脆性組氨酸三聚體基因在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

1、脆性組氨酸三聚體基因在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義                  作者：張英懷, 王潔 , 董福生，谷建琦【摘要】  目的 探討脆性組氨酸三聚體基因在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義。方法 應(yīng)用免疫組化SP法檢測30例舌鱗狀細(xì)胞癌和12例正常舌粘膜鱗狀上皮組織中FHIT的表達(dá)情況。結(jié)果 舌鱗狀細(xì)胞癌組織中FHIT的陽性率（40.0%）顯著低于正常舌粘膜組織（75.0%）（P<0.05）。FHIT的

2、表達(dá)與年齡、性別無關(guān)(P>0.05)，而與分化程度相關(guān)，分化程度越低，F(xiàn)HIT的失表達(dá)越明顯(P<0.05)。結(jié)論 FHIT可能在舌癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 【關(guān)鍵詞】  脆性組氨酸三聚體；免疫組織化學(xué)；基因；舌癌    The Expression and Significance of FHIT in Squamous Cell Carcinoma of Tongue      Key words：Fragile histidine triad；Immunohistochemistry

3、；Gene； Tongue cancer       舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，其惡性程度高，預(yù)后差，發(fā)病機(jī)制仍不清楚。脆性組氨酸三聚體(Fragile histidine triad，F(xiàn)HIT)基因是1996年分離出來的新的候選抑癌基因。許多研究都表明FHIT基因的缺失與眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但FHIT和舌鱗狀細(xì)胞癌的關(guān)系等相關(guān)研究國內(nèi)鮮見報(bào)道，國外亦不多見。本研究采用免疫組化方法研究舌鱗狀細(xì)胞癌中FHIT的表達(dá)及意義，探討FHIT在舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生中的作用。    1 

4、 資料與方法    1.1  資料    收集河北醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院19912004年手術(shù)切除的舌鱗狀細(xì)胞癌石蠟包埋組織標(biāo)本30例。由2位高年病理醫(yī)師復(fù)查全部病例所有病理切片，按WHO標(biāo)準(zhǔn)核實(shí)診斷， 全部病例均為鱗狀細(xì)胞癌，高分化癌17 例，中分化癌7例，低分化癌6例。30例舌鱗狀細(xì)胞癌患者中男19例，女11例，年齡2879歲，平均年齡55.10歲；所有患者術(shù)前未經(jīng)放療及化療。    另外，取12例正常舌粘膜組織作為對照，其中男9例，女3例，年齡1967歲，平均年齡44.17歲。正常組織均取自

5、囊腫等良性腫瘤旁的正常舌粘膜，經(jīng)病理證實(shí)為正常鱗狀上皮組織。     1.2  試劑    兔抗人FHIT多克隆抗體濃縮液，使用濃度175, 二抗及SP免疫組化試劑盒，DAB顯色劑，多聚賴氨酸防脫片劑均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。    1.3  對照實(shí)驗(yàn)    用已知FHIT陽性的正常乳腺標(biāo)本作為陽性對照。以PBS代替一抗作為陰性對照。    1.4  實(shí)驗(yàn)方法    采用

6、免疫組織化學(xué)SP法（過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素法）。所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟重新包埋后，將每個(gè)蠟塊切為45m的切片，共切3張，1張F(tuán)HIT染色，1張HE染色，1張作為陰性對照。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；3%  H2O2甲醇振洗25min，微波抗原修復(fù)，9298×15min，正常山羊血清封閉，37孵育30min，滴加一抗，4過夜；滴加生物素化二抗。以上步驟均嚴(yán)格按照試劑盒要求操作。    1.5  結(jié)果判定    FHIT陽性結(jié)果判定： 以細(xì)胞核或漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性， 結(jié)果評定參照Van Hee

