1X SDS樣品緩沖液(6-well plate, 100 l /w或 75 cm2 plate, 500-1000 l/瓶)，刮落細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到Ep管。注意：冰上操作。4超聲 1015秒剪切DNA以減低樣品粘性。5煮沸樣品5 minutes。6離心 12000g, 5 min，取上清。7電泳分離：上樣15l20 l 至 SDS-PAGE 膠 ( 10 cm x 10 cm)電泳。如要定量檢測(cè)某蛋白的表達(dá)水平，應(yīng)用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/ 100 mm dish/ 150 cm2 flask)裂解細(xì)胞，收集裂解液至離心管中

9、，在振蕩器上混勻415min， 14000g離心15min（ 4），棄沉淀，用Bradford法或其它蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，進(jìn)行Western雜交時(shí)還需設(shè)置內(nèi)或外參照，通常用beta-actin。注意：一般上樣2030 g已足夠，如待檢蛋白為低豐度蛋白，可加大上樣量至100g，但電泳條帶易拖尾，可制備亞細(xì)胞組份或采用更敏感的檢測(cè)方法。2.電泳分離（參照SDS-PAGE電泳方法）雜交膜的選擇是決定Western blot成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種

10、：硝酸纖維素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45m和0.2m兩種規(guī)格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2m的膜了，如用0.45m的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測(cè)。但P

11、VDF膜在使用之前必需用純甲醇浸泡飽和1-5秒鐘。蛋白質(zhì)常用的轉(zhuǎn)移方法主要有兩種：槽式濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)移。前者操作容易，轉(zhuǎn)移效率高；而后者適用于大膠的蛋白轉(zhuǎn)移，所用緩沖液少。以下為槽式濕轉(zhuǎn)的操作步驟。1. 將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。注意：如檢測(cè)小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易擴(kuò)散出膠。2. 依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和3-5秒鐘。3. 裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿?3層濾紙?膠?膜?3層濾紙?海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記：膠放于負(fù)極面（黑色面）。4. 將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對(duì)黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液

12、，插上電極，100V，1h（電流約為 0.3A）。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。5. 轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜1用25 ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動(dòng)。2置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動(dòng)。315ml TBS/T洗3次（5 min/T）。4加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或 4°C過夜，緩慢搖動(dòng)。515 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。6加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)。715 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。815 ml TBS洗1次。9蛋白

13、檢測(cè)(顯色法或發(fā)光法，按相應(yīng)試劑說明操作)。注意事項(xiàng)：1操作中戴手套，不要用手觸膜。2PVDF膜在甲醇中浸泡時(shí)間不要超過5秒。3如檢測(cè)小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2m的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時(shí)的平衡步驟。4某些抗原和抗體可被Tween-20 洗脫，此時(shí)可用1.0% BSA代替Tween-20。5關(guān)于封閉劑的選擇：5%脫脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩蓋抗體結(jié)合能力；0.33% BSA in PBS：低的內(nèi)源性交叉反應(yīng)性。6如用0. 1% Tween 20、0.02% NaN 3 in PBS or TBS作封閉劑和抗體稀釋液，抗體檢測(cè)后可進(jìn)行蛋白染色。 如要同時(shí)檢測(cè)大分子量和小分

14、子蛋白，最好用梯度膠分離蛋白。五、 實(shí)驗(yàn)常見的問題指南根據(jù)問題的類型主要分成以下幾類（以下資料權(quán)作參考，請(qǐng)勿盲目模仿！）：1. 參考書推薦A. 對(duì)初學(xué)者看什么資料比較好？解答：抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）兩本書不錯(cuò)。2. 針對(duì)樣品的常見問題B. 做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot （以下簡寫成Western Blot），提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120g，換了個(gè)santa cloz的一抗仍不行。

15、是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？解答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復(fù)凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。E. 同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎？解答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。F. 如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？解答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時(shí)最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。G. 我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只

16、有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？解答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用減少電流延長時(shí)間，多加510甲醇。H. 想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度多大合適？積層膠的濃度又該用多少？這么大分子量的蛋白容易作Western Blot嗎？解答：260kd的蛋白不好做， 分離膠用6， Stacking Gel 3.5。I. 如果上樣量超載，要用什么方法來增加上樣量？如果需要加大上樣量使原來弱的條帶能看清楚。解答：可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載

