Survivin基因在NB4細(xì)胞株細(xì)胞和急性早幼粒細(xì)胞白血病

1、Survivin基因在NB4細(xì)胞株細(xì)胞和急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞表達(dá)及其抗凋亡作用與臨床意義Survivin基因在NB4細(xì)胞株細(xì)胞和急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞表達(dá)及其抗凋亡作用與臨床意義2008-5-9 11:54:15 【摘要】 為了檢測survivin基因在APL細(xì)胞中的表達(dá)率并探討其表達(dá)與臨床的相關(guān)性，本研究采用RT-PCR方法檢測PML/RAR和survivin mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示：NB4細(xì)胞經(jīng)過ATRA處理后，survivin mRNA表達(dá)隨著時(shí)間的延長而逐漸下降，在72小時(shí)幾乎檢測不到survivin mRNA表達(dá)。36例初發(fā)、復(fù)發(fā)APL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞均有PML/RAR融合基

2、因表達(dá)，其中survivin mRNA陽性表達(dá)24例(占67%)，陰性表達(dá)12例(占33%)；22例緩解期APL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞PML/RAR融合基因表達(dá)均為陰性，其中survivin mRNA陽性表達(dá)8例（占36%），陰性表達(dá)14例（占64%）；初發(fā)、復(fù)發(fā)組、PML/RAR基因長型陽性組與緩解組相比，survivin mRNA表達(dá)陽性率均明顯增高（兩者P值均0.05），而與急性白血病組相比survivin mRNA表達(dá)陽性率均明顯減低（兩者P值分別0.05，0.001）。36例初發(fā)、復(fù)發(fā)APL 患者，無論survivin mRNA表達(dá)陽性或陰性，用ATRA治療都能達(dá)到完全緩解；臨床上并發(fā)D

3、IC和嚴(yán)重感染的4例APL患者的survivin mRNA表達(dá)皆為陽性（其中1例死亡），而survivin mRNA表達(dá)陰性患者臨床癥狀均較輕，只有輕微的皮膚粘膜出血、發(fā)熱和乏力等癥狀。2例APL患者經(jīng)用ATRA治療后外周血象以及骨髓象誘導(dǎo)分化癥象不明顯者，其survivin mRNA表達(dá)均為陽性。結(jié)論：APL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞survivin基因陽性表達(dá)率較其它類型急性白血病明顯減低，survivin基因表達(dá)與臨床有一定的相關(guān)性。 【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞株Expression of Survivin Gene in NB4 Cell Line and Cells of Acute Promyelo

4、cytic Leukemia and Its Anti-apoptosis and Clinical SignificanceAbstract The study was aimed to detect expression rate of survivin gene in APL cell and to explore the relationship between its expression and clinical manifestation.PML/RAR and survivin mRNA expression were analyzed by using reverse tra

5、nscriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)technique.The results showed：(1) the survivin gene expression was detected in NB4 cell line.By treatment with ATRA，survivin mRNA expression in NB4 cell gradually decreased along with time delay and almost could not be detected at the 72th hour.(2) the posi

6、tive and negative rate of survivin mRNA expression was 67% and 33% respectively，while in all 36 cases of de novo and relapse APL patients，the PML/RAR fusion gene expression was positive.In 22 cases at remission stage，the PML/RAR fusion gene expression was negative，and the positive and negative rate

7、of survivin mRNA expression was 36% and 64% respectively.The survivin mRNA expression positive rates in the de novo group，relapse group and PML/RAR fusion gene L-type positive group were obviously higher than those in remission period group (P0.05) and were significantly lower than those in acute le

8、ukemia group (P0.05，0.001).(3) whether the survivin mRNA expression was positive or negative in 36 cases of de novo and relapse APL patients，all the 36 cases could obtain complete remission.4 APL patients with positive expression of survivin mRNA had DIC and serious infection (one patient died).The

9、clinical symptom showed slight skin or mucosa bleeding，fever and asthenic in the patients with negative expression of survivin mRNA.When 2 APL patients with positive expression of survivin mRNA had been treated with ATRA，induction differentiation sign in their peripheral blood and bone marrow figure

