氟喹諾酮檢測(cè)試劑盒說明書

1、氟喹諾酮檢測(cè)試劑盒說明書PN 52250BA注意：在使用前請(qǐng)認(rèn)真閱讀說明書（請(qǐng)以英文為準(zhǔn)，中文僅供參考）1、概述氟喹諾酮檢測(cè)試劑盒適用于檢測(cè)氟喹諾酮的含量。這個(gè)檢測(cè)適用于定量或定性檢測(cè)水樣或魚蝦產(chǎn)品。其他樣品的提取步驟請(qǐng)與我公司聯(lián)系。如果有必要可以通過HPLC, GC/MS或其他的傳統(tǒng)方法證實(shí)測(cè)定結(jié)果。2、安全說明試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)溶液中含有少量的恩氟沙星。底物中含有四甲基聯(lián)苯胺。終止液也含有稀硫酸。要避免皮膚和粘膜與終止液接觸。如果不小心接觸了請(qǐng)用大量的水沖洗。3、儲(chǔ)存和穩(wěn)定性氟喹諾酮檢測(cè)試劑盒應(yīng)該保存在48C。在使用之前試劑盒中的試劑要恢復(fù)到室溫。試劑盒在有效期內(nèi)可以使用。結(jié)合物以低壓凍干的形

2、式保存（3瓶）。在檢測(cè)前要用結(jié)合物稀釋液配制一定量低壓凍干形式保存的結(jié)合物。因?yàn)榕渲坪玫娜芤簝H能保存1周所以需要多少就配制多少。4、原理Abraxis氟喹諾酮檢測(cè)試劑盒的原理是直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)。通過特異性抗體來識(shí)別氟喹諾酮。樣品中氟喹諾酮和氟喹諾酮-HRP酶結(jié)合物競(jìng)爭(zhēng)與溶液中兔抗氟喹諾酮抗體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。這氟喹諾酮抗體與固定在微孔板上的二抗結(jié)合。洗板，加入底物顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)；樣品中的氟喹諾酮濃度與顯現(xiàn)出的藍(lán)色的深度成反比。加入反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。在450nm波長進(jìn)行檢測(cè)，通過做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品中氟喹諾酮的含量。5、氟喹諾酮檢測(cè)試劑盒的限制和可能的干擾樣品中的很多易出現(xiàn)的有機(jī)物和無機(jī)

3、物已經(jīng)被檢測(cè)表明對(duì)試劑盒的檢測(cè)沒有干擾。然而由于樣品中化合物的多變性引起的基質(zhì)效應(yīng)是不可能完全避免的。在使用的過程中出現(xiàn)失誤也會(huì)影響結(jié)果，比如：試劑盒保存條件不對(duì)、錯(cuò)誤的加液順序、試劑的量沒有加準(zhǔn)確、孵育的時(shí)間太長或太短、孵育的溫度太高或太低（低于10C或高于30C）。和其它檢測(cè)方法一樣對(duì)陽性結(jié)果要求通過其它傳統(tǒng)的方法來驗(yàn)證。工作指導(dǎo)A 試劑盒組成1、96孔酶標(biāo)板：包被有羊抗兔二抗，1塊（12條8孔）。2、氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品:7瓶，濃度分別為0, 0.025, 0.05, 0.125, 0.25, 0.5, 和1.0 ng/mL3、氟喹諾酮HRP酶標(biāo)記物（結(jié)合物）：3瓶（低壓凍干保存），溶解后每瓶

4、3ml4、結(jié)合物稀釋液12 mL：用于稀釋氟喹諾酮HRP酶標(biāo)記物5、兔抗氟喹諾酮抗體：1瓶（6ml）6、樣品稀釋液25ml，用于稀釋樣品。7、5濃縮洗液：1瓶（100ml）8、底物顯色液（TMB）：1瓶（12ml）9、終止液：1瓶（12ml）。B、檢測(cè)準(zhǔn)備微量移液器和吸頭是必須使用的，推薦使用排槍來添加結(jié)合物、抗體、底物和終止液，這樣可以保證整個(gè)酶標(biāo)板的孵育時(shí)間一致。在做同一次測(cè)試時(shí)要使用同一個(gè)盒子里的試劑和標(biāo)準(zhǔn)。1、使用前將所有的試劑拿到室溫（19-25）。2、從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。置于4-8保存。3、標(biāo)準(zhǔn)液，抗體，底物，終止液不用稀釋直接使

5、用。4、提供的結(jié)合物是以低壓冷凍干燥的形式來保存的。在檢測(cè)前根據(jù)用量來配制。一旦稀釋只能保存1周的時(shí)間。稀釋后每瓶足夠50個(gè)孔使用。配制的時(shí)候需要在氟喹諾酮HRP酶標(biāo)記物（結(jié)合物）瓶子中加入3ml結(jié)合物稀釋液震蕩混勻即可。5、以1：5的比例稀釋洗液（如果要使用一整瓶那么100ml洗液+ 400ml蒸餾水或無離子水）。6、由于終止液中包含酸，拿的時(shí)候要小心。C、檢測(cè)步驟使用前將試劑盒和樣品處理物提前從冰箱中拿出來使其達(dá)到室溫。從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。1、在對(duì)應(yīng)的微孔中加入50L標(biāo)準(zhǔn)和樣品（或樣品提取液）。推薦做2-3個(gè)平行。2、用多道移液器在每個(gè)測(cè)