17、30是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試 1.5mm的 comb。 J. 蛋白變性后可以存放多久？解答： 80，一兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了)。K. 我所測(cè)定的蛋白分子量是105KD，按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但我所查資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11的配方，不知為何？解答：上述您提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?05的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi)，但需注意條帶位置。L. 接下來我準(zhǔn)備采用DAB顯色技術(shù)，二抗是生物素化的多克隆抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否

18、要作調(diào)整，能否再用5的脫脂奶粉呢？好像有資料說脫脂奶粉會(huì)影響親和素生物素的生成，是嗎？解答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼?，用代替?yīng)該好一點(diǎn)M. 還有一問題，一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？解答：Western Blot一般上樣30100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長短有關(guān)。開始摸條件時(shí)，為了拿到陽性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。

19、N. 做組織樣品的western的時(shí)候，處理樣品有什么訣竅嗎？還有，您用過大牛血清做封閉劑嗎？濃度如何？效果是不是比BSA好一點(diǎn)？解答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇 烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入和蛋白酶抑制劑cocktail），封閉劑一般5%脫脂奶粉較常用。如果一抗為多克隆抗體，使用也是不錯(cuò)的選擇。O. 您是否可以介紹一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？解答：做200kd蛋白的Western Blot時(shí)要注意，分離膠最好選擇>

20、;7%的；剝膠時(shí)要小心；轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析）。P. 有什么方法可以提高上樣量？解答：可以濃縮樣品；增大上樣體積來增大上樣量。Q. 我要檢測(cè)的目的蛋白是分子量大概為42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速離心機(jī)，有沒有直接用低溫高速離心機(jī)就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞漿蛋白，用這個(gè)做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速離心機(jī)。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的轉(zhuǎn)移方法實(shí)施。R.

21、蛋白的上樣量有沒有什么具體的要求？解答：上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 則上樣量要均等， 如果只是要定性，則沒有太大的關(guān)系， 盡量多上就行了， 但是不要超過0.3g/mm2。S. 一抗，二抗的比例是否重要？解答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特異的本底。3. 抗體做細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？解答：對(duì)二抗無要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來選擇，一般推薦用HRP標(biāo)記的二抗。U. 同一公司的另外抗體用這個(gè)稀釋度做出來效果很好，所以沒做預(yù)試，怕費(fèi)時(shí)間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試

22、劑盒顯色。轉(zhuǎn)膜過夜，一抗孵育也是過夜的，若封閉也過夜的話就要四天才看的到結(jié)果了。解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其最佳的抗體稀釋度也是不一樣的，需要你實(shí)驗(yàn)摸索。我覺得轉(zhuǎn)膜過夜好像沒有必要吧，轉(zhuǎn)膜的目的也就是將蛋白轉(zhuǎn)到膜上就行啦，何必浪費(fèi)時(shí)間呢。至于具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間，還要看你的目的蛋白分子量的大小；轉(zhuǎn)膜的設(shè)備，是半干式，還是濕式。一抗當(dāng)然可以過夜，如果你想所短Western Blot時(shí)間的話，可以增高一抗的孵育溫度，我們實(shí)驗(yàn)室一般37度，兩小時(shí)就足夠了；你可以參照抗體說明書。至于一抗和二抗得稀釋度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000試試。另外建議你洗膜時(shí)，多洗幾次，最好是在封閉；一抗

23、和二抗后至少是5x5min，跑一張好膜不容易，多盡點(diǎn)心吧，這樣不會(huì)浪費(fèi)你的時(shí)間，只會(huì)節(jié)省你的時(shí)間！V. 免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？解答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）W. West

24、ern Blot 中抗體的重復(fù)應(yīng)用問題解答：抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用23次。稀釋后應(yīng)在23天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。4. 濾紙、膠和膜的問題X. NC膜 PVDF膜 尼龍膜怎樣鑒別？解答：尼龍膜是較理想的核酸固相支持物，有多種類型；硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，價(jià)格最便宜；PVDF膜介于二者之間。就結(jié)合能力而言：尼龍膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)480600g/cm2，可結(jié)合短至10bp的核酸片段；硝酸纖維素膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)80100g/cm2，對(duì)于200bp的核酸片段結(jié)合能力不強(qiáng)；PVDF膜結(jié)合DNA和RNA能力可達(dá)1