10、s was not obvious.It is concluded that the survivin gene positive expression rate is lower in acute promyelocytic leukemia than that in any other types of leukemia and is related to clinical manifestation.Key words cell strains，NB4；survivin；PML/RAR fusion gene；acute promyelocytic leukemia 急性早幼粒細(xì)胞性白血

11、病（acute promyelocytic leukemia，APL）是一種特殊類型的白血病，它具有特征性染色體和融合基因改變，對全反式維甲酸（ATRA）和三氧化二砷（As2O3）有極佳治療反應(yīng)，APL患者預(yù)后相對較好。前期的研究工作顯示：在50例急性白血病患者中有41例survivin mRNA表達(dá)陽性（陽性率為82.0%），5例APL患者中只有1例survivin mRNA表達(dá)陽性，4例陰性表達(dá)患者經(jīng)ATRA治療后有3例得到骨髓緩解（BMR），而陽性表達(dá)的1例患者早期因出血死亡。因此設(shè)想，在survivin基因轉(zhuǎn)錄水平上，APL與其它類型白血病是否具有明顯的差異？上述研究結(jié)果是否意味著AP

12、L細(xì)胞與其它類型白血病細(xì)胞有不同的生物學(xué)特征？為了弄清楚這些問題，我們進(jìn)一步檢測了NB4細(xì)胞株和APL患者白血病細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)情況，現(xiàn)報(bào)道如下。材料和方法NB4細(xì)胞株將急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株NB4置于RPMI 1640全培養(yǎng)液中（含10新生小牛血清），37、5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換液1次。以105/ml NB4細(xì)胞密度培養(yǎng)在6孔板中，每孔加入ATRA，終濃度為1 mol/L，分別于24、48、72小時(shí)收獲細(xì)胞，并檢測survivin mRNA表達(dá)。病例本院門診和住院初發(fā)及復(fù)發(fā)急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）36例（初發(fā)34例，復(fù)發(fā)2例），男17例，女19例，年

13、齡9-72歲，中位年齡40.5歲。APL緩解期患者22例，男10例，女12例，年齡3-57歲，中位年齡30歲，緩解期時(shí)間為1-72個(gè)月，中位緩解期37個(gè)月。按MICM分型標(biāo)準(zhǔn)，其中M3a 20例，M3b 16例。治療方案：初診患者均采用ATRA誘導(dǎo)治療，待外周血白細(xì)胞數(shù)上升后加用HA（高三尖杉酯堿+阿糖胞苷），復(fù)發(fā)和不能耐受ATRA患者用As2O3治療30-40天，以骨髓緩解率（BMR）作為療效判斷指標(biāo)。 急性白血病組（AL）23例(包括M1 3例，M2 6例，M4-5 2例，ALL-L1 4例，ALL-L2 8例)，其中，男16例，女7例，年齡20-64歲，患者的中位年齡42歲。標(biāo)本處理無菌

14、操作取肝素抗凝骨髓液3 ml，用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，白血病細(xì)胞的比例大于46%，臺盼藍(lán)拒染率大于99%，取約2106個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加TRIzoL（Gibco公司）1 ml，混勻后，-80保存，待提取RNA。PML/RAR融合基因的RT-PCR檢測具體操作見參考文獻(xiàn)。Survivin mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測總RNA提取取2106個(gè)細(xì)胞，用TRIzoL試劑盒（Gibco，USA）一步法（按試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行），提取細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)定量，要求OD260/OD2801.7。引物設(shè)計(jì)4組引物由上海生工生物有限公司合成。其序列、擴(kuò)增產(chǎn)物和循環(huán)條件見表1。Ta

15、ble 1.The RT-PCR amplification condition of survivin and -actin gene（略）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)反應(yīng)體積為25 l，取樣品總RNA 2 g，oliga(T)18 0.5 g，70，5分鐘后立即放入冰中并離心。然后依次加入M-MLV5逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5 l，10 mmol/L dNTPmix1.25 l，RNasin 25 U，M-MLVRT 200 U (Promega公司)，最3 Survivin基因在NB4細(xì)胞株細(xì)胞和急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞表達(dá)及其抗凋亡作用與臨床意義2008-5-9 11:54:15 后用經(jīng)DEPC處理過的去離子水補(bǔ)

