阿片耐藥的受體調(diào)節(jié)機(jī)制

1、阿片耐藥的受體調(diào)節(jié)機(jī)制中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院麻醉科 劉曉艷 孫莉阿片類藥物用于癌痛和急性疼痛治療療效已得到共識(shí)，但是阿片藥物的耐藥性和依賴性在應(yīng)用過程中隨之產(chǎn)生。藥理學(xué)上的耐藥性是指反復(fù)使用阿片藥物后使藥物藥效減弱，即劑量效力曲線發(fā)生右移。而一旦藥效減弱必須要增加劑量來達(dá)到原有的治療效果。但奇怪的是藥物的副作用如便秘、瞳孔縮小等的“耐藥性”卻并未出現(xiàn)（這在臨床上是有益處的）。因此，我們說的耐藥性通常是指鎮(zhèn)痛作用的耐藥性。阿片耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，到目前為止尚不完全清楚，本文僅就其受體調(diào)節(jié)的分子藥理機(jī)制加以闡述。 一、阿片受體的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制阿片耐藥屬于藥效學(xué)的耐受，其調(diào)節(jié)機(jī)制主要是細(xì)胞內(nèi)水平的調(diào)節(jié)

2、，取決于受體密度、敏感性及受體與效應(yīng)體之間的耦聯(lián)情況。阿片受體是一種膜蛋白，屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族（GPCRs）的成員，GPCRs共有10002000多種，約構(gòu)成人類基因的1，可以向細(xì)胞內(nèi)傳遞許多激素和神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)。GPCRs又可根據(jù)GRAFs系統(tǒng)分為5個(gè)主要家族：Glutanat、Rhodopsin、Adhesion、Fizzled/taste2和Secretin。阿片受體屬于GPCRs中的Rhodopsin家族。共有3個(gè)不同的基因分別編碼、和阿片受體（DOR、MOR和KOR），同時(shí)還可能存在它們的不同變異體。目前發(fā)現(xiàn)的約有七種受體，它們可以啟動(dòng)相同的第二信號(hào)系統(tǒng)。G蛋白為一個(gè)三聚體，3個(gè)

3、亞基組成，亞基上結(jié)合了一個(gè)鳥嘌呤二磷酸（GDP）,當(dāng)阿片配體與受體結(jié)合之后發(fā)生構(gòu)象改變，與G蛋白結(jié)合，DGP為GTP（鳥嘌呤三磷酸）所取代，G與G分離。亞基作用于下一個(gè)效應(yīng)器，比如AC（腺苷酸環(huán)化酶）。GTP分子可以被特定的鳥嘌呤三磷酸酶（GTPase）水解，G重新與G結(jié)合。G種類很多，阿片藥物多與抑制性G結(jié)合，可以導(dǎo)致一系列的反應(yīng)，包括腺苷酸環(huán)化酶活性抑制-cAMP減少，磷脂酶C的活性增強(qiáng)，同時(shí)有細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的短暫升高，鉀離子內(nèi)流增加，L-型和N型鈣通道抑制以及分裂素活性蛋白激酶活性增強(qiáng)等等，從而抑制各種疼痛遞質(zhì)（如底物P）的釋放，達(dá)到鎮(zhèn)痛作用。阿片藥物的藥效主要取決于膜受體的水平，在阿

4、片受體敲除鼠使用嗎啡，藥效大大降低充分證實(shí)了這一點(diǎn)。目前對(duì)阿片受體的研究深入到受體蛋白功能區(qū)的氨基酸序列如何影響受體的結(jié)合及與效應(yīng)體耦聯(lián)，同時(shí)阿片受體又可進(jìn)一步分為亞型，亞型的形成可能來源于翻譯后的修飾過程，這可能是個(gè)體之間藥效和耐藥形成差異的原因。以往大量研究證明，受體水平和信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)過程影響了長期用藥后細(xì)胞的反應(yīng)性，并在耐藥產(chǎn)生中起到重要作用，因此對(duì)阿片耐藥的研究主要集中在對(duì)阿片受體的調(diào)節(jié)機(jī)制。二、耐藥機(jī)制1、受體下調(diào)機(jī)制 阿片受體下調(diào)可以反映為受體總蛋白水平的下調(diào)，或者轉(zhuǎn)錄水平的mRNA下調(diào)。但對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究并不一致。有些結(jié)果顯示阿片耐受大鼠腦組織中的阿片受體水平并未發(fā)生變化，而