25、25300g/cm2。就溫度適應(yīng)性而言：尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后，核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合；硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合DNA，結(jié)合不牢固；PVDF膜結(jié)合牢固，耐高溫，特別適合于蛋白印跡。 就韌性而言：尼龍膜較強(qiáng)；硝酸纖維素膜較脆，易破碎；PVDF膜較強(qiáng)。就重復(fù)性而言：尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交，雜交后，探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來；硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用；PVDF膜可以重復(fù)使用。Y. 在做Western Blot時(shí)，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇

26、也是這個(gè)目的。Z. 檢測(cè)磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一張膜上嗎？解答：可以。AA. 轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端（即點(diǎn)樣空的一側(cè)）的轉(zhuǎn)膜好象不是很好，為什么？解答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移的慢， 你延長轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡。BB. 我想問您裂解細(xì)胞用三去污裂解法，還是用上樣緩沖液？解答：用上樣緩沖液，這樣有幾個(gè)好處，可以提取總蛋白，同時(shí)又可以讓磷酸化酶失活。CC. 采用tank system有什么講究？解答：建議低電壓，長時(shí)間，（一般tank System 用衡壓好點(diǎn)），如 28V 1416hrs。DD. 做HS

27、P WESTEN定量，同樣的抗體免疫組化能做出，而WESTEN卻不能？解答：這多半是抗體的問題，要看抗體的說明，是否能做Western Blot和IHC。EE. 膜一般要如何處理？解答：一般用甲醇泡泡就可以了。FF. 如果是6×8轉(zhuǎn)印膜，要加多少一抗？解答：一抗的稀釋度是有說明的，根據(jù)你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育體積一般最少為35ml。GG. 上下槽緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果。解答：無要求。HH. 跑電泳的時(shí)候配的膠總是“縮”是什么原因呢？是有的成分不對(duì)嗎？解答：沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發(fā)了。過夜時(shí)拿保鮮膜包起來，在里面加點(diǎn)水保持濕度就可以了。如果過夜，

28、膠里的水分被蒸發(fā)，采用保鮮膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一下，選用好的試劑，避免找問題麻煩。脫色液中甲醇的含量太高也會(huì)造成膠縮。II. 膜、濾紙、膠大小有何講究？解答：如果是用的是半干轉(zhuǎn)，順序?yàn)椋宏帢O濾紙膠膜濾紙。濾紙的長寬分別比膠小1 2mm，而膜的長寬分別比膠大1 2mm。絕對(duì)禁忌：上下兩層濾紙因?yàn)檫^大而相互接觸，這樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過膠和濾紙。JJ. 蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好嗎？解答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12SDS-P

29、Age， 濕轉(zhuǎn)36V ， 35hrs就可以了， 可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)；170kd 用7%SDSpage， 48V 10hrs16hrs。KK. 不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？解答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè))，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6。太大時(shí)還可以考慮用瓊

30、脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。LL. 如何選擇最合適的蛋白雜交膜？解答：蛋白質(zhì)印跡雜交是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中極為常用的一門技術(shù)。選擇質(zhì)量上層、合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)成敗的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質(zhì)、孔徑和規(guī)格上都要做出合理的選擇。硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物。在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與硝酸纖維素膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，雖然這其中的機(jī)制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜的這個(gè)特性，而且易于封閉非特異性結(jié)合，從而得到了廣泛的應(yīng)用。在非

31、離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。但是膜孔徑如果小于 0.1mm，蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進(jìn)行了。因此，我們通常用0.45m和0.2m兩種規(guī)格的硝酸纖維素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2m的膜了，如果用0.45m的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthrogh”的現(xiàn)象。從膜的質(zhì)地上來看，最重要的指標(biāo)就是單位面積上能夠結(jié)合的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結(jié)合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關(guān)，市場(chǎng)上有些硝酸纖維素膜通常會(huì)還有大量的醋酸纖維素，因而降低

32、了蛋白的結(jié)合量。S&S公司采用的是100%純度的硝酸纖維素，保證了最大的蛋白結(jié)合量，可達(dá)80-150g/cm2。由于100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結(jié)合，降低雜交背景，無需高嚴(yán)謹(jǐn)度的洗脫步驟。其次，膜的強(qiáng)度和韌性也是需要考慮的因素。常規(guī)的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會(huì)破損，不能反復(fù)使用。PVDF轉(zhuǎn)移膜：PVDF是一種高強(qiáng)度、耐腐蝕的物質(zhì)，通常是用來制造水管的。PVDF膜可以結(jié)合蛋白質(zhì)，而且可以分離小片段的蛋白質(zhì)，最初是將它用于蛋白質(zhì)的序列測(cè)定，因?yàn)橄跛崂w維素膜在Edman試劑中會(huì)降解，所以就尋找了PDVF作為替代品，雖然PDVF膜結(jié)合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它

