大豆異黃酮的測定方法綜述匯總

1、NANCHANG UNIVERSITY功能食品學(xué)綜述論文學(xué) 院： 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 專 業(yè)： 食品科學(xué)與工程 班 級： 食品科學(xué)與工程113班 學(xué) 號： 5603111118 學(xué)生姓名： 廖 杰 指導(dǎo)教師： 王遠(yuǎn)興 起訖日期： 2014年3月至2014年4月 8大豆異黃酮的測定方法摘要本文在參考國內(nèi)外大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上,對大豆異黃酮的測定方法進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)和介紹關(guān)鍵詞：大豆異黃酮；測定方法Abstract:In reference on the basis of a large number of literature at home and abroad, this paper met

2、hod of the determination of soybean isoflavones were summarized and introducedKeywords: soy isoflavones method目錄目錄摘要IAbstract:I目錄II1 根據(jù)紫外吸收特性檢測方法11.1 紫外分光光度法（UV）11.2 三波長法（threewave length UV spectrophotometry）12 根據(jù)色譜原理檢測方法22.1 高效液相色譜法（HPLC）22.2 高效液相色譜質(zhì)譜法（HPLCMS）22.3 氣相色譜法（GC）22.4 氣相色譜質(zhì)譜法（GCMS）32.5 毛

3、細(xì)管電泳法（CE）32.6 薄層掃描色譜法（TLCS）32.7 四標(biāo)樣快速測定法32.8 雙向紙層析色譜法（Twodimensional paper chromatography）43 根據(jù)醫(yī)學(xué)免疫檢測方法43.1 時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）43.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）43.3 放射免疫測定法54 各檢測方法系統(tǒng)歸納和分析5附：各國際組織采用的檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)6參考文獻(xiàn)7大豆異黃酮的測定方法大豆異黃酮（Soybean isoflavones，ISO）是一種從大豆中分離提取活性成分，具有異黃酮類化合物典型結(jié)構(gòu)，包括三種游離型異黃酮苷元和九種結(jié)合型大豆異黃酮。根據(jù)大豆異黃酮分子結(jié)

4、構(gòu)，可用特征顯色及熒光反應(yīng)對其定性定量檢測。目前主要檢測方法有：利用紫外吸收特征，可采用紫外分光光度法（UV）、三波長法等進(jìn)行大豆異黃酮定量檢測；利用色譜原理檢測大豆異黃酮方法為：高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜質(zhì)譜法（HPLCMS）、氣相色譜法（GC）、氣相色譜質(zhì)譜法（GCMS）、毛細(xì)管電泳法（CE）、四標(biāo)樣快速測定法、薄層掃描色譜法（TLCS）、雙向紙層析色譜法等。此外，醫(yī)學(xué)上熒光免疫法：分辨熒光免疫分析法（TRFIA）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等也是檢測大豆異黃酮重要方法。至今我國尚未制定統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范 ISO 檢測方法，現(xiàn)對大豆異黃酮測定多采用 HPLC 法或氣相色譜質(zhì)譜（GC

5、MS）聯(lián)用法，且毛細(xì)管電泳法（CE）將逐漸成為替代 HPLC 方法，廣泛應(yīng)用于大豆異黃酮主要組分（大豆苷元和染料木素等）測定。本文根據(jù)檢測大豆異黃酮原理不同，暫歸納為三大類進(jìn)行闡釋，并對各種檢測大豆異黃酮方法進(jìn)行系統(tǒng)比較分析1 根據(jù)紫外吸收特性檢測方法1.1 紫外分光光度法（UV）大豆異黃酮結(jié)構(gòu)中羥基和芳香環(huán)形成共軛體系具有較強紫外光吸收特性，大豆異黃酮各組分最大吸收波長相差不大，峰數(shù)目較少。如染料木素在紫外區(qū)有很強吸收帶，最大吸收波長為 260 nm；大豆苷元最大吸收波長為 256 nm，在 310 nm 處有個很小肩峰，這使紫外吸收作為評價指標(biāo)成為可能。王哲等1用紫外分光光度法測定大豆異黃