16、至25 l，42，60分鐘。70，15分鐘終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)反應(yīng)體系包括：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物2 l，20 pmol/L上游及下游引物各1 l，10 mmol/L dNTP 0.5 l，10PCR buffer 2.5 l，25 mmol/L MgCl2 1.5 l，Taq DNA合酶2 U，用滅菌去離子水補(bǔ)至終體積數(shù)為25 l。1.5瓊脂糖凝膠電泳電場強(qiáng)度5 V/cm，電泳30-60分鐘，紫外燈下觀察，用凝膠成像系統(tǒng)掃描照片。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)比較用2檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 10.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，以P0.05為差異具有顯著性意義。結(jié)果ATRA誘導(dǎo)分化后NB4細(xì)胞survivi

17、n mRNA表達(dá)從附圖中可以看出，NB4細(xì)胞經(jīng)過1 mol/L ATRA處理后，survivin mRNA表達(dá)隨著時(shí)間的延長而逐漸下降，在72小時(shí)幾乎檢測不到survivin mRNA的表達(dá)。初發(fā)復(fù)發(fā)和緩解期APL患者survivin mRNA表達(dá)36例APL患者均有PML/RAR 融合基因的表達(dá)，其中survivin mRNA陽性表達(dá)24例(67%)，陰性表達(dá)12例(33%)；22例緩解期APL患者PML/RAR基因表達(dá)均為陰性，其中survivin mRNA陽性表達(dá)8例（36%），陰性表達(dá)14例（64%）；急性白血病組23例，survivin mRNA陽性表達(dá)21例（91%），陰性表達(dá)只有

18、2例(9%)。初發(fā)、復(fù)發(fā)組，PML/RAR基因長型陽性組與緩解組相比，survivin mRNA表達(dá)陽性率均明顯增高（兩者P值均0.05），而與急性白血病組相比survivin mRNA表達(dá)陽性率均明顯減低（兩者P值分別0.05，0.001），詳見表2。Table 2.Results of survivin mRNA expression in de novo，relapse and remission APL（略）APL患者survivin mRNA表達(dá)動態(tài)檢測APL初發(fā)患者survivin mRNA表達(dá)陰性有12例，對其中4例初發(fā)患者連續(xù)動態(tài)觀察了survivin和PML/RAR基因表達(dá)，

19、結(jié)果顯示：在18個(gè)月的動態(tài)觀察中，4例患者PML/RAR融合基因轉(zhuǎn)陰后沒再轉(zhuǎn)陽，而survivin mRNA表達(dá)與PML/RAR基因表達(dá)之間沒有明顯的相關(guān)性，結(jié)果見表3。Table 3.Change of survivin/PML-RAR gene in APL（略）APL患者survivin mRNA表達(dá)與臨床的關(guān)系36例初發(fā)、復(fù)發(fā)APL 患者，無論survivin mRNA表達(dá)陽性抑或陰性，用ATRA治療都能達(dá)到完全緩解。臨床上并發(fā)DIC和嚴(yán)重感染的4例APL患者的survivin mRNA表達(dá)皆為陽性（其中1例死亡），而survivin mRNA表達(dá)陰性患者的臨床癥狀均較輕，只有輕微的皮

20、膚粘膜出血、發(fā)熱和乏力等癥狀。2例APL患者經(jīng)用ATRA治療后外周血象及骨髓象誘導(dǎo)分化癥象不明顯者其survivin mRNA表達(dá)均為陽性。討 論Survivin是細(xì)胞凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAP）家族成員之一，它的結(jié)構(gòu)最簡單，只有1個(gè)桿狀病毒IAP重復(fù)子（baculoviral IAP repeat，BIR）結(jié)構(gòu)，沒有鋅指環(huán)結(jié)構(gòu)。Survivin基因由1 619個(gè)堿基對組成，編碼含有142個(gè)氨基酸，分子量為16 500 kD的胞漿蛋白3。Survivin基因定位于17q25。其組織分布具有明顯的特征性，除胸腺和生殖腺之外，在正常分化成熟