33、的穩(wěn)定、耐腐蝕使它成為蛋白測(cè)序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜與硝酸纖維素膜一樣，可以進(jìn)行各種染色和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，也有很廣的適用范圍。這種PVDF膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細(xì)工藝下比常規(guī)的膜都要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測(cè)。但PVDF膜在使用之前必需用純甲醇進(jìn)行浸泡飽和1-5秒鐘。離子交換型轉(zhuǎn)移膜：硝酸纖維素和PVDF膜是靠疏水作用結(jié)合蛋白的，還有一類膜是根據(jù)離子交換的方式結(jié)合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修飾的纖維素制成的DEAE陰離子交換膜同樣可以 作為蛋白質(zhì)印跡的固相支持物。DEAE可以有效的結(jié)合陰離子基團(tuán)，包括那些高于其等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)。在pH10以下，DEAE基

34、團(tuán)都能帶電荷，在低離子強(qiáng)度的轉(zhuǎn)移液中結(jié)合蛋白分子。其最適的pH環(huán)境為5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種0.45m孔徑的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，還可以用于核酸結(jié)合研究。還有一種離子交換型膜是羧甲基（CM）修飾的纖維素膜，它可以結(jié)合蛋白和多肽分子，以及其他的一些帶正電荷的樣品，最適結(jié)合pH范圍在4-7。結(jié)合的多肽分子可以從CM膜上洗脫下來，用于氨基酸系列分析或微測(cè)序。5. Marker的相關(guān)疑問MM. 我用的是可視marker（BIO_RAD），但是電泳總跑不全8條帶，請(qǐng)問什么原因？怎樣改善？膠用過8，10，12，都是這樣。mar

35、ker是新買的。解答：一般來說，是小分子量Marker跑走了，增加膠濃度或減少電泳時(shí)間試試看。當(dāng)然梯度膠也是不錯(cuò)的選擇。NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時(shí)還能夠看到marker，當(dāng)然也僅能看見其中最多三條帶。用80V進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用恒壓10V45min轉(zhuǎn)印的。前幾次做Western Blot時(shí)沒有進(jìn)行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現(xiàn)。再就是把70KD和130KD兩個(gè)目的蛋白同時(shí)在一

36、塊膠上進(jìn)行分析，用培養(yǎng)基樣品進(jìn)行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體（Anti-V5-HRP）。但就是出不來結(jié)果，我很茫然。謝謝您過給予指點(diǎn)！解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd組成的marker。開始做Western Blot時(shí)還能夠看到marker，當(dāng)然也僅能看見其中最多三條帶?！庇械臅r(shí)候，Prestained Marker 放久了效果就會(huì)變差，電泳是條帶不清晰，擴(kuò)散。但是你的問題可能還有其他的方面的問題，可能是蛋白跟膜結(jié)合的不緊密。轉(zhuǎn)移是多加點(diǎn)甲醇。2、“

37、前幾次做Western Blot時(shí)沒有進(jìn)行麗春紅染色，但盡管用了此方法也僅能看到marker有一條大約是30KD的條帶出現(xiàn)。”轉(zhuǎn)移時(shí)半干法建議用恒流，你這樣的也就30kd-50kd的轉(zhuǎn)移地比較好。3、“再就是把70KD和130KD兩個(gè)目的蛋白同時(shí)在一塊膠上進(jìn)行分析，用培養(yǎng)基樣品進(jìn)行分析，沒有用間接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶聯(lián)抗體（Anti-V5-HRP）?！笔欠駲z測(cè)了表達(dá)量，二抗是否是好的，你做了陽性對(duì)照？你要做這么大的蛋白最好轉(zhuǎn)移時(shí)間延長到1.5hrs。6. 染色的選擇OO. Western Blot哪種染色好？解答：（1）陰離子染料是最常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測(cè)