6、試孔都加入50 L重新稀釋的氟喹諾酮HRP酶標(biāo)記物（結(jié)合物）。3、用多道移液器在每個(gè)測(cè)試孔都加入50 L兔抗氟喹諾酮抗體溶液，用膠帶蓋上，通過移動(dòng)酶標(biāo)板來混合液體。4、在室溫下孵育60分鐘5、孵育完成后，將微孔中的溶液倒入水槽中，用1X 洗液加滿微孔然后倒掉，拍板，去掉殘留的洗液，重復(fù)三次，總共四次洗板。6、每個(gè)測(cè)試孔加入100L底物顯色液。通過移動(dòng)酶標(biāo)板來混合液體，混合30秒。在室溫下孵育20-30min，避免陽光直射。7、每個(gè)測(cè)試孔加入100L終止液。8、在加入終止液15分鐘內(nèi)，450nm 下讀取每個(gè)孔的吸光度值（OD）。D. 結(jié)果分析可以利用商業(yè)ELISA軟件程序比如Logit/Log

7、or 4-Parameter 來評(píng)價(jià)ELISA結(jié)果。也可以通過計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0值，以%B/B0為y軸、氟喹諾酮濃度為x軸作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品濃度可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算。當(dāng)樣品中氟喹諾酮的濃度大于1ng/ml時(shí)要稀釋后再測(cè)定。E、試劑盒未提供的材料1、微量移液器及一次性吸頭（(10-200 和 200-1000 L)2、多道移液器（10-250ul）及吸頭3、酶標(biāo)儀（450nm波長）4、計(jì)時(shí)器5、膠帶、封口膜F. 工作計(jì)劃Std 0-Std 6: 標(biāo)準(zhǔn) (Std 0-Std 6: Standards0; 0.025; 0.05; 0.125; 0.25; 0.5; 1.0 ppb)Sam1

8、, Sam2, etc.: 樣品123456789101112AStd0Std4Sam2BStd0Std4Sam2CStd1Std5etcDStd1Std5etcEStd2Std6FStd2Std6GStd3Sam1HStd3Sam1前處理方法：1、水樣用玻璃帶蓋試管收集水樣，在檢測(cè)前每個(gè)水樣都必須用甲醇稀釋（甲醇的終濃度為10%10% v/v（100ul甲醇+ 900ul的水樣）。樣品中氟喹諾酮的濃度等于ELISA檢測(cè)結(jié)果乘以。高污染的樣品（含氟喹諾酮的濃度太高的樣品）需要稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。2、魚蝦樣品1）在一個(gè)10ml或更大的帶蓋玻璃試管中加入1g均質(zhì)化的魚蝦樣品。2）加入3ml 80%的

9、甲醇。充分渦旋震蕩(10-20分鐘)。3）2000 g離心10min，吸取2ml上清到一個(gè)干凈的離心管。4）2000 g離心10min（離心上一步吸取的上清可以有效的消除基質(zhì)效應(yīng)）。5）吸取1ml上清到一個(gè)干凈的離心管。6）吸取100ul最終的提取液加入900ul樣品稀釋液，震蕩充分混合，待測(cè)。樣品中氟喹諾酮的濃度等于ELISA檢測(cè)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)40（檢測(cè)范圍1.0 40.0 ng/mL）。高污染的樣品（含氟喹諾酮的濃度太高）需要稀釋后再進(jìn)行測(cè)定?；厥章蕿?5-103%。3、蜂蜜樣品1）在玻璃試管中稱取1g蜂蜜，加入1ml樣品稀釋液（含10% 甲醇的 1X PBS, pH 7.0-7.4)2

10、）劇烈地渦旋震蕩2min。3）以1：的比例稀釋樣品 （50ul樣品（步驟2）+575ul樣品稀釋液），待測(cè)。樣品中氟喹諾酮的濃度等于ELISA檢測(cè)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)25?；厥章蕿?00-103%。4、飼料1) 取1g飼料樣品加入5mL 80%甲醇，勻漿；2) 取1.5 mL勻漿樣品，室溫下4000g離心5分鐘；3) 1樣品稀釋液，混合均勻；待測(cè)稀釋倍數(shù)：105 肌肉/肝臟/腎臟1) 去除樣品中的脂肪，對(duì)樣品進(jìn)行勻漿；2) 取勻質(zhì)樣品，加入4mL80%甲醇；3) 劇烈震蕩10分鐘；4) 室溫下4000g離心5分鐘；5) 稀釋液，混合均勻。6 尿樣1) 尿樣在4000g離心5分鐘；2) 樣品稀釋液（

11、含10% 甲醇的 1X PBS, pH 7.0-7.4)。3) 混勻待測(cè)7 血清1) 血清在4000g離心5分鐘；2) 樣品稀釋液（含10% 甲醇的 1X PBS, pH 7.0-7.4)。3) 混勻待測(cè)8 牛奶1) 對(duì)于無脂牛奶，用樣品稀釋液進(jìn)行5倍稀釋即可（如200L牛奶+800L樣品稀釋液），待測(cè)；2) 對(duì)于含脂牛奶，4000g離心5分鐘以去除上層脂肪層，再以樣品稀釋液進(jìn)行5倍稀釋即可（如200L牛奶+800L樣品提取液），待測(cè)。注意：前處理中使用的樣品稀釋液為含10%甲醇的20mM PBS溶液，試劑盒中提供的樣品稀釋液僅夠用在前處理的最后一步稀釋，其它步驟中需要的樣品稀釋液需要自己配制?；蛘叱鲇谀承┰驑悠废♂屢翰粔虻囊部梢宰约号渲啤悠废♂屢号渲品椒ㄈ缦拢?）20mM PBS的配制