6、酮含量，以大豆苷元作標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，相關(guān)系數(shù) R2=0.9941、方法回收率 100.4%、變異系數(shù)0.25%，證明此法可靠性好、回收率高、重現(xiàn)性高。1.2 三波長法（threewave length UV spectrophotometry）三波長法于 1980 年經(jīng)提出，便很快在島津UV250 分光光度計上被采用，形成種新方法。該法原理為：根據(jù)大豆異黃酮在 240 nm、260 nm、280 nm三個波長處吸光值，分別計算A，計算方法為：A=A260 （A240 A280）/2。根據(jù)三角形相似原理推得A 與待測物濃度成正比，進(jìn)而求得待測物質(zhì)濃度。鞠興榮等2采用三波長紫外分

7、光光度法測定大豆異黃酮含量，有效消除隨濃度不同發(fā)生本底漂移、油脂等干擾物質(zhì)、及吸收峰不對稱給定量分析造成不良影響。此法簡便、靈敏，最低檢出濃度為1 g/mL，加樣回收率 99%；證明該法具有良好準(zhǔn)確性和精密度，適于大批量樣品測定和產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量控制及監(jiān)測。2 根據(jù)色譜原理檢測方法2.1 高效液相色譜法（HPLC）高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法基礎(chǔ)上，于上世紀(jì) 60 年代后期引用氣相色譜理論所建立檢測方法，可廣泛應(yīng)用于大豆異黃酮檢測。在技術(shù)上，色譜柱是以特殊方法用小粒徑且均勻填料填充而成，小顆粒具有高柱效，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬），但會對儀器產(chǎn)生高阻力，為此，流動

8、相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達(dá)4.9×107Pa）；同時，柱后聯(lián)有高靈敏度檢測器，可對流出物進(jìn)行連續(xù)檢測。與 HPLC 配備的檢測大豆異黃酮儀器主要是紫外分光光度儀（UV）和質(zhì)譜分析儀（MS）。建立高效液相色譜法（HPLC）測定保健食品中大豆異黃酮含量方法。運用二極管陣列檢測器（PDA）建立 4 種大豆異黃酮組分：染料木素、大豆苷元、黃豆黃素和黃豆苷光譜庫，采用 PDA 檢測，C18反相柱，以甲醇水醋酸（HAC）=55451（V/V/V）為流動相，測定 4 種大豆異黃酮組分響應(yīng)值之比。該法變異系數(shù)小于 5%，回收率在 92.5%99.3% 之間，檢測速度快，精密度及準(zhǔn)確度在允許范圍

9、內(nèi)，可作為測定保健食品中大豆異黃酮方法。超聲波輔助提?。║AE）可提高有機化合物提取有效率，徐穎3采用高效液相色譜法結(jié)合具有提取時間短和工藝簡化等優(yōu)點超聲提取法測定異黃酮含量。吳周和等4建立反相高效液相色譜法測定豆制品中大豆苷元和染料木素方法，采用Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm ID，5 m）色譜柱，以甲醇、0.5% 乙酸水溶液為流動相，流速為 1 ml/min，柱溫為 35，檢測波長為 260 nm；樣品制備經(jīng)真空干燥、正己烷脫脂、80% 甲醇加熱提取、離心、過濾等過程，大豆苷元和染料木素加樣回收率分別為 99.1% 和 98.8%，RSD 分別為 1

10、.3% 和 0.5%。2.2 高效液相色譜質(zhì)譜法（HPLCMS）高效液相色譜質(zhì)譜法是 HPLC 與 MS 相結(jié)合檢測方法，般級 MS 是對從 HPLC 中出來所有物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，也就是包括 HPLC 譜圖中所有峰；二級 MS 是將通過級 MS 得到帶電離子進(jìn)步擊碎，這樣可得到更多分子結(jié)構(gòu)信息，可對物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)步結(jié)構(gòu)定性。該法檢測大豆異黃酮最大優(yōu)點是能迅速、準(zhǔn)確確定液相色譜圖中各色譜峰歸屬，還可解決因標(biāo)樣缺乏而造成定性分析難題。HPLCMS 主要適于臨床上大豆異黃酮代謝產(chǎn)物分析56。2.3 氣相色譜法（GC）氣相色譜法是種物理分離方法，利用被測物質(zhì)各組分在不同兩相間分配系數(shù)（溶解度）微小差異，當(dāng)

