潛陽方對(duì)高血壓肝陽上亢證大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究①

1、潛陽方對(duì)高血壓肝陽上亢證大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究提要為探討潛陽方治療高血壓肝陽上亢證大鼠模型的藥效學(xué)基礎(chǔ)，采用雙腎雙夾加灌附子湯法復(fù)制高血壓肝陽上亢證大鼠模型，觀察潛陽方的療效及對(duì)其血漿去甲腎上腺素(NE)、腎上腺素(E)、血管緊張素(Ang)及腦干NE、5-羥色胺(5-HT)的影響，并與西藥卡托普利進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示潛陽方、卡托普利均能減輕模型大鼠的各種癥狀，而以前者效果較佳；二者均能顯著降低模型大鼠血壓，而以后者為優(yōu)；二者均能使模型大鼠血漿NE、E及腦干NE降至正常，前者可同時(shí)升高腦干5-HT，而后者降低血漿Ang作用明顯優(yōu)于前者。提示潛陽方降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血壓、減輕肝陽上亢癥狀的機(jī)制可能與降低血漿

2、NE、E及腦干NE和升高腦干5-HT含量有關(guān)。關(guān)鍵詞潛陽方肝陽上亢證高血壓動(dòng)物模型中國書分類號(hào)R285.5 肝陽上亢證是中醫(yī)肝病的主要證型之一，最常見于高血壓病1，可導(dǎo)致腦卒中。該證型的深入研究對(duì)于高血壓病、中風(fēng)病的防治均有著重要意義。潛陽方是經(jīng)過多年臨床實(shí)踐總結(jié)出來的經(jīng)驗(yàn)方2，其功能為平肝潛陽，主治高血壓病肝陽上亢證，為探討潛陽方的藥效學(xué)基礎(chǔ)，進(jìn)行本次試驗(yàn)現(xiàn)報(bào)告如下。1實(shí)驗(yàn)材料藥物、試劑與儀器附子湯：由單味制附子20 g組成。潛陽方：由石決明30 g、鉤藤15 g、黃芩10 g、桑寄生15 g、葛根30 g、川牛膝15 g等組成。2方均煎煮兩遍，合并煎液。 前方總計(jì)煎煮90 min， 濃縮為

3、200 ml， 含生藥0.1 g/ml；后方配制成115 ml，含生藥1 g/ml，其中石決明先下30 min，鉤藤單煎10 min?？ㄍ衅绽麨榻K常州制藥廠生產(chǎn)，磨成粉末后按1 mg：1 ml的比例與蒸餾水制成藥液250 ml。NE、E、5-HT標(biāo)準(zhǔn)品及辛烷磺酸鈉均為Sigma公司產(chǎn)品；Ang放免試劑盒由中國同位素公司北京免疫試劑所提供。高效液相色譜儀為L(zhǎng)C-9A型、電化學(xué)檢測(cè)器為L(zhǎng)-ECD-6A型均為日本島津產(chǎn)品；Spherisorb ODS C18反相色譜柱由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所購得；二道生理記錄儀LMS-2B型，成都儀器廠生產(chǎn)；清醒小動(dòng)物血壓測(cè)量器，HX-型，湖南醫(yī)科大學(xué)心臟生

4、理研究室研制提供；旋轉(zhuǎn)平臺(tái)，根據(jù)文獻(xiàn)自制3。1.2動(dòng)物與分組取健康雄性SD大鼠60只，23月齡，體重190210 g，由湖南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常組、肝陽上亢組、潛陽方組、卡托普利組，每組15只(由于手術(shù)創(chuàng)傷出血，肝陽上亢組死亡1只，卡托普利組死亡1只；由于麻醉意外潛陽方組死亡1只，由于中風(fēng)3%，卡托普利組死亡2只)。2實(shí)驗(yàn)方法模型復(fù)制及處置大鼠稱重后用戊巴比妥鈉0.1 ml/100 g劑量腹腔注射麻醉，仰臥位固定，無菌操作下腹正中做縱行切口，依次鈍性分離雙腎動(dòng)脈，用內(nèi)徑為0.20 mm0.23 mm自制銀夾鉗夾雙側(cè)腎動(dòng)脈起始部，并在腹腔內(nèi)注射4萬u8萬u青霉素預(yù)防感染，然