5、另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)嗎啡耐受的豚鼠下丘腦內(nèi)側(cè)基底部阿片受體mRNA水平下調(diào)，而其他腦區(qū)均無改變。受體下調(diào)在體外試驗(yàn)中已經(jīng)得到證實(shí)，但在體試驗(yàn)的結(jié)果還不明確，受體下調(diào)及上調(diào)均有報(bào)道。Thomas Merser等人觀察到大鼠嗎啡耐藥后背角神經(jīng)節(jié)阿片受體mRNA水平下調(diào)了62。而這種下調(diào)是否引起受體蛋白的下調(diào)還有待進(jìn)一步研究。阿片受體有三個(gè)不同基因所編碼，分別為mor基因、dor基因和kor基因，三個(gè)基因有相似的結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)因子，每個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子卻不同，每種受體的表達(dá)都由特異通路所控制。對(duì)阿片受體的分布及其mRNA表達(dá)機(jī)制的研究表明：三種受體的表達(dá)機(jī)制各有不同稍有重疊，三個(gè)基因的調(diào)節(jié)因子亦不相同，通過基

6、因原位雜交的方法觀察到的mRNS的表達(dá)機(jī)制與通過配體結(jié)合或抗體染色觀察到的受體蛋白表達(dá)機(jī)制并不一致。目前的研究認(rèn)為阿片受體蛋白的表達(dá)是由變異的mRAN序列所調(diào)控的，阿片受體蛋白的表達(dá)不僅受控于DNA的轉(zhuǎn)錄而且也受控于翻譯后RNA水平。激活和抑制轉(zhuǎn)錄因子控制著三個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄過程，并且參與了細(xì)胞的分化。Mor和kor基因均已發(fā)現(xiàn)具有廣泛的選擇性拼接和多腺苷酸化作用。Mor基因可以形成至少14種變異體，kor至少有6種。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了阿片受體基因的多種RNA變異體，但是對(duì)這些藥理性質(zhì)不同的阿片受體的研究還有待進(jìn)一步深入。這些不同RNA序列的作用很有可能是調(diào)節(jié)受體蛋白的表達(dá)以及控制翻譯效率和蛋白產(chǎn)物時(shí)

7、間、空間的特異性。對(duì)于阿片受體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后控制機(jī)制的研究目前主要集中在kor基因，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)6種kor的mRNA變異體：A-PA1,A-PA2,B-PA1,B-PA2,C-PA1,C-PA2，研究內(nèi)容主要是拼接過程的調(diào)控、mRNA穩(wěn)定性的調(diào)控及RNA轉(zhuǎn)運(yùn)過程的調(diào)控。大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PA能夠影響拼接過程，但機(jī)制尚不清楚。在機(jī)械刺激產(chǎn)生疼痛的動(dòng)物模型中，整個(gè)KOR表達(dá)明顯降低，但B和C變異體并未發(fā)生改變，因此說明變異體A的拼接與對(duì)神經(jīng)的傷害性疼痛反應(yīng)有關(guān)。有人使用噬菌體RNA-結(jié)合蛋白體MS2作為載體，與KORRNA溶和成MS2-結(jié)合RNA序列，可以觀察到3個(gè)5變異體在轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)纖維包括軸突的效率差別，

8、這一現(xiàn)象提示可能存在著某種調(diào)節(jié)機(jī)制控制著成熟的KORmRNA在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。如果KORmRNA變異體的轉(zhuǎn)運(yùn)過程不論是效率、位置或是時(shí)間上存在差異，那么蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能也就存在相應(yīng)的差別。下一步的研究就是要證實(shí)KORmRNA轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)受體產(chǎn)生怎樣的影響。除了受體基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之外，阿片受體的水平和活性還受到共價(jià)修飾的影響，即翻譯后受體水平的調(diào)控。阿片反應(yīng)的鈍化不是簡單地通過與G蛋白解耦聯(lián)或是受體脫敏過程實(shí)現(xiàn)的。激動(dòng)劑與阿片受體的結(jié)合激活蛋白激酶導(dǎo)致受體的快速磷酸化，包括G蛋白耦聯(lián)受體激酶（GRKs），同時(shí)也激活了細(xì)胞的抑制蛋白。抑制蛋白不僅參與了受體與G蛋白的解耦聯(lián)，而且涉及受體內(nèi)在化。在

9、這個(gè)受體內(nèi)吞的途徑中，受體內(nèi)在化是受體trafficking到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（如受體溶解的器官溶和體）的開始，從而也就發(fā)生了整個(gè)細(xì)胞水平的受體減少和受體下調(diào)。2、受體磷酸化、脫敏化和內(nèi)在化對(duì)于大多數(shù)GPCR來說，被配體激動(dòng)之后，會(huì)由G蛋白耦聯(lián)受體激酶(GRK)磷酸化，抑制蛋白與磷酸化的受體結(jié)合，使之與G蛋白異聚體解耦聯(lián)。此過程稱為脫敏。脫敏后的受體會(huì)通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿內(nèi)，或被降解，或者發(fā)生去磷酸化，重返胞膜(復(fù)敏化)，恢復(fù)細(xì)胞對(duì)激動(dòng)劑的敏感性。被激活的磷酸化受體與抑制蛋白結(jié)合可以誘發(fā)受體內(nèi)在化，從而減少細(xì)胞表面與配體結(jié)合的受體數(shù)目。受體后信號(hào)改變也可能造成阿片耐藥，已經(jīng)證實(shí)阿片藥物可以降低細(xì)胞的