11、兩相作相對運動時，這些物質(zhì)在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次分配，使原只有微小性質(zhì)差異產(chǎn)生很大效果，從而使不同組分得以分離。孫艷梅等7采用氣相色譜法，選取 ATSE30 毛細(xì)管柱，在柱溫為恒溫 260時，測黃豆苷元保留時間為 21 min，確定出黃豆苷元標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程為Y=71519x85913，相關(guān)系數(shù) R2=0.99370。精密度研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）小于 7%。2.4 氣相色譜質(zhì)譜法（GCMS）氣相色譜質(zhì)譜法是氣相色譜法延伸，定性能力更強，是用氣相色譜法分離并定性與用質(zhì)譜法定性相聯(lián)用分析方法。該法廣泛應(yīng)用于研究血漿、尿液及糞便中大豆異黃酮體內(nèi)變化8，及蔬菜和堅果中大豆黃素含量測

12、定9。2.5 毛細(xì)管電泳法（CE）毛細(xì)管電泳法是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上差異而實現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。該法作為 HPLC 替代方法，已用于多種化合物測定，逐漸成為測定植物雌激素（尤其是大豆苷元和染料木素）常規(guī)方法之，該法也是分離檢測大豆異黃酮最為先進(jìn)種方法。Vanttinen等10采用毛細(xì)管電泳法對處理過大豆粉和豆腐中大豆黃素等異黃酮成分進(jìn)行測定。Mcleod等11采用毛細(xì)管電泳法對食物中大豆黃素和金雀異黃素的電離常數(shù)進(jìn)行測定，系統(tǒng)采用石英玻璃毛細(xì)管柱，單波長紫外檢測器，檢測波長為 210 nm，兩樣品測定間用 1 mol/L

13、 NaOH 洗脫 5 min，去離子水洗脫3 min，測試用電解質(zhì)洗脫 5 min。2.6 薄層掃描色譜法（TLCS）薄層掃描是薄層色譜定量方法，可檢測大豆異黃酮單體組分，它利用各組分對同吸附劑吸附能力不同，使在移動相（溶劑）流過固定相（吸附劑）過程中，連續(xù)產(chǎn)生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，從而達(dá)到各組分互相分離目的。此法可對大豆異黃酮單體成分進(jìn)行檢測，但其薄層顯色劑用量很難準(zhǔn)確控制。趙世萍等12報道葛根中異黃酮成分含量薄層光密度測定法。用甲苯甲醇10%甲酸（730.02）和乙酸乙酯甲醇50%甲酸（820.2）為展開劑，在硅膠 G 薄層上分離大豆苷元、大豆苷、葛根素和大豆苷元4，7二葡萄糖甙

14、，并用CS910雙波長薄層掃描儀進(jìn)行定量測定，變異系數(shù)為 1.5%1.6%，可采用該法測定生藥和片劑樣品中含量。2.7 四標(biāo)樣快速測定法四標(biāo)樣快速測定法需要四個不同標(biāo)準(zhǔn)品，并分別制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù) G=（Cge Cde Cg Cd）×10/W 計算，其中 G 為樣品中大豆異黃酮百分含量，W 為樣品稱樣量（mg），Cge、Cde、Cg、Cd 分別為樣品中染料木素、大豆苷元、染料木苷、黃豆黃苷四種組分出峰面積折算為標(biāo)準(zhǔn)品毫克量。該法可準(zhǔn)確定性、定量檢測大豆異黃酮粗提物純度，且樣品處理簡單、操作容易，特別適于生產(chǎn)中物料快速檢測，以便及時控制生產(chǎn)工藝參數(shù)。何繼春等13采用高效液相色譜儀，

15、C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 m），Waters515泵，Waters2487雙波長檢測器；流動相：甲醇水=95（5VV），流速：1 ml/min，柱溫：35，檢測波長：260 nm，進(jìn)樣量：10 m，靈敏度達(dá) 0.02 AUFS。2.8 雙向紙層析色譜法（Twodimensional paper chromatography）該法以紙為載體色譜法，可對 ISO 進(jìn)行定性測定。固定相般為紙纖維上吸附水分，流動相為不與水相溶有機溶劑；也可使紙吸留其它物質(zhì)作為固定相，如緩沖液，甲酰胺等。將試樣點在紙條端，然后在密閉槽中用適宜溶劑進(jìn)行展開，當(dāng)組分移動定距離后，各組分移動距離