5、后逐層關(guān)腹。術(shù)后2周傷口完全愈合后開始用附子湯灌胃，20 ml/kg*d，相當(dāng)生藥2 g/kg*d，連續(xù)4周，造模時(shí)間共6周。第7周起，潛陽方組、卡托普利組開始治療，劑量20 ml/kg*d，分別相當(dāng)潛陽方生藥20 g/kg*d及卡托普利0.02 g/kg*d。以上劑量均按動(dòng)物體表面積系數(shù)折算，相當(dāng)70 kg成人臨床劑量的1.9倍。治療持續(xù)2周，直至第8周末。肝陽上亢組同時(shí)給予等量蒸餾水。2.2觀測(cè)項(xiàng)目及方法一般情況觀察包括外觀、性情變化、飲水量及旋轉(zhuǎn)時(shí)間，術(shù)前、第6周末、第8周末各觀察1次。外觀指毛色是否光澤及雙眼結(jié)合膜顏色是否加深變紅；性情變化根據(jù)易激惹程度分為級(jí)，級(jí)指捉持頸部時(shí)尖叫、驚跳

6、，級(jí)指捉持頸部時(shí)咬人，級(jí)指提尾時(shí)尖叫、驚跳甚至咬人或同籠大鼠頻繁打斗；飲水量，每個(gè)鼠籠放大鼠1只，用帶刻度的200 ml水瓶供水，24 h后刻度的變化值加上灌藥或蒸餾水的量即為每日飲水量；旋轉(zhuǎn)時(shí)間，將大鼠立于特制旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上，轉(zhuǎn)速45 r/min，如果2 min仍不跌下，則停止實(shí)驗(yàn)。血壓采用楊綠化等報(bào)道的尾動(dòng)脈搏動(dòng)法測(cè)定4。于術(shù)前、第1、3、6、8周末各測(cè)1次。血漿NE、E、Ang及腦干NE、5-HT測(cè)定所有動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)第8周末斷頭死，將血液在4 3000 r/min離心15 min，分離出血漿，放80 冰箱中保存待測(cè)，采血同時(shí)迅速剝離腦組織，分離出腦干放入液氮中冷凍1周，再轉(zhuǎn)移至80 冰箱中待處

7、理。NE、E、5-HT均采用高效液相色譜法，其中兒茶酚胺類(NE、E)按Eisenhofer法5稍加修改，5-HT按唐愛國報(bào)道的方法6稍加修改。血漿Ang采用放射免疫分析法，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)以xs表示，采用多樣本均數(shù)比較及兩兩比較，相關(guān)分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。3結(jié)果一般情況觀察整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠毛色有光澤，雙眼靈活有神，行動(dòng)敏捷，對(duì)周圍變化反應(yīng)靈敏；肝陽上亢組大鼠毛色逐漸失去光澤，消瘦，口渴，飲水量明顯增多，旋轉(zhuǎn)時(shí)間明顯縮短(提示頭暈)，多數(shù)動(dòng)物于加灌附子湯時(shí)起出現(xiàn)性情變化，第6周時(shí)達(dá)高峰(級(jí))，并維持至第8周末，部分大鼠雙眼結(jié)合膜顏色加深變紅，尚有2只大鼠分別于第7、

8、8周突然出現(xiàn)抽搐或偏癱，取腦組織病檢證實(shí)為腦出血；潛陽方組、卡托普利組經(jīng)兩周治療后，上述癥狀均不同程度減輕，其中尤以潛陽方效果為佳，見表1，表2。表1各組動(dòng)物一般情況觀察組別n第6周末第8周末性情變化眼結(jié)膜充血性情變化眼結(jié)膜充血正常組1510000000肝陽上亢組1225541655潛陽方組1425756201卡托普利組1307643442 表2各組動(dòng)物飲水量與旋轉(zhuǎn)時(shí)間比較組別n第6周末第8周末飲水量(ml)旋轉(zhuǎn)時(shí)間(s)飲水量(ml)旋轉(zhuǎn)時(shí)間(s)正常組15332120356120肝陽上亢組12633615潛陽方組14645364卡托普利組13624485 注：與正常組比較P0.01；與肝陽

9、上亢組比較P0.01；潛陽方組與卡托普利比較P0.01 血壓動(dòng)態(tài)變化肝陽上亢組血壓于第1周起快速升高，直至第6周末達(dá)高峰并持續(xù)至第8周末；潛陽方組、卡托普利組經(jīng)兩周治療后，血壓均不同程度下降，但前者降壓幅度不如后者，見表3。組別n術(shù)前第1周末第2周末第6周末第8周末正常組151036/7731053/8141127/8931235/9671295/1014肝陽上亢組121014/7581249/101717411/142919413/1651119515/17012潛陽方組141025/76512111/9781777/14171908/16461758/1417卡托普利組131015/743