10、cAMP水平。長時(shí)間阿片暴露誘發(fā)環(huán)化酶活性增強(qiáng)（環(huán)化酶超敏感），而環(huán)化酶超敏感可以造成阿片停藥期間神經(jīng)細(xì)胞的過度興奮。但是在體引起阿片耐藥的機(jī)制還不清楚。經(jīng)典的理論認(rèn)為受體脫敏化、內(nèi)在化和受體后調(diào)節(jié)是造成阿片耐藥的原因。對(duì)于DOR和MOR的研究表明阿片受體的磷酸化過程是由GRKs介導(dǎo)的，而不是蛋白激酶C。有報(bào)道嗎啡可以誘發(fā)CHO細(xì)胞MOR受體的磷酸化。而又有報(bào)道說嗎啡不能誘發(fā)HEK293細(xì)胞的MOR的磷酸化，如果HEK293細(xì)胞中GRK-2過度表達(dá)，就可以實(shí)現(xiàn)嗎啡誘導(dǎo)的磷酸化，說明嗎啡對(duì)于GRKs來說反應(yīng)性差。還有的研究者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用了cAMP依賴性蛋白激酶PKA后，嗎啡可以誘導(dǎo)磷酸化，這就提示嗎

11、啡是否誘導(dǎo)磷酸化取決于特異性的蛋白激酶水平。由于受體磷酸化與受體脫敏化具有相關(guān)性，阿片受體磷酸化的結(jié)果目前備受關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)SN-N-BE細(xì)胞內(nèi)的受體蛋白磷酸化與DOR的脫敏化有關(guān)，MOR磷酸化與脫敏化直接相關(guān)也有試驗(yàn)可以證實(shí)。當(dāng)抑制蛋白過度表達(dá)時(shí)會(huì)導(dǎo)致快速嗎啡誘導(dǎo)的受體脫敏化和內(nèi)在化。抑制蛋白敲除鼠的在體嗎啡耐受性被延遲，這是細(xì)胞中缺乏激動(dòng)劑誘導(dǎo)的受體脫敏化過程的結(jié)果。最近的研究顯示GPK3敲除鼠KOR激動(dòng)劑的耐受性減弱。我們可以認(rèn)為，阿片受體磷酸化過程阻斷了抑制蛋白受體，同時(shí)也鈍化了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)。 受體磷酸化在時(shí)間上是十分迅速的過程，因此它并不能代表阿片受體反應(yīng)的鈍化。而受體脫敏化卻

12、可以通過腺苷酸環(huán)化酶的抑制程度來測(cè)定。GPK和抑制蛋白過度表達(dá)時(shí)并不會(huì)增加受體脫敏化，嗎啡通常不會(huì)誘導(dǎo)受體磷酸化，還有大量數(shù)據(jù)也證實(shí)通過抑制蛋白使阿片信號(hào)傳導(dǎo)鈍化的過程并不一定發(fā)生受體磷酸化，這可能是由于激動(dòng)劑誘導(dǎo)的其他GPCRs的磷酸化過程增加了受體與抑制蛋白的親和力。即使沒有發(fā)生受體磷酸化，抑制蛋白也可以與激動(dòng)劑受體復(fù)合物相互作用。磷酸化作用位點(diǎn)DORSer344或DORSer363敲除后受體內(nèi)吞并未發(fā)生鈍化，這就說明了受體自身有能力激活抑制蛋白，而不需要磷酸化的過程。事實(shí)上，受體磷酸化只是增加抑制蛋白與受體的親和力。嗎啡作為常用的阿片藥物卻不產(chǎn)生受體脫敏化和內(nèi)在化。在表達(dá)有MOR的HEK