7、rden1標(biāo)準(zhǔn)， 采用半定量積分法， 即對每張切片的染色強(qiáng)度和染色范圍分別進(jìn)行分級計(jì)分， 然后根據(jù)二者之積確定其陽性強(qiáng)度。 染色強(qiáng)度為無染色或弱染色計(jì)為1分， 中等強(qiáng)度計(jì)為2分， 強(qiáng)染色計(jì)為3分； 染色范圍以陽性細(xì)胞率計(jì)分： 10%為1分， 10%50%為2分， 50%為3分。 二者得分計(jì)為19， 3分為不表達(dá)或弱表達(dá)（）， 3分為中等或高表達(dá)（+）。    1.6  統(tǒng)計(jì)分析    用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，免疫組化結(jié)果用2檢驗(yàn)，出現(xiàn)小值頻數(shù)時(shí)，采用Fisher精確概率法。P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 

8、   2  結(jié)果    2.1  FHIT蛋白在正常舌粘膜組織和舌鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)    在正常舌粘膜組織中，F(xiàn)HIT蛋白的表達(dá)主要位于基底細(xì)胞層和棘層，也有少部分粒層出現(xiàn)FHIT蛋白的表達(dá)，呈棕黃色顆粒染色，且大多為強(qiáng)陽性染色，陽性細(xì)胞以上皮基底層較為密集，細(xì)胞核和細(xì)胞漿均有著色。在舌癌組織中FHIT蛋白的表達(dá)主要位于癌細(xì)胞的胞漿，呈黃色顆粒染色。    FHIT蛋白在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中的中等及高表達(dá)率為40.0%，明顯低于對照組正常舌粘膜鱗狀上皮組織（75

9、.0%，P<0.05），見表1。    2.2  FHIT蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系    FHIT蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡無明顯的相關(guān)性（P>0.05），而與腫瘤的分化程度相關(guān)，分化程度越低，F(xiàn)HIT蛋白的表達(dá)缺失越明顯（P<0.05），見表2。表1  FHIT蛋白在正常舌粘膜組織表2  舌鱗狀細(xì)胞癌FHIT蛋白的表達(dá)    3  討論    FHIT是1996年Ohta等用外顯子捕獲方法獲得的新的候選抑癌

10、基因，定位于染色體3p14.2，因其含有脆性位點(diǎn)FRA3B，具有不穩(wěn)定性，故命名為脆性組氨酸三聚體。它是組氨酸三聚體基因家族的成員之一，含有10個(gè)外顯子，其中外顯子59組成開放閱讀框架（ORF），編碼147個(gè)氨基酸16.8KD的蛋白。FHIT蛋白是一種典型的二腺苷三磷酸(Ap3A)水解酶，可水解ApnA(n=36)成為ADP和AMP，Mn2+和Mg2+可刺激其活性，而Zn2+可抑制其活性。許多研究表明，在生理狀態(tài)下，F(xiàn)HIT基因存在于大多數(shù)正常組織，而在多種腫瘤組織中如頭頸癌、食管癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等都有不同程度的減少甚至缺失，并發(fā)現(xiàn)與FHIT基因轉(zhuǎn)錄及缺失有關(guān)，包括等位基因的缺失

11、、基因重排以及細(xì)胞基因的異常。有學(xué)者認(rèn)為在人上皮性癌細(xì)胞中普遍存在FHIT基因雜合子和/或純合子的缺失2。FHIT基因失活尤其發(fā)生在那些暴露于致癌環(huán)境而形成的上皮性來源的腫瘤中。本研究發(fā)現(xiàn)FHIT蛋白在正常舌粘膜的陽性表達(dá)率為75.0%，而且多為強(qiáng)陽性。在舌鱗狀細(xì)胞癌中有60.0%存在FHIT蛋白的減少或缺失，這與以往口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究結(jié)果基本一致3?7。     有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HIT基因的低表達(dá)隨著腫瘤分化程度的降低和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有增強(qiáng)趨勢。也有研究表明，F(xiàn)HIT的表達(dá)與組織學(xué)分級及腫瘤的增殖活性成負(fù)相關(guān)，并且FHIT表達(dá)丟失的患者趨向于不良預(yù)后，即與短期生存率