38、極限可達(dá)到1.5g，考馬雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測(cè)后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。（2）膠體金，靈敏度高，檢測(cè)范圍可到pg級(jí)，但染色比穩(wěn)定。（3）生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。7. 參照的疑問PP. 是否Western Blot實(shí)驗(yàn)半定量一定要加ACTIN內(nèi)參？解答：對(duì)于發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)最好加內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)。QQ. 用BANDSCAN分析結(jié)果行嗎？解答：分析一般的結(jié)果沒問題。RR. 核內(nèi)抗原Western Blot內(nèi)參選擇什么合適？解答

39、：可以選用組蛋白，組蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)是很穩(wěn)定的，有很多都可以當(dāng)成內(nèi)參，在網(wǎng)上查查就可以選出你要的內(nèi)參。SS. 轉(zhuǎn)膜時(shí)采用電流是否比電壓準(zhǔn)確，是否根據(jù)0.8mA/cm2，一般1小時(shí)左右？解答：不是的， 半干法推薦用恒流，一般根據(jù)目的蛋白的大小來確定電流和時(shí)間。TT. 做半定量人卵巢癌細(xì)胞系的Western Blot，內(nèi)參B-actin，GAPDH，那個(gè)好？解答：選用beta-actin就可以。8. 緩沖液配方的常見問題UU. 轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉時(shí)，所用的防沫劑A是什么？還有Tris-HCl是不是就是用Tris和鹽酸配出來的呢？解答：轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉。TrisH

40、Cl就是Tris鹽用HCl調(diào)ph值，配置而成。VV. 準(zhǔn)備做大鼠腦子的Western Blot，蛋白質(zhì)位于細(xì)胞核中，請(qǐng)問此蛋白質(zhì)的提取液及操作方法是？每一步都必須要低溫嗎？這種蛋白質(zhì)是磷酸化的蛋白質(zhì)，操作時(shí)如何防止去磷酸化的發(fā)生？解答：可以用提取總蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。WW. 想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？解答：一般來說提取時(shí)加入光譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明用特殊的方法，一般來說都沒有區(qū)別。XX. 最近作了兩次Western Blot，不但沒陽性結(jié)果，顯色背景都沒有，

41、電泳和轉(zhuǎn)膜都染過，有條帶。底片和顯色液及DAB顯色液均試過，沒問題。1、檢測(cè)GAD-分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不會(huì)有影響把？樣本-20度放置一周內(nèi)測(cè)。2、一抗放置2年，可能效價(jià)不高！用的是 1:100。如果是一抗的原因，不會(huì)背景都沒有把？3、第一次有不均勻背景，因?yàn)橐豢惯^夜時(shí)密封袋不均勻。后兩次無背景顯色。4、封閉液用的是含15%脫脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20為 0.1%，不會(huì)是封閉液的問題吧？解答：可以在下面幾個(gè)問題上找找原因。1. 封閉液用5Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能

42、work，降到1：20。3. 看看二抗是否有問題。YY. 加甲醇的目的是什么？解答：加甲醇起著一定的固定作用，因?yàn)樾》肿拥鞍踪|(zhì)容易轉(zhuǎn)出去.(特別是在硝酸纖維素膜上，因?yàn)镹C膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力較弱)。ZZ. “轉(zhuǎn)膜后的脫脂奶粉封閉液是5%的TBST脫脂奶粉”，其中TBST最后那個(gè)T是Tween嗎，濃度多大？ 解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl， 0.2g of KCl， and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul

43、of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.AAA. 封閉，一抗，二抗時(shí)的溫度有沒有什么規(guī)定呢，比如現(xiàn)在我就在室溫里做，或者要在4度下? 解答：均可在室溫進(jìn)行，如果時(shí)間不夠，一抗孵育可以先在室溫進(jìn)行一個(gè)小時(shí)，然后4度過夜。BBB. 實(shí)驗(yàn)室暫無NP40我用sds可以嗎？另外有過用尿素和硫脲提取膜蛋白嗎？配方如下： 7M 尿素， 2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，新鮮加入： 65mM DTT蛋白酶抑制劑：試劑盒HaltTM Protease