21、的組織細(xì)胞，如正常外周血細(xì)胞，骨髓細(xì)胞中不表達(dá)；而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化或者細(xì)胞惡變時(shí)又重新獲得表達(dá)。它在胚胎組織和組織發(fā)育生長過程中表達(dá)，在大多數(shù)腫瘤組織內(nèi)有廣泛的表達(dá)。 林茂芳等報(bào)道，4/5例APL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞survivin陰性表達(dá)，且臨床癥狀較輕，而1例survivin mRNA陽性表達(dá)患者的臨床癥狀較重，最后死于DIC，是否提示M3患者細(xì)胞生物學(xué)行為有什么獨(dú)特之處，故值得積累更多資料并深入研究。 首先，我們檢測了急性白血?。ú话ˋPL）患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的survivin mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，23例AL患者中有21例survivin mRNA表達(dá)陽性，陽性表達(dá)率為91，Carte

22、r等4研究發(fā)現(xiàn)，88.9急性髓細(xì)胞性白血病（AML）中可檢測到suvivin mRNA表達(dá)，我們的結(jié)果與之相近。 急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）是較獨(dú)特的一種類型，經(jīng)ATRA誘導(dǎo)分化治療，其緩解率高達(dá)90%，緩解后以ATRA及（或）HA方案等鞏固治療，其長期生存率都較高，即使復(fù)發(fā)，以三氧化二砷治療，再次緩解率仍可達(dá)90%左右。為什么會出現(xiàn)這樣的效果呢？是否與survivin基因表達(dá)弱或不表達(dá)有關(guān)系呢？由于APL病例數(shù)太少，故多位研究者僅發(fā)現(xiàn)有這種現(xiàn)象存在，究竟survivin基因在APL細(xì)胞中的表達(dá)情況如何？迄今，尚未見有關(guān)APL與survivin基因表達(dá)關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究對36例初發(fā)、復(fù)

23、發(fā)APL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞survivin基因表達(dá)作了進(jìn)一步研究，并以其它類型急性白血病作為對照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APL初發(fā)、復(fù)發(fā)組survivin mRNA表達(dá)陽性率明顯減低（67 vs 91，P=0.03），在APL緩解組survivin mRNA表達(dá)陽性率進(jìn)一步明顯地降低（67 vs 36%，P=0.03），22例APL緩解期患者中有8例（36）survivin mRNA表達(dá)陽性。既然survivin基因在腫瘤組織中有廣泛的表達(dá)，而在正常組織中幾乎沒有表達(dá)，那么survivin mRNA陽性表達(dá)能否作為腫瘤標(biāo)志物用于微小殘留病變的檢測呢？我們對4例survivin mRNA陰性表達(dá)的APL

24、初發(fā)、復(fù)發(fā)患者進(jìn)行18個(gè)月動態(tài)觀察，結(jié)果顯示4例APL患者PML/RAR融合基因轉(zhuǎn)陰后一直持續(xù)陰性，而survivin mRNA表達(dá)有時(shí)為陽性有時(shí)為陰性，沒有什么規(guī)律可循，與PML/RAR融合基因表達(dá)沒有明顯的相關(guān)性，這可能是因?yàn)椴±龜?shù)較少或觀察時(shí)間較短的緣故。 Survivin基因在腫瘤組織中表達(dá)與臨床預(yù)后有相關(guān)性，已為許多研究結(jié)果予以證實(shí)。Adida等5采用免疫熒光法檢測了初診急性髓細(xì)胞性白血病患者（AML）骨髓和外周血細(xì)胞survivin表達(dá)，結(jié)果顯示，125例AML中75例白血病細(xì)胞有survivin表達(dá)（60%）；陽性表達(dá)病人與陰性表達(dá)病人相比，完全緩解率與總生存率之間沒有明顯的差別