12、有關(guān)8。Lee等3對41例舌鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本的研究顯示28例出現(xiàn)FHIT表達(dá)缺失（68%），而且FHIT表達(dá)缺失與疾病自然存活時(shí)間的長短呈顯著相關(guān)性，與腫瘤大小和疾病所處階段有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)FHIT的失表達(dá)與舌鱗狀細(xì)胞癌的病理學(xué)分級具有相關(guān)性(P0.05),而與患者的年齡、性別無關(guān)。    本研究還發(fā)現(xiàn)，在正常舌粘膜組織中，F(xiàn)HIT蛋白表達(dá)于基底細(xì)胞和棘層細(xì)胞，而角化層及粒層基本無表達(dá)，這與 Van Heerden1 的初次研究結(jié)論不太一致。但后來該作者同樣用免疫組化的方法以三種不同來源的FHIT抗體對正?？谇徽衬そM織的表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用Zymed GST?F

13、HIT時(shí)在基底細(xì)胞和基底旁細(xì)胞強(qiáng)染色7，這與我們的研究結(jié)果一致，而KCC GST?FHIT則相反。說明用不同來源的抗體，F(xiàn)HIT蛋白的表達(dá)部位可能會有所不同，但在正?？谇徽衬ぃòㄉ嗾衬ぃ┑膹?qiáng)陽性表達(dá)卻都是一致的。    本研究中還有少數(shù)幾例正常舌粘膜出現(xiàn)FHIT蛋白的減少甚至缺失，可能與該基因的不穩(wěn)定性及多態(tài)性有關(guān)，它們是否具備正常功能，目前還不清楚，有待于進(jìn)一步探討。    關(guān)于FHIT的抑癌機(jī)制，可能以FHIT蛋白與其相互作用蛋白的結(jié)合為主，而以水解酶的作用次之9?11。FHIT在腫瘤發(fā)生中的作用尚不十分清楚，可能因其失活引起A

14、p3A或類似復(fù)合物在體內(nèi)的積累，刺激DNA聚合酶?緩銑?DNA，使細(xì)胞通過細(xì)胞周期G1期控制點(diǎn)，進(jìn)入S期，也可能因其失活后細(xì)胞對外界應(yīng)激能力下降而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。    綜上所述，F(xiàn)HIT基因的改變可能在舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)HIT的失表達(dá)可能是診斷舌鱗狀細(xì)胞癌和判斷其預(yù)后的一個(gè)有用指標(biāo)。但FHIT在舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生中的機(jī)制及與其他諸多基因改變的復(fù)雜關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】  1 Van Heerden WF, Swart TJ, Van Heerden MB, et al. Immunohistochemical evalua

15、tion of FHIT protein expression in oral squamous cell carcinomaJ. Oral Pathol Med, 1999, 28(10):433?437 Roce CM, Sozzi G, Huebner K. Role of FHIT in human cancerJ. J Clin Oncology, 1999, 117(5): 1618?1624 Lee JI, Soria JC, Hassan K, et al. Loss of FHIT expression is a predictor of poor outcome in to

16、ngue cancerJ. Cancer Res, 2001, 61(3):837?841 Tanimoto K, Hayashi S, Tsuchiya E, et al. Abnormalities of the FHIT gene in human oral carcinogenesisJ. British J Can, 2000, 82(4):838?843 Uzawa N, Akanuma D, Negishi A, et al. Homozygous deletions on the short arm of chromosome 3 in human oral squamous

17、cell carcinomasJ. Oral Oncol, 2001, 37(4):351?356 Chang KW, Kao SY, Tzeng RJ, et al. Multiple molecular alterations of FHIT in betel?associated oral carcinomaJ. J Pathol, 2002, 196(3):300?306 Van Heerden WF, Swart TJ, Van Heerden MB, et al. FHIT protein expression in oral epithelium: immunohistochem

18、ical evaluation of three antiseraJ. Anticancer Res, 2001, 21(4A):2419?2423 Yang Q, Yoshimura G, Suzuma T, et al. Clinicopathological significance of fragile histidine transcription protein expression in breast carcinomaJ. Clin Cancer Res, 2001, 7(12):3869?3873 Negrini M, Monaco C, Vorechovsky I, et al. The FHIT gene at 3p14.2 is abnormal in breast carcinomasJ. Cancer Res, 1996, 56:3173?3179Siprashvili Z, Sozzi G, Ra