44、 inhibitor cocktail kit 1%(v/v)是用于抽提雙向電泳用蛋白的配方。不止用于抽提細(xì)胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？ 改良的RIPA裂解緩沖液(Tris.HCl， 50 mmol/L， pH 7.5; NaCl， 150 mmol/L; NP-40，1%; 脫氧膽酸鈉， 0.5%; SDS， 0.1%; EDTA， 1 mmol/L; PMSF， 1 mmol/L; Leupeptin， 2 g/ml)不知對(duì)于膜蛋白效果如何？此外該方中的EDTA， 是否用做蛋白酶抑制劑？解答：做絕對(duì)不推薦使用（因?yàn)榧词惯M(jìn)口的也不純，其中的雜質(zhì)會(huì)影響質(zhì)譜結(jié)果）。對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞

45、，其蛋白酶活性較弱（相對(duì)于組織和大腸桿菌等），可以不使用cocktail，因?yàn)?7M尿素硫脲構(gòu)成的變性環(huán)境已經(jīng)足以抑制大部分蛋白酶的活性，硫脲對(duì)于抽提膜蛋白有很大的幫助，不過如果您專職做膜蛋白建議采用分級(jí)抽提法。此外還可以采用梯度離心法和一些基于去垢劑的方法。用于滅活金屬蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加過多的蛋白酶抑制劑可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)的修飾，做無所謂，做時(shí)會(huì)給正確鑒定帶來麻煩。裂解緩沖液中少了兩性電解質(zhì)(在2-D裂解緩沖液中，兩性電解質(zhì)起的作用：提供連續(xù)的PH梯度，從很大程度上增加蛋白質(zhì)的溶解性;還可以去除一部分核酸)；也不推薦采用SDS，因SDS會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致其等電點(diǎn)發(fā)生改變，如果您實(shí)在要

46、用，終濃度降到0.1%以下。METHOD2（50ml總量）：?-mercaptoethanol 342 l；20% SDS 5 ml；Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至 50 ml。 方法：將用過的膜浸入stripping buffer中，置50水浴箱中30min，間斷振搖。之后用TTBS洗3*5min就好。此時(shí)你已經(jīng)可以按新的轉(zhuǎn)移好的膜來再次使用了。該方法的優(yōu)點(diǎn)：省事，省力，省錢，符合國際慣例。METHOD31、beta-metaptoethanol 35ul2、10%SDS 1ml3、tris ( 0.5M，pH6.7) 625ul50 -55，30min。ME

47、THOD4stripping buffer應(yīng)該是可以放置很久的。不過我習(xí)慣于現(xiàn)配畢竟，加了-mercaptoethanol 以后太難聞了，配了就用；而且，有了現(xiàn)成的Tris-HCl緩沖液和SDS的母液，現(xiàn)配還是很方便的。每次用量5ml少了點(diǎn)，我每次用50ml。METHOD50.5M NaCl， 0.5M HAc；室溫?fù)u床15min。METHOD6將用過的膜泡在1*TBS中室溫振搖過夜，中間可以換液2-3次，然后封閉，加一抗，二抗（同第一次發(fā)光），實(shí)踐證明方法完全可行。不管用那種方法，洗脫后都要用PBS或TBS再洗幾次。9. 條件的摸索DDD. 用的是Santa Cruz的抗體，也實(shí)驗(yàn)過一抗和二

48、抗肯定能結(jié)合，二抗加DAB肯定能顯色。電泳的膠用考馬斯亮藍(lán)染色沒問題，但是不知道與Marker對(duì)應(yīng)的條帶是否是我要的（我目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD）。半干法2小時(shí)轉(zhuǎn)膜后，麗春紅染色發(fā)現(xiàn)大分子量蛋白轉(zhuǎn)過去的較少。難道是裂解液出了問題？我用的是三去污劑，但沒加疊氮鈉和大概叫Apoptin的那種蛋白酶抑制劑。冰上裂解 -80度凍存的細(xì)胞，4度 12000g離心5分鐘，取上清，與分子克隆（第二版）上的加樣buffer混合，沸水變性5分鐘，上樣。不知道是哪里出了問題？解答：建議：1、首先確定您提的蛋白質(zhì)量如何？可用PIERCE公司的BCA試劑盒測(cè)蛋白的濃度，一般來講，其濃度應(yīng)該在幾-20微