25、，然而，survivin陽性表達(dá)是獨(dú)立的預(yù)后不良因素，此類病人的生存率下降。在對播散性大B細(xì)胞淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，60患者細(xì)胞呈陽性表達(dá)6，且survivin表達(dá)陽性患者5年總生存率比survivin陰性表達(dá)患者明顯減低，與國際預(yù)后指數(shù)(IPI)一起作多參數(shù)分析，除乳酸脫氫酶（LDH）、病理分期和ECOG之外，survivin是又一獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。我們隨訪了36例APL初發(fā)、復(fù)發(fā)和22例緩解期患者，目前無1例死亡，但隨訪時(shí)間最長也只有3年多，故無法觀察到survivin mRNA表達(dá)與臨床預(yù)后之間的關(guān)系。 我們已有實(shí)驗(yàn)顯示，survivin基因在多種血液腫瘤細(xì)胞株中皆表達(dá)7，其中NB4細(xì)胞也為

26、陽性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)中用ATRA誘導(dǎo)分化處理NB4細(xì)胞株，其survivin mRNA表達(dá)隨著時(shí)間的延長而逐漸下降，在72小時(shí)幾乎檢測不到survivin mRNA表達(dá)。Carter等4，用ATRA誘導(dǎo)血液腫瘤細(xì)胞株分化（其中包括NB4細(xì)胞株），發(fā)現(xiàn)survivin基因蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)，同時(shí)可見細(xì)胞周期阻滯以及向粒/單細(xì)胞分化現(xiàn)象，如用GM-CSF和G-CSF刺激細(xì)胞增殖，則survivin表達(dá)上調(diào)。這些實(shí)驗(yàn)提示，細(xì)胞分化程度不同，survivin基因表達(dá)也不同，如能使腫瘤細(xì)胞向成熟階段分化，則survivin mRNA表達(dá)就有可能下調(diào)。APL細(xì)胞較其它類型白血病細(xì)胞分化程度要高，故survivin

27、 mRNA表達(dá)也就低。已有學(xué)者臨床實(shí)驗(yàn)顯示，在AML化療前使用ATRA可以增加化療藥物敏感性并提高急性白血病的完全緩解率8。APL細(xì)胞較其它類型白血病細(xì)胞分化程度要高可能是其survivin mRNA表達(dá)低的原因之一。 Survivin基因表達(dá)另一特征是具有明顯的細(xì)胞周期依賴性，它在G2/M期表達(dá)量最高。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：survivin在增殖期細(xì)胞中高表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G1期時(shí)survivin表達(dá)快速下調(diào)，用藥物分別將HeLa細(xì)胞阻滯于G1期，S期和G2/M期，并檢測處于這些期時(shí)細(xì)胞株的survivin mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處于G1期細(xì)胞無survivin mRNA表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞處于S期時(shí)s

28、urvivin mRNA表達(dá)增加了6.2倍，而到了G2/M期時(shí)細(xì)胞survivin mRNA則上調(diào)了40倍9，這說明survivin基因是與細(xì)胞周期相關(guān)聯(lián)的一個(gè)基因。急性白血病是一種異質(zhì)性很強(qiáng)的疾病，其細(xì)胞周期分布存在著明顯的差異，故可用細(xì)胞周期解釋survivin基因在不同細(xì)胞株細(xì)胞和患者中的表達(dá)差異性。在APL緩解期患者和PML/RAR融合基因已轉(zhuǎn)為陰性的患者中，survivin mRNA表達(dá)有的仍為陽性，這說明此基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性，抗凋亡功能只是它的許多功能之一。致謝：感謝血研所王云貴和梁毅老師對實(shí)驗(yàn)的多方面幫助【參考文獻(xiàn)】 1 林茂芳，孟小莉，蔡真等.抗凋亡基因survivin在急性白白血病細(xì)胞表達(dá)及其臨床意義.中華血液學(xué)雜志，2002; 23：251-2532 陳賽娟，蔡敬仁，李秀松等.用逆轉(zhuǎn)錄酶/多聚合酶鏈反應(yīng)檢測早幼粒白血病PML-RAR融合基因.中華血液學(xué)雜志，1993; 14:3-53 Ambrosini G，Adida C，Sirugo G，et al. Induction of apoptosis and inhibition of cell proliferation by survivin gene targetin