13、293細(xì)胞，除嗎啡外，DAMGO,metenkephalin，etorphin等均可誘發(fā)受體脫敏化。對(duì)天然表達(dá)阿片受體的海馬神經(jīng)元細(xì)胞使用DAMGO,methadone或嗎啡均可誘發(fā)受體脫敏化。這兩個(gè)試驗(yàn)說明嗎啡也可能誘發(fā)某些受體脫敏化，但比其他高效阿片藥物要差。同樣對(duì)于受體內(nèi)在化激動(dòng)劑效能也是重要的決定因素，嗎啡激動(dòng)受體內(nèi)在化的能力也比其他高效激動(dòng)劑要差。嗎啡不能激動(dòng)受體內(nèi)在化和脫敏化的原因是什么？Whistler等人認(rèn)為受體內(nèi)化是受體復(fù)敏化的重要途徑，內(nèi)在化的受體有兩個(gè)轉(zhuǎn)歸途徑：一是脫磷酸化返回漿膜重新表達(dá)；二是降解。嗎啡不能引起有效的受體內(nèi)在化，因此就不會(huì)有受體的重新表達(dá)，這可能是嗎啡耐

14、藥產(chǎn)生的原因之一。由于沒有有效的受體脫敏化和內(nèi)在化，作為補(bǔ)償性的受體后調(diào)節(jié)機(jī)制包括環(huán)化酶超敏化啟動(dòng)并對(duì)抗嗎啡的信號(hào)傳遞，這也是嗎啡耐藥形成的原因之一。3、選擇性耦聯(lián)阿片受體通常會(huì)與抑制性G蛋白耦聯(lián)，即屬于Go和Gi亞型。但是一些結(jié)果提示也有可能發(fā)生與Gs亞型的興奮性蛋白耦聯(lián)。大多數(shù)阿片藥物的作用呈雙向性，低劑量時(shí)會(huì)與興奮性G蛋白耦聯(lián)，二大劑量時(shí)與抑制性G蛋白耦聯(lián)。因此興奮性阿片效應(yīng)產(chǎn)生上調(diào)作用也可能時(shí)耐藥性產(chǎn)生的一個(gè)原因。4、抑制蛋白和PGS以往研究證實(shí)有多著因子參與了阿片鎮(zhèn)痛和耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制。cAMP依賴性蛋白激酶，蛋白激酶C，G蛋白耦聯(lián)受體激酶，鈣通道依賴性激酶等等均參與了阿片耐藥的產(chǎn)生

15、，但仍有大量未知因素。在眾多因素中抑制蛋白是最重要的因素之一。抑制蛋白敲除鼠的嗎啡鎮(zhèn)痛效能增強(qiáng)，作用時(shí)間延長，而且不會(huì)誘發(fā)耐藥性的產(chǎn)生。抑制蛋白在阿片鎮(zhèn)痛效應(yīng)和耐藥產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用，這已經(jīng)為大量試驗(yàn)所證實(shí)。抑制蛋白在體嗎啡耐藥中的作用機(jī)制很復(fù)雜。嗎啡引起阿片受體脫敏化和內(nèi)在化的作用較弱，這說明抑制蛋白在嗎啡耐藥形成中并不起只要作用。如果受體內(nèi)在化和受體循環(huán)是保證細(xì)胞膜上有效受體數(shù)量的主要方式，那么抑制蛋白缺乏就會(huì)誘發(fā)阿片耐藥。有人對(duì)野生鼠和抑制蛋白敲除鼠進(jìn)行了比較，后者嗎啡鎮(zhèn)痛作用增強(qiáng)，但etorpine，fentanyl等可以誘發(fā)鎮(zhèn)痛作用兩種鼠之間并無差別。同時(shí)作者還發(fā)現(xiàn)在體外試驗(yàn)中嗎

16、啡可以誘發(fā)抑制蛋白2的膜恢復(fù)，而不是抑制蛋白1。抑制蛋白1敲除鼠嗎啡鎮(zhèn)痛效果并不受影響。這些結(jié)果說明，不同的抑制蛋白參與了阿片受體的內(nèi)在化，而不同的阿片藥物產(chǎn)生的耐藥性過程有不同的抑制蛋白參與。同時(shí)這些結(jié)果也支持了是配體受體混合物而不是受體本身決定了啟動(dòng)何種細(xì)胞反應(yīng)的理論。目前研究還集中在近期發(fā)現(xiàn)的一種新的蛋白物質(zhì)G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白（PGS)。PGS蛋白是家族性細(xì)胞內(nèi)蛋白，它的主要功能是反向調(diào)節(jié)G蛋白與GTPase加速酶（GAP)反應(yīng)的活性。PGS蛋白可以特異性的與Gx亞基作用從而提高其內(nèi)源GTPase活性，加速GTP水解。因此促進(jìn)了Gx從GTP結(jié)合活性狀態(tài)轉(zhuǎn)為失活狀態(tài)。從本質(zhì)上說PGS蛋白的作用就是停止信號(hào)傳導(dǎo)，使受體和G蛋白復(fù)合體恢復(fù)到配體受體可結(jié)合的膜狀態(tài)。PGS蛋白在阿片耐藥中起到必不可少的作用。它不僅可以終止G蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)，而且在受體脫敏化、內(nèi)在化、循環(huán)