49、克/微升。2、若是蛋白沒問題，哪就看是不是電泳的問題，首先要看膠的濃度，您目的蛋白的分子量分別是55KD、29KD，建議分別用10和12的膠。60-80V，1小時(shí)左右。跑過積層膠與分離膠的線時(shí)，換用100V，3-4小時(shí)。3、轉(zhuǎn)膜，建議恒壓，15V，不用轉(zhuǎn)2小時(shí)，45分鐘足以。您所說的大蛋白轉(zhuǎn)過去的，并不是真正的少，而是因?yàn)樵谔岬牡鞍字写蟮鞍妆旧砭秃苌?。我曾?jīng)也轉(zhuǎn)過2小時(shí)，但和45分鐘的區(qū)別并不大。4、根據(jù)MARKER的條帶（我的是7條帶：14、18、25、35、45、66、116KD），您根據(jù)MARKER的條帶剪下25與35之間（29KD）的條帶，45-66之間（50KD）的條帶。這樣第一，可

50、以節(jié)省抗體，第二，您要的目的條帶肯定在上面。5、延長1抗、2抗孵育時(shí)間（我曾室溫1小時(shí)，4度過夜），適當(dāng)加大1抗?jié)舛取?、我買的也是Santa Cruz的抗體，我覺得質(zhì)量還可以，我想您應(yīng)該先找其他方面的原因。EEE. 電泳用的是恒流，一塊膠，20mA，100分鐘左右。轉(zhuǎn)膜也是恒流，38mA，100分鐘。而且我用別人的細(xì)胞和一抗在我的整個(gè)反應(yīng)體系下做出來了，當(dāng)然彼此的目的蛋白不同。所以，我想問題應(yīng)該出在抗原和一抗上，不知對(duì)不對(duì)。解答：電泳的條件：樣品的分子量決定了膠的濃度，一般使樣品跑至膠的中部即可。正常條件下，電泳時(shí)溴酚藍(lán)和10kd左右蛋白跑在一起。由此可以決定電泳的電壓和時(shí)間。建議你用恒壓8

51、0100伏。FFF. BIO-RAD的半干轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有一個(gè)很致命的弱點(diǎn)就是無法控溫（我用的就是這種），當(dāng)電流過高，而系統(tǒng)的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。就轉(zhuǎn)膜時(shí)，是采取恒壓還是恒流的問題，我想和大家探討一下，我感覺我這個(gè)系統(tǒng)用恒流很容易燒膠，我的膠有 68cm2，用50mA恒流來轉(zhuǎn)膜，剛開始電壓就很高，有20 v左右，而用恒壓，開始電流有110mA，但15min后，電流就降到8OmA，30min后就穩(wěn)定在40mA，不就相當(dāng)于恒流嗎？解答：恒流時(shí)電壓逐漸升高的原因是濕濾紙逐漸變干因而電阻逐漸增大的緣故，如果電壓升得太快，可以使濾紙更濕一些以克服。就我的感覺，20V的電流3

52、0min以后20Kd以下的分子丟失很多，不過我用的是小膠 40cm2，不知有無不同。GGG. 我想盡量提高轉(zhuǎn)膜的效率（我的實(shí)驗(yàn)要求轉(zhuǎn)到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小蛋白）不知道有那些辦法？解答：不管怎么轉(zhuǎn)都會(huì)存在蛋白轉(zhuǎn)移不完全（電壓過小時(shí)間過短）或過度轉(zhuǎn)移（電壓過大時(shí)間過長）的問題，魚（小分子量蛋白）和熊掌（大分子量蛋白）不可得兼呵呵。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，下半時(shí)間短，上半時(shí)間長一點(diǎn)，應(yīng)該會(huì)好一些。HHH. 請(qǐng)問一下PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？解答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差

53、。尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時(shí)也有疏水作用，但相對(duì)較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好。III. 1、煮好后的樣品，若沒有及時(shí)上樣分離，應(yīng)如何保存，可以保存多久？2、有沒有人在用bio-rad的小型垂直電泳槽，有沒有操作手冊(cè)？3、濕式轉(zhuǎn)移時(shí)是否必須要用bio-rad的專用濾紙？4、恒壓轉(zhuǎn)移的條件如何確定，因?yàn)槲乙蛛x小至21KD，中至66KD，大致170KD的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移條件能夠相同嗎？5、凝膠的濃度是不是可以用一個(gè)濃度？書上寫不同的凝膠濃度分離的分子量范圍不同，還給出了一個(gè)線形范圍，是不是不在這個(gè)范圍內(nèi)也能分離，