10、1227/9851719/140101919/1651016311/13212 注：與正常組比較P0.01；與肝陽上亢組比較P0.01；潛陽方組與卡托普利比較P0.013.3血漿NE、E、Ang及腦干NE、5-HT測(cè)定 肝陽上亢組血漿NE、E、Ang及腦干NE明顯升高，腦干5-HT明顯下降；潛陽方組、卡托普利組經(jīng)兩周治療后血漿NE、E及腦干NE均降至正常，前者可同時(shí)升高腦干5-HT，后者則無此作用，但其降低血漿Ang幅度明顯大于前者，見表4。表4各組動(dòng)物血漿NE、E、Ang及腦干NE、5-HT比較(xs)組別n血漿腦干NE(pmol/L)E(pmol/L)Ang(pg/ml)NE(pmol/g

11、濕重)5-HT(pmol/g濕重)正常組15肝陽上亢組12潛陽方組14卡托普利組13 注：與正常組比較P0.01；與肝陽上亢組比較P0.01；潛陽方組與卡托普利比較P0.01 大鼠血壓與各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的相關(guān)分析血壓(SBP/DBP)與血漿NE、E、Ang及腦干NE之間均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.52/0.62，0.43/0.52，0.89/0.91，0.62/0.68(P0.01)；與腦干5-HT呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.34/0.35(P0.01)。4討論肝陽上亢證主要病機(jī)是由于肝腎陰虛，陰不制陽而致肝陽偏亢；其主要臨床證候?yàn)檠?、頭痛、煩躁易怒，面紅目赤或面部烘熱，口苦而渴，脈弦7；其主要病理

12、生理基礎(chǔ)為外周交感腎上腺髓質(zhì)功能偏亢8；其治則為“平肝潛陽，補(bǔ)益肝腎”，本實(shí)驗(yàn)采用雙腎雙夾加灌附子湯復(fù)制的大鼠模型，100%形成了穩(wěn)定的高血壓，且逐漸出現(xiàn)雙眼結(jié)合膜顏色加深變紅，口渴、飲水量增多，提尾、捉持頸部或輕輕鉗夾時(shí)抵抗劇烈、尖叫、暴跳以及同籠大鼠頻繁打斗、咬人等攻擊行為，旋轉(zhuǎn)時(shí)間明顯縮短(提示頭暈)，血漿兒茶酚胺明顯升高，且有少數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)了出血性中風(fēng)，因而認(rèn)為本模型大體具備了與人類高血壓病肝陽上亢證相似的許多特征。研究證實(shí)，腦內(nèi)NE、5-HT的動(dòng)態(tài)平衡與中樞痛閾的升降變化及情緒波動(dòng)有著密切關(guān)系9。當(dāng)腦內(nèi)NE明顯升高和(或)5-HT明顯下降時(shí)，將破壞腦內(nèi)NE與5-HT之間的動(dòng)態(tài)平衡，使痛

13、閾明顯下降造成頭痛，并出現(xiàn)煩躁易怒、躁狂、攻擊行為等。本模型大鼠腦內(nèi)NE明顯升高、5-HT明顯下降，可能是肝陽上亢證發(fā)生頭痛，煩躁易怒等證候的重要機(jī)制。潛陽方是金益強(qiáng)教授等經(jīng)過多年臨床實(shí)踐總結(jié)出來的經(jīng)驗(yàn)方，方中石決明平肝潛陽為治肝陽眩暈之要藥，為本方君藥；鉤藤清肝熱、平肝熄風(fēng)，黃芩清肝膽火熱，二味配合使肝經(jīng)之熱不致偏亢，加強(qiáng)君藥之功效，共為臣藥，桑寄生補(bǔ)肝腎以制陽亢，葛根解肌潤(rùn)筋善治頸項(xiàng)頭痛，二味配合共為佐藥；川牛膝引頭部血液下行，減輕腦充血，為使藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，鉤藤、黃芩、桑寄生、葛根、牛膝可通過各種不同的途徑產(chǎn)生降低血壓的作用10，11。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠血壓與血漿NE、E、Ang及腦干NE呈正相關(guān)，與腦干5-HT呈負(fù)相關(guān)，其中與血漿Ang的相關(guān)系數(shù)最大，說明動(dòng)物血壓升高與血漿NE、E、Ang的升高及腦干5-HT的下降有關(guān)，而尤以血漿Ang升高為最主要機(jī)制。卡托普利是一種轉(zhuǎn)換酶抑制劑，能阻斷Ang向Ang的轉(zhuǎn)化，從而切斷了本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物產(chǎn)生高血壓的主要環(huán)節(jié)。潛陽方盡管能通過降低血漿NE、E和腦內(nèi)NE以及升高腦內(nèi)5-HT對(duì)血壓產(chǎn)生影響，但其對(duì)腎素-血管緊張素系統(tǒng)的影響不起主要作用，這可能是它降壓不如卡托普利的原因。有研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤、黃芩、葛根、牛膝具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛，改善腦循環(huán)等作用10，這可能是潛陽方能明顯改善模型大鼠癥狀的主要原因。