16、不同，最后形成互相分離斑點。在沒有高效液相色譜儀條件下，雙向紙層析色譜法也是種較為理想定性分析方法，該法能很好了解異黃酮提取工藝中每個流程中異黃酮變化。彭義交等14采用雙向紙層析色譜法對大豆粕甲醇提取液中大豆異黃酮組分進(jìn)行分析，并對吸收峰面積在 1% 以上組分進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜（LCMS）分析，其苷元與紙層析色譜結(jié)果基本吻合。3 根據(jù)醫(yī)學(xué)免疫檢測方法3.1 時間分辨熒光免疫分析法（TRFIA）時間分辨熒光免疫分析法是用三價稀土離子及其螯合劑作為示蹤物（代替熒光物質(zhì)、同位素或酶），標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細(xì)胞，待反應(yīng)體系（如：抗原抗體免疫反應(yīng)等）發(fā)生后，用時間分辨熒光儀測定

17、最后產(chǎn)物中熒光強度，據(jù)此判斷反應(yīng)體系中被測物質(zhì)濃度。該法主要用于醫(yī)學(xué)上檢測生物體血液和尿液中大豆異黃酮，但該法具有抗體不易制備缺點。Uehara15等通過時間分辨熒光免疫分析法對人尿樣中植物雌激素（包括黃豆苷和染料木苷）進(jìn)行快速分析。3.2 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）ELISA 是種經(jīng)典免疫測定方法，主要是基于抗原或抗體能吸附至固相載體表面并保持其免疫活性，抗原或抗體與酶形成酶結(jié)合物仍保持其免疫活性和酶催化活性基本原理。其主要試驗步驟可概括為包被、洗滌、與特異性抗體反應(yīng)、與酶抗抗體反應(yīng)、顯色和測定，根據(jù)顏色反應(yīng)深淺進(jìn)行定性或定量分析。Creeke 等16采用 ELISA 法對人血漿中大豆黃素

18、和其代謝物equol進(jìn)行測定，其中大豆黃素和equol分析緩沖液檢測限分別為 21 pg/ 孔、70 pg/ 孔。大豆異黃酮作為種具有特殊生理功能天然活性物質(zhì)，其獨特功效和利用潛力近年獲得世人極大關(guān)注，開發(fā)利用大豆異黃酮作為保健食品或美容用品基料和添加劑前景廣闊。高效檢測方法是大豆異黃酮研發(fā)基礎(chǔ)，目前應(yīng)用檢測方法具有不同特點及使用范圍，研究者可根據(jù)不同檢測需要加以選擇。尋求種簡便、高效、快速、成本低廉檢測大豆異黃酮方法仍是科研人員今后繼續(xù)研發(fā)方向。3.3 放射免疫測定法放射免疫測定法是種高靈敏度、快速高效的測定方法。腸pciko等對大豆黃酮進(jìn)行放免法測定,該試驗是在單克隆抗體與大豆黃酮4O(梭

19、甲基)乙基牛血清白蛋白反應(yīng)的基礎(chǔ)上建立的。除4大豆黃酮的衍生物外,二氫大豆黃酮、染料木素、生原禪寧( biochanin A)和雌馬酚(e-quol)與單克隆抗體的交叉反應(yīng)幾率分別為2.4%、1.3%、1.5%和1.6%。4 各檢測方法系統(tǒng)歸納和分析附：各國際組織采用的檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)美國分析化學(xué)家協(xié)會AOAC公布的大豆及大豆食品中異黃酮的測定方法分為提取、皂化和HPLC測定3個過程。測試樣品用甲醇-水提取液(V(甲醇)：V(水)=80：20)在65提取2 h。提取物在室溫下用氫氧化鈉溶液皂化,之后進(jìn)行酸化,過濾。濾液用甲醇-水(V)甲醇：V(水)=50：50)進(jìn)行稀釋。提取物離心澄清并通過HP

20、LC法進(jìn)行分析測定。異黃酮葡萄糖苷和苷元在C18反相柱上以甲醇-水為流動相分離,在紫外260 nm處檢測。通過計算,結(jié)果以異黃酮苷元和相應(yīng)葡萄糖苷形式的苷元等價物(均以苷元為單位)的含量表示。中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 26625-2011規(guī)定了利用高效液相色譜法測定大豆異黃酮（大豆甙、黃豆黃素、染料木甙、大豆黃素、黃豆黃素甙元、染料木素）含量的原理、試劑與材料、儀器與設(shè)備、試劑制備與保存、操作步驟、結(jié)果計算與表示、精密度的要求。適用于大豆、豆奶粉、豆豉中大豆異黃酮含量的測定。最低檢測限為2.5 mg/kg 。參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)1王哲，白志明，田娟娟，等 . 紫外分光光度法測定大豆異黃酮含量 J. 中

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