54、只是就不是線性范圍了？解答：1、煮好后的樣品，放到-20，我們?cè)谝粋€(gè)月后此樣品，效果一樣。2、bio-rad的小型垂直電泳槽的操作手冊(cè)在他們的主頁Bio-Rad USA上有。3、轉(zhuǎn)移時(shí)一般的WATERMEN濾紙就可以。4、轉(zhuǎn)移條件是和蛋白質(zhì)大小有關(guān)的：以次確定電壓和時(shí)間。具體可讓ptglab幫你定奪。5、凝膠的濃度也是和分離蛋白質(zhì)大小有關(guān)。不是隨心所欲選的，否則分離效果可能不是你所期望的。 JJJ. 怎樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來確定最佳的條件？解答：隨便說一點(diǎn)， 具體的還是需要自己想：1、在每個(gè)上樣孔里上同樣的蛋白樣品，量也一樣，最好是組織樣，（也可以跑1 個(gè)大 well， 不插梳子，多上樣，）SDS-pa

55、ge；2、轉(zhuǎn)移， 設(shè)定電流或電壓；3、每隔 1（or n） 小時(shí)，取一點(diǎn)膜染色，看轉(zhuǎn)移效果。KKK. 我要測(cè)兩種抗體，一種為磷酸化的目的蛋白，一種為總的目的蛋白，不知道用什么方法strip最好，我用甘氨酸（PH2.9）漂洗15分鐘，似乎沒什么效果？解答：你可以加巰基乙醇（loading buffer 一樣的濃度），56度， 30mins，看看。LLL. 1、在用PBS洗滌抗原-抗體-ProteinA-Agarose復(fù)合物時(shí)，每次要重懸多長時(shí)間合適？2、最后用2xSDS重懸抗原-抗體復(fù)合物離心后，由于2XSDS中已經(jīng)加入了溴芬蘭，因此下面的Agarose珠子幾乎看不到，所以吸取上清加樣時(shí)也不知道

56、里面是否吸進(jìn)了Agarose。不知有什么方法可以解決這個(gè)問題，或者即使吸進(jìn)了一些Agarose也不要緊呢？解答：1、不用重懸多久，重懸起來了就可以離心了。2、加2X BUFFER前大體上已經(jīng)知道有多少膠粒了，吸到那個(gè)位置時(shí)小心點(diǎn)就是了。我也試過一些次，首先離心稍微長一點(diǎn)，長20秒吧，希望膠粒能沉得結(jié)實(shí)點(diǎn)（我想象的），再吸取。如果感覺槍頭不是很順暢的時(shí)候可能就是碰到膠粒了。很難一點(diǎn)膠粒也吸取不上來的，盡力做好就是了。MMM. 磷酸化抗體的檢測(cè)樣本制備時(shí)是否一定要加NaF等？解答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時(shí)候是不用加的。我做的時(shí)候從未加過，都做出來了。N

57、NN. Western Blot中block的最短時(shí)間?解答：每一步1小時(shí)足夠了， 中間換抗體要洗的話多換液幾次，每次時(shí)間10分鐘就夠，洗3次只要半小時(shí)。跑膠1小時(shí)， 轉(zhuǎn)移1小時(shí)，block半小時(shí)就行，1抗1小時(shí)，洗半小時(shí)，2抗1小時(shí)，洗半小時(shí)，顯色10分鐘。一般跑兩塊膠，一塊染色， 一塊western。一天肯定完事，一般不用等到第二天。OOO. 想用Western檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染后細(xì)胞培養(yǎng)上清中表達(dá)的目的蛋白（定性），分子量為20KD，濃度約為幾百ng/ml。蛋白樣品需濃縮、純化嗎？如何濃縮、純化上清液中的目的蛋白？對(duì)小分子蛋白Western blot時(shí)需特別注意哪些條件？解答：按照你提供的濃度，如果做Western Blot，是不用濃縮樣品的. 對(duì)于20kd的小分子的蛋白，Western Blot中要注意的是：1、轉(zhuǎn)移時(shí)的時(shí)間，2、轉(zhuǎn)移時(shí)的電流或電壓.3、transfer buffer 中加20%的甲醇.4、可以用13-15%的分離膠.PPP. 蛋白分子量大小分別為21kd、28kd，用的是濕轉(zhuǎn)，請(qǐng)問多大電流，多長時(shí)間比較合適？解答：分子量比較小，最好是用干轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)效率太高，易轉(zhuǎn)過了。干轉(zhuǎn)的話，用 2.5 A/cm2，